红曲类产品中桔青霉素的测定

1、GB/T xxxx xxxxxxxx食品安全国家标准红曲类产品中桔青霉素的测定 （征求意见稿）xxxx-xx-xx实施xxxx-xx-xx发布中华人民共和国卫生部 发布中华人民共和国卫生部 发布1.1.1.1 2010-06-01实施2010-××-××发布 前 言本标准代替GB 5009.222-2008。本标准与GB 5009.222-2008相比，主要变化如下： 修改了标准的中文名称，标准中文名称改为食品安全国家标准 红区类产品中桔青霉素的测定（理化方法）；按照GB/T20001.4-2001对原标准的结构进行了修改。食品安全国家标准红曲类产品中桔

2、青霉素的测定1 范围本标准规定了红曲类产品中桔青霉素的测定方法。本标准适用于红曲米、红曲红（固态、液态）、红曲发酵液和用红曲菌生产的保健食品中桔青霉素的测定。2 原理液态红曲类样品经乙醇提取、离心、过滤后经高效液相色谱仪（HPLC）分析；固态红曲类样品经甲苯-乙酸乙酯-甲酸提取、超声波萃取、离心、过滤后经HPLC分析，外标法定量。3 试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682中规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。3.1.2 磷酸（H3PO4）：色谱纯。3.1.3 甲醇（CH3OH）：色谱纯。3.1.4 甲苯（C6H5CH3）。3.

3、1.5 乙酸乙酯（C4H8O2）。3.1.6 甲酸（CH2O2）。3.1.7 无水乙醇（C2H5OH）：色谱纯。3.2 试剂配制 复合萃取剂（TEF）：甲苯乙酸乙酯甲酸（7+3+1），配制方法是将7份体积的甲苯（3.5）、3份体积乙酸乙酯（3.1.5）和1份体积酌甲酸（3.1.6）混合而成。3.3 标准品 桔青霉素（C13H14O5）标准品：纯度>99%。3.4 标准溶液制备3.4.1 桔青霉素标准贮备溶液（50 mg/L）：准确称取桔青霉素标准品，用甲醇溶解并定容至浓度为50 mg/L，密封后4 冰箱避光保存。3.4.2 桔青霉素标准工作溶液（5 mg/L）：用甲醇将10mL的50 m

4、g/L桔青霉素标准贮备溶液定容至100 mL，密封后4 冰箱避光保存，工作液现用现配。工作液从冰箱取出后应于室温下至少放置10 min，涡旋混匀后方可使用。3.4.3 桔青霉素标准曲线工作液：将标准储备液用甲醇系列稀释后，配成浓度为0.1 mg/L、0.25 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L的标准曲线工作溶液。4 仪器和设备4.1 高效液相色谱仪，配有荧光检测器。4.2 超声波细胞破碎仪。4.3 电子天平（感量0.0001 g）。4.4 pH计（精度0.01）。4.5 匀浆器。4.6 离心机。4.7 旋转蒸发仪。4.8 微孔有机滤膜（孔径0.45 µm）。4.9

5、数显恒温水浴锅（温度精度土1 ）。4.10 涡旋混匀器。4.11 磁力搅拌器。5 分析步骤5.1试样制备 5.1.1 液态红曲样品将带有菌丝体的液态发酵红曲样品匀浆后用吸量管吸取10 mL（液态红曲红样品直接取样10 mL），置于50 mL具塞试管中，加入20 mL无水乙醇，60 水浴加热1 h（期间不断振摇），冷却至室温后转入塑料离心管中，3 000 r/min离心15 min，上清液经0.45 µm滤膜过滤后进行HPLC分析。5.1.2 固态红曲制品用电子天平（4.3）准确称取一定量固态红曲样品（色素用红曲米为2 g，用红曲菌生产的保健食品为3 g，酿酒用曲为3 g）于50 mL

6、具塞比色管中，加入20 mL TEF溶液（3.2），超声提取10 min（强度40%，工作5 s，间隔5 s），3 000 r/min离心20 min，上清液转入50 mL具塞试管中，残渣用15 mL TEF溶液（3.2）同上述步骤再提取两次，合并三次提取上清液于50 mL具塞比色管中，40真空浓缩（4.7）至干后加入30 mL甲醇溶解，经微孔有机滤膜（4.8）过滤后进行HPLC分析。准确称取1g粉状红曲红或红曲黄色素祥品，在磁力搅拌下缓缓加到盛有20 mL TEF溶液（3.2）的烧杯中，继续搅拌30 min后，3 000 r/min离心20 min，以下按固态红曲样品同样的方法自“上清液转入

7、50 mL具塞试管中”起，依法操作。5.2 分析步骤5.2.1 液相色谱分析条件 a）色谱柱：C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，粒度5 µm）； b）柱温：28 ； c）流动相：乙腈（3.2）+水=35+65，水用色谱纯磷酸（4.3）调pH至2.5； d）流速：1.0 mL/min； e）检测器：荧光检测器，激发波长331 nm，发射波长500 nm； f）进样量：20 µL。5.2.2 色谱分析分别将20 pL不同质量浓度（0.1 mg/L、0.25 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L）的桔青霉素标准溶液（3.10.3）及制备后的样品溶

8、液（5.1）注入液相色谱仪中，以保留时间定性，以桔青霉素质量浓度与相对应的峰面积绘制工作曲线，获得线性回归方程及相关系数，以此计算样品中的桔青霉素含量。 由于HPLC分析中采用了荧光检测器，样品中的杂质对桔青霉素的出峰基本无干扰，因此一般情况下无需确证，必要时用液相色谱质谱进行确证，条件如下： a）毛细管电压：3.78 kV； b）锥孔电压：30 V； c）射频透镜电压：0.5 V； d）萃取锥孔电压：5 V； e）离子源温度：100 ； f）脱溶剂气温度：250 ； g）脱溶剂气流量：320 L/h； h）电子倍增电压：650 V； i）相对分子质量范围：100500。 桔青霉素的液相色谱图

9、参见附录A，质谱图参见附录B。5.3 标准曲线的制作将标准系列工作液分别注入液相色谱仪中，测定相应的响应值，以标准工作液的浓度为横坐标，以响应值（如：峰面积、峰高、吸收值等）为纵坐标，绘制标准曲线。5.4 平行试验将试样溶液注入液相色谱仪中，得到相应的响应值，根据标准曲线得到待测液中桔青霉素的浓度，平行测定次数不少于两次。6 分析结果的表述6.1固态样品中桔青霉素的含量按式（l）计算： 式中： c1样品中桔青霉素含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；c仪器检测的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V最终定容体积，单位为毫升（mL）；m样品质量，单位为克（g）。6.2液态样品中桔青霉素的含量按式（2）计算： 式中：c2样品中桔青霉素含量，单位为毫克每升（mg/L）；c仪器检测的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V2最终定容体积，单位为毫升（mL）；V1移取的样