发酵产品可行性报告

1、课题名称：紫杉醇发醉产品的可行性报告姓名：专业班级：学号：紫杉醇发酯产品可行性报告摘要：紫杉醇是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一，在临床上广泛应用, 但受原料红豆杉木短缺的制约，存在巨大的供需差距。目前，人们主要进行的是 从红豆杉树中提取、分离和纯化紫杉醇的研究。然而研究表明红豆杉各个部位的 紫杉醇含量均甚微，且红豆杉树又是生长缓慢、散生、濒危的珍惜保护植物。本 文研究了微生物（内生真菌）发酵法在紫杉醇现代生产中的应用 （包括内生真菌 的分离纯化，紫杉醇的制取），该方法有效地为产生紫杉醇药物开辟了新的途径， 其应用前景十分广阔；而且对于植物来源的天然药物的新生产途径的开发及濒危 药用植物的

2、保护具有十分重要的经济及生态效益。关键词：紫杉醇，微生物发酵，内生真菌，分离纯化一、紫杉醇的研究意义：紫杉醇（PacHtaxel ,商品名Taxol）是一种二菇类衍生物，是当前公认的广 谱、活性强的抗癌药物之一 1。紫杉醇最早是Wan等2于1971年从短枝红豆杉 （Taxusbreviifolia） 树皮中分离得到的。随后，Schif等3证实紫杉醇具有独特 的抗癌机制。随着紫杉醇的临床应用，对其研究也逐渐深入，其主要抗癌机制为 抑制月中瘤细胞的微管（Microtubules）合成，以阻断细胞分裂，致使月中瘤体积逐渐 缩小；紫杉醇还可诱导细胞凋亡，另外还有类似脂多糖（LPS）的作用，可调节机体的

3、免疫功能4。目前国际市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取及半合成， 迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道。紫杉醇的工业生产受到了原料和技术两方面的制约，短期内难以突破 5。为了解决红豆杉资源短 缺与紫杉醇需求量的日益增加的矛盾，人们对生产紫杉醇进行了多方面的研究， 包括化学全合成、红豆杉细胞培养及微生物发酵。微生物发酵法生产紫杉醇因具 有明显优势，其研究和开发越来越受到国内外研究学者的广泛关注。二、目前生产紫杉醇的几种主要方法：紫杉醇的生产方法主要是提取分离和化学合成，提取分离的方法按来源不 同又可分为三大类：从植物中分离提取、从真菌中分离提取及从培养细胞中分离 提取.1 .化

4、学合成法化学合成是生产药物的一条重要途径，许多天然药物 （如一些抗生素）除了 可从生物体内提取外，还可通过化学的方法合成.紫杉醇的药效被发现以来，其 化学合成的方法一直受到重视并得到很多的研究探索.迄今为止，在生产上有价值的紫杉醇的全合成尚未取得成功.紫杉醇的半合成法的问题主要在于：（1）合成原料在植物中含量不高，提取分离成本较高.（2）每一步反应得率低，而且有 时会碰到选择性较差的问题.所以，无论是全合成还是半合成，即使目前都取得 了成功，但都难以应用于大规模的工业化生产.2 .直接从红豆杉科植物中分离提取紫杉醇含量与种、部位、生长年限、生长环境等因素有关.在所有红豆杉 中短叶红豆杉中紫杉醇

5、含量最高；从生长时间上看，生长时间越长的器官或组织 紫杉醇含量越高；从生长环境上看，生长在阴处的树皮比暴露在日光下的高； 就 部位来看，一般树皮中紫杉醇含量较高，短叶红豆杉树皮中紫杉醇含量可达 0. 069 .据估算，从2 0003 000棵稀有的紫杉树皮中只能提取1kg紫杉醇，而 对1例病人制备充足的药物需34棵百年的老红豆杉树6.自紫杉醇药效发现以 来，红豆杉资源遭到毁灭性开发，有些种系濒临灭绝.3利用红豆杉细胞培养生产紫杉醇大规模地培养微生物细胞实现了许多种抗生素的大量生产，极好地满足了 病人对抗生素的需求，挽救了无数人的生命.抗生素是微生物的次生代谢产物， 紫杉醇是植物细胞的次生代谢产

6、物，能否通过大规模的植物细胞培养大量获取紫 杉醇很有研究价值。目前未能实现工业化生产，这主要是因为：植物细胞生长慢， 紫杉醇含量低，使得单位时间单位质量细胞紫杉醇含量较低，即使在理论上工业化生产也不能取得经济效益。4从紫杉醇内生真菌中发酵制取与过去从红豆杉植物的树皮中提取紫杉醇相比，内生真菌生产紫杉醇具有更大的优势，真菌不仅能在简单的培养基上良好生长， 产生大量的发酵产物，发 酵周期短，还可以在生物反应器中人为控制各种参数， 并可通过诱变育种等手段 来提高菌种性能以提高紫杉醇产量， 所以大规模工业生产容易实现，其应用前景 十分广阔；而且对于植物来源的天然药物的新生产途径的开发及濒危药用植物的

7、保护具有十分重要的经济及生态效益，这样就为无限而有效地产生紫杉醇药物开 辟了新的途径。利用微生物发酵生产紫杉醇的优点：无论是从生态还是经济条件的角度来 看，利用植物内生真菌作为药源是一项不会枯竭的资源，微生物发酵的方法具有以下优点：（1）微生物作为工业生产的源泉，可以在发酵罐中进行，可以源源 不尽的进行生产；（2）微生物发酵的方法容易扩大化，利于工业化生产；（3） 微生物的生长仅仅需要一般的培养技术， 在收集紫杉醇之前，可以通过改善培养 环境、改进技术来提高产量；（4）微生物易于通过基因工程等方法筛选高产菌 株，提高紫杉醇的产量；（5）内生真菌生长迅速，易于培养，应用的培养基相 对比较便宜；（

8、6）可望满足市场的需求，降低紫杉醇的价格。植物内生真菌是 一类应用前景广阔的资源微生物，用微生物发酵的方法生产紫杉醇，是解决药源 问题的有效途径。三、紫杉醇的生产工艺1 .内生真菌分离：从植物体内分离内生真菌的关键一步是对植物组织表面进行消毒，以控制表生真菌的生长，使内生真菌得以分离。目前常用次氯酸钠作为消毒剂7,其分离方法是先用水冲洗植物材料，然后在 75%乙醇中浸泡50s后，在4%次氯酸 钠水溶液浸泡0. 5h,然后在75%酒精中再浸泡30s,最后用无菌水冲洗。一般分 离所用的培养基为PDA&养基。为了防止细菌污染可在培养基中加抗菌素，如链 霉素、四环素等。一般20c25C培养一个

9、月左右，即可形成内生真菌菌落。2 .发酵培养：从PD所板上切取5 m储5 mml、块菌落，接种至装有150 mlM体培养基的500mLE角瓶中，于28c , 100 r/min摇床上振荡培养1014 d3 .紫杉醇的提取分离：真菌培养物首先要进行预处理，然后进行紫杉醇的提取。主要提取方法是 用有机溶剂萃取。马天有等8的方法是，将培养物冷冻后用转速为lO000r/min 组织捣碎机匀浆3min,用4层纱布过滤，滤液中加入等体积的氯仿和甲醇混合液 (10: 1,V/V),充分振荡后静置8h12h,收集有机溶液相，并在45c条件下减 压蒸发，残留物溶于1m炉醇中作为样品溶液备用。周东坡等人9对发酵产

10、物萃 取的方法是：收集培养物先经3 O00r/min离心15min,并将沉淀物捣碎后重新与 上清液混合，再经3500r/min离心12min,保留上清液，用等体积的氯仿与甲醇 混合液(10: 1, V/V)萃取，收集有机相后置3OC下鼓风干燥，将蒸发后的萃 取物溶于少量的氯仿中保存。后来又进行了改进，即发酵液过滤后，滤渣烘干(低 于5OC),滤液称量体积。滤渣用适量乙酸乙酯萃取，滤液用 1/2滤液体积的乙 酸乙酯萃取(30min),下层水层再用乙酸乙酯萃取一次，合并乙酸乙酯，减压蒸 储。用适量甲醇洗涤减压蒸储得到的固体，再用正己烷洗涤15min,收集下层甲醇，加入乙酸乙酯和水(1:1,)进行萃

11、取(30min),将收集的乙酸乙酯进行减压 蒸储，用一定量的乙月青洗下固体，。的封保存，优点是能够充分萃取出发酵液 和菌丝中的紫杉醇。陈建华等人10的萃取方法比较简单，直接用菌丝进行，取 菌丝1g均质5min后用甲醇抽提，将抽提液通过离心，收集上层，用旋转蒸发器蒸 干，加入等体积水和二氯甲烷抽提，弃水相收集有机相，再次蒸干，所得粉末溶 于少量甲醇中，用粒径为0. 15 m0. 18ttm的硅胶粒子作填料的硅胶柱进一步 纯化。综上所述，在分离真菌发酵液中的紫杉醇首先要考虑预处理，然后用相应的萃取方法进行分离，要考虑萃取液的种类和减压蒸储的温度。4 .紫杉醇的纯化：得到较高纯度的紫杉醇十分重要。紫

12、杉醇的纯化多采用色谱法。已报道的 用于紫杉醇分离的方法除薄层色谱法、柱层析法外还有胶束电动毛细管色谱法、 高速逆流色谱法、树脂吸附分离法、膜分离法、沉淀法、化学反应法和药理作用 靶点法11。粗分离的紫杉醇一般采用柱层析纯化。周东坡12 (1995)报道，用高20cmi析柱，以硅胶(60目100目)为吸附剂纯化紫杉醇。将一定量的氯仿加入萃取物中，然后加样入柱，先用氯仿洗脱再用乙月青洗脱。庞欣13采用苯基柱固相萃（SPE）与高效液相色谱（HPLCM用来纯化紫杉醇。经SPEt理的样品最大吸收 峰的峰高明显降低，杂质峰大大减少。真菌发酵产物的提取物中杂质较多， 常规 精制方法使用大量溶剂，而且处理过程

13、中乳状液的生成也会造成样品的损失，导致样品的回收率不够理想，该法克服了上述缺点，是目前解决微生物发酵产物杂 质多、产量低的较好方案。金涛等14探索了对紫杉醇产生菌发酵液有效脱色作 用同时制备高纯度紫杉醇的树脂及层析条件。他采用了7种树脂对紫杉醇产生菌发酵液进行脱色和提取，结果表明201 X 4型树脂处理样品的效果最好，利用80% 的乙月青水溶液洗脱，紫杉醇的回收率达到了 98.8%。从而为提取紫杉醇提供了 一种操作简单、回收率高、污染较低的树脂层析方法。5 .紫杉醇含量测定：真菌发酵液中紫杉醇的定量可采用薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、 UVfe疫分析、生物学方法和放射性前体标记

14、等。另外还有竞争抑制酶免疫分析法， 它是利用对紫杉醇有专一特性的单抗进行测定，此方法简单易行且灵敏度高。HPLO最常用的、较为有效的分析检测方法。HPLCT仅可以测定紫杉醇含量，而 且还能追踪分离紫杉醇。四、内生真菌的分离筛选：1 .内生菌种的分离内生真菌的分离可以采取两种方法：一种是，采用标准的真菌分离纯化的 方法15,16。取植物组织，用70%的酒精将其表面消毒，然后用灭菌的刀片将外 层组织削去，将内部组织削成小片，小心置入水琼脂培养基中，待菌丝长成后， 挑取不同菌丝末端置于PDA培养基中，观察生长情况。另外一种方法平板灌注法17 0用灭菌的刀片去除外皮层和木质部， 用70%的酒精消毒，无

15、菌水冲 洗，将红豆杉样品加入到适量的无菌水中， 放入研钵中充分研磨，取匀浆注入融 化的的PDA培养基中，摇匀，倒平板，25c培养。内生真菌一般在PDA或MID培 养基中不形成抱子，或者是在灭菌的寄主茎叶中也不形成抱子。然而，这些真菌 可以在康乃馨的叶片上形成抱子。 康乃馨叶片经过丫射线照射后，置于水琼脂培 养基中，将分离得到的内生真菌接种到康乃馨叶片上，23c下培养12个星期后， 在康乃馨叶片上形成暗色的子实体结构， 对于真菌的鉴定具有重要的作用。研究 人员已经将小抱拟盘多毛抱的有性阶段研究清楚 18。内生真菌可以在15%的甘 油中一70C保存16,19 02 .内生菌种的纯化待PDAg养基初

16、步长出菌落时，选才¥长势较好的菌落，切取 5 mrrX 5 mmb块 单菌落接种另一 PDAF板，28c培养34 d .3 .冷冻保存从PD所板上选择长势良好且未染杂菌的菌落，切取 34小块菌体，放入灭 菌后装有1 mL液体石蜡的塑料管中，置于4c冰箱保存.本次实验共分离纯化并 保存了 147株菌种.当重新培养菌种时，只需从石蜡管中取出一小块菌体贴于PDA 平板上即可活化.五、前景展望：抗癌物紫杉醇已在临床上广泛应用，但受原料红豆杉木短缺的制约，存在 巨大的供需差距。目前，人们主要进行的是从红豆杉树中提取、分离和纯化紫杉 醇的研究。然而研究表明红豆杉各个部位的紫杉醇含量均甚微，且红豆

17、杉树又是 生长缓慢、散生、濒危的珍惜保护植物，因此单纯依靠从红豆杉属植物中提取来 解决紫杉醇的药源问题，几乎不可能。在人工栽培红豆杉树远水不解近渴； 化学 合成线路复杂，反应条件难以控制，试剂繁多，制备成本昂贵，而且只能停留在 实验室阶段，不能进行工业化生产；能合成紫杉醇的红豆杉树内生真菌的发现， 是紫杉醇资源研究的重要进展，开辟微生物发酵法生产紫杉醇并通过各种手段提 高紫杉醇产生菌的产量以达到工业化生产所需的毫克级水平，实现微生物发酵法生产紫杉醇，有望解决迫在眉睫的抗癌药物紫杉醇的药源问题，既可以改善目前 市场上紫杉醇供不应求、价格昂贵的现状，又可以保护濒临灭绝的珍稀红豆杉树 种，具有很大的

18、经济价值和市场前景。六、参考文献1江泽飞，宋三泰，冯奉仪.中国月中瘤临床与康复，2000, 7(2) : 6667 .2Wani MC, Taylor H L, Wall ME, Coggon P, MePhail A T. J AmChern Soc, 1971, 19: 23252327.3Schif P B, Fant J, Horwltz S B. Promotion of mietrotubule assembly in vitro by taxo1 . Nature , 1979, 277： 665.4袁金辉，郭立霞，王兴旺，等.紫杉醇的最新研究进展.中国药理学通报， 2001,

19、17(2) : 135139.5纪元，毕建男，严冰，等.生物工程学报，2006, 22(1) : 16.6翁开敏，贺全山.紫杉醇研究概况J.海峡药学，2002, 14(2).5 77Petfini O . Taxonomy of endophytie funsi Of aerial plant tissues. InFokkema N J and vanden Heuvel J ed Microbiology of the PhyHosphere. Cambridge Cambridge University Prase 1986, PP. 1751878马天有，董兆麟.西北大学学报(自然科学

20、版)，1999, 29(1) : 4749 .9周东坡，平文祥，孙剑秋，等.微生物学杂志，2001, 21(1) : 1819. 32.10陈建华，刘佳佳，臧巩固，等.中南大学学报(自然科学版)，2004, 35(1): 65 69.11赵凯，周东坡.生物技术通讯，20O4, 15(3) : 309312.12周东坡，平文祥.微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇.北京：中国科技出版社，2002, PP. 81.13庞欣，章光明，张瑞萍，等.色谱，2003, 22(2) : 185.14金涛，刘利群，王 伟，等.黑龙江医药，2006, 19(5) : 375377.15strobel G A,Yang

21、 X S,Sears J,et al.Taxol from Pestalotiopsismicrospora , an endophytic fungus of Taxuus wallachiana. Micrology, 1996,142:435-44016Li J Y,Strobel GA,Sidhu R,et al.Endophytic taxol producing fungi from Bald Cpyress Taxodium,Mcroibiology,1996,142:2223222617Huang Y J,Wang J F,Li G L,Antitumor and antifu

22、ngal activities inendophytic fungi isolated from pharmaceutical plants Tacus Mairei, Cephalataxus fortunei and Torreya grandis .FEMS Immumology and Medical Microbiology ,2001,31:163-16718 Metz A,Haddad A,Worapong J,er al.Induction of the sexual stage of Pestalotiopsismicrospora,a taxol-producingfungi.microbiology,2000,146 ; 20792089.19邱德有，黄美娟，方晓华，等。一种云南红豆杉内生真菌的分离。真菌学报报,1994,13(4):314-316.奖品名称：500万U豆体验卡甘号：50Dd4fea7001 everage D、stain7、The words below equals to one another except().A、the high season B 、the busy season C 、the peak season D. the off seasonA、热辣的B、菜系C、苦干的D、大