一种检测细菌性阴道病新方法的建立及临床评价

1、检验医学20四年24卷05期种检测细菌性阴道病新方法的建立及临床评价朱园园沈佐君万士林【摘要】目的评估一种国内自主婕立利用唾液酸酶法检测细菌性阴道病方法的临床应川价值。方法 比色法探索研发试剂的最佳反应条件：以酶标准品首先确定底物溶液的ph值范围；在降低底物含 量以达到与bvblue进口试剂盒有相同检出限后，再分别确定反应的最适温度和时间。采用临床标 木对优化后的试剂、bvblue.临床现用国产试剂盒三者检测效果同吋进行验证，判断新产品临床 应川价值。结果 研发试剂在ph 6.()6.2, 37°c10min时与酶标准品达到最佳反应，与bvblue相 比，检出限相同时研发试剂底物用量

2、仅为bvblue的1/2.78。临床实验中，研发试剂与bvblue 对细菌性阴道病的检测效果差异无显若性意义,符合率96%。而国产试剂盒少bv blue对细菌性阴道 病的检测效果差别有显著性意义，符合率65%o结论研发试剂可以达到与bvblue相同的检出效 果，优于国内类似方法产品。其成本较低，可信度高且快速方便，更有利于在临床推广使用。【关键词】神经氨酸酶；阴道病，细茵性experiment and clinical research of a new reagent detecting bacterial vaginosiszhu yuan-yuan, shen zuo-jun, wan

3、shi-1 in. anhui provincial hospital affiliated to anhui medical university, anhui provincial center of clinical laboratory, hefei 230001, china.corresponding author： shen zuo-jun, email: shenzuojun 【abstract objective to evaluate the diagnostic value of a new reagent developed by domestic institutio

4、n detecting bacterial vaginosis with sialidase. methods explore the optimal reaction condition of the new reagent by colorimetric method, then use clinical examples to verify its reliability and another domestic kits with u.s. bvblue kit as criteria. results the new reagent reacted best to standard

5、sialidase at 37c, lomin in solution of ph6.0. at the same minimum detection limit, the usage of substrate in new reagent was 1/2.78 times of bvblue kit's. in clinical trials, there had no significant difference between new reagent and bvblue kitthe coincidence was up to 96% whereas significant d

6、ifference was 基金项th安徽省人才开发资金资助项h (2005z040)作者单位：230001合肥，安徴医科大学附属省立医院，安徽省临床检验中心(朱园园，沈佐君)， 美国哥伦比亚大学医学中心(万士林)通讯作者：沈佐君，电子信箱：shenzuojun detected between another domestic kit and bvblue kit, the coincidence was only 65% conclusions the new reagent can be made to have the same characteristics as bvblue ki

7、t, such as quickness, convenience, reliability, but decreased cost greatly. it will have more wide market than other kits in china.key words neuraminidase; vaginosis, bacterial细菌性阴道病（bacterial vaginosis, bv）是阴道内乳酸杆菌人量减少而厌氧菌群如普雷沃菌属、 动弯杆菌、阴道加徳纳菌及支原体等人量繁殖，同时伴有阴道分泌物性质改变的一组综合征。bv与 早产、自发流产、子宫内膜炎、输卵管炎、继发性不

8、孕等多种妇产科疾病密切相关可使患者对 aids和性传播疾病的易感性增加h。世界范围内其感染率约为5%51 %叫bv的实验室诊断金标 准为amsel法，其成本低廉，但指标易受到主客观因素多种干扰，尽管后人发展出了多胺检测卡、 革蓝染色评分检测线索细胞等改良方法，仍存在耗时长、操作繁琐等缺点，不利于临床快速诊断需 要。唾液酸嗨是bv患者阴道分泌物中致病菌分泌的特异性酶z ，其活性被认为与bv感染水平成 止和关。利用唾液酸酶检测bv渐渐成为近年來临床检验的首选方法。本研究以经美国fda认证的 gryphus诊断试剂公司产品bvblue试剂盒为参照，开发了一种能达到为bvblue试剂盒有相同 检测效果

9、的低成木的新型试剂，以期为国内市场提供一个更好的选择。材料与方法1. 材料：木院妇科门诊2007年10月至12月以外阴瘙痒、h带增多、有异味等症状就诊患者138 例，平均年龄30岁。无菌长棉拭子采集患者阴道壁下1/3处分泌物3份（尽量多取口均匀一致），联羊 前72 h内无性生活，未使用阴道乳剂或灌注疗法，避开经期。2. 主要试剂与仪器：唾液酸梅标准品（美国new england biolabs公司）无菌分装，bvblue试 剂盒（含底物ibx-4041,美国gryphus诊断试剂公司），目的底物mstt （美国lhe bioscience公司）, 国产唾液酸酶一步法检测试剂盒（北京某公司），显

10、色剂naoh。du-530型分光光度计（美国beckman 公司），phs-25b型数字酸度计（上海人普仪器有限公司），bx-41型倒置显微镜（口木olympus公司）。3. 方法：（1）底物ibx4041、msttm唾液酸酶标准品最适反应ph值的检测：根据bvblue试 剂盒说明帖（ph5.5-6.0）及其实测值，经预实验缩小范围后配制ph值为5.5、6.0、6.2、6.5、6.7的底 物ibx-404k mstt缓冲液各0.5ml （同一底物z间浓度相同，前者为后者的两倍），分别加入足够量 的酶标准品10u, 37 °c水浴lomin,加入1 mol/lnaohl-2滴,混匀后立

11、即在波长590 nm （产物吸收 峰）处比色，以相同处理的无酶液调零，根据产物量找出最适反应ph值。化介物ibx-4041为唾液酸 酶苛性牛色底物,经酶催化牛成ibx-4050和唾液酸，加入naoh后显示绿色或蓝色，即为阳性；酶暈 不足时显示黄色，即为阴性。底物mstt为其类似物，显色原理相同。 最适ph值时对于目的底物 mstt的唾液酸l*w最低检出限：在0.5ml最适ph值的mstt缓冲液中分别加入0、0.25、0.5、0.75、1.0 u的标准酶，反应条件同上，肉眼观察显色情况并对产物进行波段扫描（波长45（）nm650nm）,观 察峰的形成情况，记录峰吸光度（a）值。同吋以bvblue

12、试剂盒作对照,标准酶量为0、0.75、1.0、 1.25、1.5 uo用同一管标准酶各重复三次取均值。 确定mstt用量，使两种底物在相同反应条件 下检出限相同：bvblue试剂盒每管0.5ml,加入检出限量及其上下量的标准酶，以其结果为参照， 调节mstt用量使二者具有相同阴阳性标准。（4）临床应用中反应温度及反应时间的确定：以调整后 的mstt和bvblue试剂盒各0.5ml为反应液,酶量2、6、1（） u,分别在4、24、37反应lomin,根据 a值找出最佳反应温度，并在此温度下再次分别反应3、5、lomin,比较后判定最佳反应时间。其中 酶量多少分别反映阳性程度为低、屮、高；根据现冇

13、资料对唾液酸酶（即神经氨酸酶）一般反应特 性描述，应用调整后的底物量在寒冷（4°c）、室温（24 °c）、理论最适值（37 °c）状态下反应，判 断临床应用温度范围；在预实验认为lomin已足够反应的前提下，分析缩短反应时间对结果的影响。（5）临床标本验证：根据优化后条件制成mstt试剂盒，与bvblue试剂盒、本院所用国产试剂盒同 时対每一患者3个拭子进行检测，并以bvblue试剂盒为标准，均严格按照试剂盒说明书操作。对于 mstt与bvblue检测结果不-致者立即重取标木按amsel法复查：（i）阴道ph >4.5； （2）阴道分 泌物增多，变稀薄如奶状

14、，有异味；（3）胺试验（whiff）阳性，即在阴道分泌物中加入10%koh 产生鱼腥味；（4）阴道分泌物涂片中可见线索细胞。4项中有3项以上符合即可判断为bv阳性。4. 统计学分析：应mj spss 13.0软件，临床标本结果比较运用配对设计mcnemaa2检验法和 kappa（k）检验法。三0.7表示两种方法吻合度较强，（）.7$0.4技示吻合度-般，k<0.4衣示吻合度 较弱。结果1.二种底物与标准酶反应的最适ph值的判断。由于底物浓度及酶童均相同且底物过量，因此酶 的催化活性与产物的量成正向变化，对以用产物a值较高者对应ph值作为酶的最适ph值，结杲见图1。图1不同ph值时标准晦的

15、二种产物的a值变化由图1可得，二种产物a值由ph值5.5到6.0吋上升明显，而ph值继续增加则a值变化不人，mstt 在ph6.5时甚至有所下降。考虑到临床bv患者实际阴道ph值多在5.06.5z间叫正常人ph值3.54.5 国），综合认为标准唾液酸酶应川底物液最佳ph值为6.06.2之间，选择“拐点”处即ph6.0作为后续 实验溶液ph值。此时产物均肉眼可见绿或蓝色，即为阳性。2针对目的底物的标准酶最低检岀限确定据预实验结果逐步减少酶的川量并缩小差距，确定 酶的梯度；根据肉眼能分辨颜色变化的程度及在波长扫描中是否有产物峰和对应的峰a值高低，判 断最低检出限。反应后溶液颜色随产物量增加由黄至蓝

16、逐渐变化，见表1和表2。表1不同含量标准酶与mstt作川对产物颜色及a值影响mstt结果0u0.25 u0.5 u0.75 u1.0 ua值0.0230.2730.3210.5020.804显色（判断）黄色（阴性）黄色（阴性）黄色（阴性）黄绿色（弱阳性）绿色（阳性）表2不同含量标准酶与ibx作川对产物颜色及a值影响1bx结果0u0.75 u1.0 u1.25u1.5 ua值0.0200.3210.3590.4190.508显色（判断）黄色（阴性）黄色（阴性）黄色（阴性）黄绿色（弱阳性）绿色（阳性）根据表中结果认为，在bvblue底物用量为h的底物的2倍时，目的底物mstt在ph6.0条件卜所需

17、标准酶的最低检出限为0.75 u, bvblue底物所需酶的最低检出限为1.25 u。3. 根据以上结果，以bvblue底物所需酶的最低检岀限为标准，调节fl的底物用量使二者一致, 即阴阳性标准相同，发现此吋目的底物的用量仅为bvblue底物的1/2.78,即0.09mgo4. 临床反应温度确定：根据现有资料对唾液酸酶（即神经氨酸酶）一般反应特性描述，应用调 整后的底物量在寒冷及室温状态下与不同含量酶反应，结果以波长590nm处a值表示，见表3。表3不同温度对二种底物反应的影响4 °c24 °c37 °c酶量2u6ui0u2u6u10u2u6ui0uibx0.11

18、60.3770.6130.4571.0691.5690.4721.3831.781mstt 0.1710.4290.8230.4411.2121.5520.587l6771.822可以看出，酶在37 °c时催化活性最好,酶量高时更明显,较冷条件下(4 °c)易造成假阴性而不适 宜检测。鉴于24 °c与37 °c时的a值比较接近，认为临床应用时在一般室温下反应即可，即使标本中 酶量较低也不影响结果判读。反应时间优化:采用最佳温度37 °c分别反应3、5、lomin,见表4。表4不同时间对两种底物酶反应的影响3 min5 min10 mina 值

19、2u6u10 u2u6u10 u2u6u10 uibx0.5491.0241.6470.5811.4791.9480.9701.910251mstt0.5111.3651.7500.6211.728l8691.328l7951.909由以上数据可知两者均能快速反应，3min5min产物颜色与a值差别均不明显，而lominlht则反应很 充分，在低酶量时也呈浅蓝色，a值育了人人提高。因此在考虑速度与效率的前提下，选jljlomin为 最佳反应吋间。5. 临床试验中138例疑似患者中bvblue阳性检出率为26%,研发试剂为25%。研发试剂敏感度 为92%,特异度为98%,符合率为96%,阳性预测

20、值为94%,阴性预测值为97%。与bvblue相比差 异无显著性意义，两种试剂吻合度较强，见表5。表5研发试剂盒対138例门诊患者bv检测结果比较研发试剂bvblue阳性阴性合计阳性33235阴性3100103合计36102138p>005,k=0.905>0.7其中有5例结杲不-致，经amsel标准判断认为：研发试剂阳性、bvblue阴性2例：amsel 阳性1例，阴性1例；研发试剂阴性、bvblue阳性3例：amsel阳性2例，阴性1例。国产试剂阳性检出率为59%,敏感度为97%,特异度为54%,符合率为65%,阳性预测值为43%, 阴性预测值为98%；与bvblue相比差异有

21、非常显著性意义，两种试剂吻合度较弱，见表6。表6国产试剂盒对138例门诊患者bv检测结果比较国产试剂bvblue阳性阴性合计阳性354782阴性15556合计36102138p<o.oh k =0.362<0.4讨论健廉女性阴道中厌氧菌与需氧菌数量比为2： 15： 191,正常情况下阴道通过白净作用维持内 环境的稳定，抵御外來微生物感染。当卵巢功能紊乱导致雌激素水平下降或人为因素使ph值升高等 破坏菌群平衡时，原本占优势的乳酸杆菌被阴道加德纳菌及其它厌氧菌群等机会致病菌所取代， 造成病理上无明显炎症的细菌性阴道病（因加德纳菌及普雷沃菌属分泌的唾液酸嗨可间接促进片细 胞的分解）l，0

22、jo te由于其感染症状不明显且常易复发，致病菌产生的粘蛋白水解酶一再使阴道粘膜 屏障受损，导致其他病原体更易入侵产生局部感染和全身症状因此bv对女性特别是孕妇的庁心 健康构成了很大的潜在威胁。近年来bv诊断依靠对致病菌特斤性代谢酶类的牛化检测，如脯氨酸氨肽酶竝】、粘蛋口水解酶 阴、唾液酸御叫乳酸脱氢酶冋等，尤以唾液酸酶法商品试剂盒发展最为迅速、广泛，如美国gryphus 诊断试剂公司90年代开发的bvblue试剂盒上市后已获fda认证及专利保护，以其简便、快速、准 确的优点在欧美许多国家都己大量应用。但由于单靠进口价格昂贵，它在国内的使用受到很大限制。 目前各大医院多采用国产唾液酸酶法检测试

23、剂盒，根据其中是否加入显色剂乂可细分为一步法与两 步法。国产试剂普遍价格低廉，但是市场上产品质量良莠不齐，临床应用时很难保证结果的对靠性, 易造成漏诊、误诊。因此，我们与美国哥伦比亚大学合作，以bvblue为参考，开发出了底物关键 成分mstt,确定了新试剂盒的最佳反应条件，经过临床初步测试认为它bvblue检验结果具 有很高的符合率（96%）,敬感度92%、特异度98%。有5例结杲不符，在排除操作误差后认为可能 是取样差异较大，如性质不均匀或取材部位略有不同存在酶活性差异，导致标木含酶量在检出限左 右时，颜色判断易受主观因索影响，造成二者结果差异。这种影响可以通过临床医师严格按要求取 样來避

24、免。在新试剂盒研制成功的同时，比较了本院在用的国产一步法试剂盒，发现它虽然敏感度 高（97%）,但特异性相当低，假阳性率高达46%,与bvblue符合率仅肓65%,结果并不完全真实 可靠。因此认为就检测效果而言，新试剂不仅在二步法产品中接近国际先进标准，且优于现有一-步 法产品。就成本而言，新试剂盒约为10元人民币，bvblue和国产试剂盒为其23倍，所以新试剂盒 除了同样具备简便、快速、直观的优点外，还人人节省了试剂成木，利于各级医院推广使川。根据 以上研究我们得出结论，认为木试剂在经过更多的临床验证后完全有望成为bvblue在国内的替代 产品，应用前景十分广阔。致谢：感谢美国lhe bio

25、science inc.何海音博士提供底物mstt。参考文献1 darwish a, elnshar em, hamadeh sm, et al. treatment options for bacterial vaginosis in patients at high risk of preterm labor and premature rupture of membranes. j obstet gynaecol res, 2007, 33:781-787. pmid: 180014422 andrews ww, hauth jc, cliver sp, et al. associati

26、on of asymptomatic bacterial vaginosis with endometrial microbial colonization and plasma cell endometritis in nonpregnant women. am j obstet gynecol, 2006, 195:1611-1616. pmid: 167690173 spear gt, st john ep, zariffard mr. bacterial vaginosis and human immunodeficiency virus infection. aids res the

27、r, 2007, 4:25. pm1d: 179537614 jones fr, miller g, gadea n, et al. prevalence of bacterial vaginosis among young women in low-incomc populations of coastal pcm. int j std aids, 2007, 1 & 188-192. pmid: 173625535 amsel r, totten pa, spiegel ca , et al. nonspecific vaginitis. diagnostic criteria a

28、nd microbial and epidemiologic associations. am j med, 1983, 74:14-22. pmid: 66003716 wiggins r, crowley t, horner pj,et al. use of 5-bromo-牛chloro-3indolylalpha-d-n acetylneuraminic acid in a novel spot test to identify sialidase activity in vaginal swabs from women with bacterial vaginosis. j clin microbiol, 2000, 38:3096-3097. pmid: 109219867 caillouette jc, shaip cf jr, zimmerman gj, et al. vaginal ph as a marker for bacterial pa