生物电镜重点

1、 生物电镜重点1、 亚显微结构：介于细胞水平和大分子水平之间的结构，简称亚微结构，亚细胞结构，细微结构。2、 超微结构：严格的讲是指分子水平的结构。 #3、 分辨率：D=0.61/N*sin(/2)，其中D为分辨率，为光波波长，N为介质折射率，为物镜镜口角。1m=10dm=100cm=1000mm=106um=109nm=1012pm=1015fm=1018am #4、 光学显微镜分辨本领为光源波长的一半。（用香柏油的情况下）#5、 分辨本领指一个显微镜能分辨的最小微体，从理论上而言，指能力。由于各种原因，在像中所再现的最小细微部分可能大于或小于仪器的分辨本领，叫做分辨率，指效果。肉眼分辨率0

2、.2mm，光镜的分辨率0.2um，电镜的分辨率0.2nm。M有效=肉眼/仪器，指分辨率，肉眼的分辨率为0.2mm，电镜的分辨率为0.2nm，故而该电镜的分辨率为100W倍。#6、 电子显微镜的分类：一，透射电镜（tem）：收集直接透过样品的电子并成像。二，扫描式电子显微镜（sem）：将从样品表面反射出的电子收集并使他们成像。三：扫描透射电子显微镜：兼具以上二者功能。#7、 电镜技术的应用：一，线粒体、高尔基体、内质网、溶酶体、中心体等细胞器还有细胞骨架系统；二，生物大分子：核酸，蛋白质，脂质；三，细胞中的化学成分：ATP、CAMP、含硫蛋白质，粘多糖、Ca2+，Mg2+，Fe2+，Na2+，K

3、+；四，病毒；五，直接研究活细胞。#8、 电镜技术的未来：一，纵向联系不断深入，用不同手段对同一种材料多角度的观察，如超薄切片法，冷冻蚀刻法。二，横向联系不断扩展，多种显微技术和其他物理技术与电镜技术相结合，研究某一课题，如扫描隧道显微镜，原子力显微术。三，仪器将继续更新，四，样品制备技术不断完善。#9、 Airy盘半径通常以第一级暗环的半径R表示，R=0.612/n*sin，其中表示光在真空中的波长，表示入射孔径角的一半，n表示透镜与物体间介质的折射系数。#10、 分辨本领等于Airy盘的半径r，即Abbe公式=0.612/nsin，数值孔径=nsin，提高分辨本领的方法：增大数值孔径，减小

4、波长。#11、 光学显微镜的极限分辨本领不小于0.2um。放大极限倍数2000倍，提高分辨本领只能减小波长，可见光（0.39-0.76um）#12、 德布罗意波=h/mv，h普朗克常量，m指物质质量，v指物体速度#13、 电子波的波长比可见光短得多，这是电镜分辨本领高的根本原因。对电子显微镜来说限制分辨本领的不是波长是透镜像差。透镜的极限分辨本领1.4A，点分辨本领3A。#14、 电子透镜原理：带电粒子在电场或磁场中发生偏转，沿一光轴成旋转对称的电磁场，可以使从轴上一点发出的电子重新汇聚在中心轴的另一点上。电磁场对电子显示出透镜的作用，所以称为电子透镜。现代电子显微镜主要利用磁透镜。#15、

5、长磁透镜能得到清晰的像，但是不能放大，对电子束有汇聚特性。短磁透镜能放大像，其也能对电子束有汇聚特性。短磁透镜是电镜中实际采用的透镜，但是其放大倍数较小。#16、 磁浸没透镜：将物体放在接近焦点的地方，即物体浸没在透镜的磁场中，强磁透镜为电子显微镜采用。17、 透射电子显微镜结构：镜筒，真空系统，电子学系统。与光学显微镜相比，电子枪代替光源，玻璃透镜用磁透镜代替，观察和记录系统相似。#18、 镜筒：包括电子束照明系统（电子枪，聚光镜），样品室，真空系统，成像系统（物镜，中间镜，投影镜），记录系统。19、 电子枪发射和加速电子，钨丝为常用灯丝发射电子，电流加热钨丝至2200-2500K时产生热电

6、子发射，电子发生在很大程度上取决于温度。#20、 阳极：对电子起加速作用，采用负高压，阳极为地电位，阴极负高压。21、 栅极：又叫控制极，控制电子束的形状和发射强度，稳定灯丝加热电流。22、 聚光镜：将电子枪发射的电子束汇聚到样品上，调节电子束孔径角，电流密度和照明光斑的大小，一级聚光镜能减小电子束直径20-80倍，二级聚光镜扩大电子束直径1-2倍。#23、 换样品室：又称样品室，载体为具有200目小孔的铜网，铜网直径3mm，厚50-100um。具有气锁装置，换样品室可以只允许少量的空气进入镜筒，以便在短时间内回复工作真空。#24、 成像与放大装置：物镜：放大50倍；中间镜放大3倍；中间镜放大

7、15倍；投影镜放大200倍，总共能放大500000倍。#25、 成像系统：物镜，中间镜，投影镜等成像透镜和消像散器组成，采用三级或四级成像系统，也有五级。成像原理：高压电子枪高速电子束电磁透镜样品电子束发生投射荧光屏浓淡不同的图像（浓淡不同的图像反应了样品不同部位的物质结构）#26、 物镜：对样品的成像和放大。决定电镜的分辨本领。27、 物镜光阑：挡住散射的电子，提高图像的反差，故又叫反差光阑。#28、 中间镜：一个可变倍率的弱透镜，以物镜镜像为物在投影镜或第三透镜的物平面上形成一个像，高分辨本领的电镜有两个中间镜。29、 投影镜：最后一级放大镜。中间镜和投影镜也有光阑。30、 消像散器：减少

8、像散，物镜必须要有消像散器，有时聚光镜和中间镜也有。31、 观察室：内有荧光屏与铅玻璃窗。内涂荧光物质，电子束照射下可呈现终像，在主观察窗外有两个观察放大镜，可以把终像放大3-10倍。32、 照相装置：电镜照相与普通照相不同，图像反衬度最低时才是正聚焦，底片还要经过预干燥处理。33、 摄影室：在观察室下方，把选择好的像记录在涂有电子感光乳胶的玻璃平板、软片或胶卷上，在观察室和摄影室之间装有气锁装置。34、 真空系统：从镜筒中排出空气和其他气体。要求真空的原因：电子在行程内不与任何粒子碰撞，不被散射；如果有气体，会产生电离和放电；气体分子腐蚀灯丝；残余气体聚集到样品和光阑上会污染样品，增加像散。

9、一般电镜要求10-410-5。#35、 1托=1mmhg=133.32pa 1atm=760mmhg36、 真空系统采用两级串联，超高真空要三级串联。从大气压获得低真空，再从低真空获得高真空。系统包括：前置泵，油扩散泵，真空系统电源，辅助电源。37、 前置泵：获得低真空，简单的旋片式机械泵。38、 油扩散泵：利用油分子在快速运动中能把较轻的空气分子或水蒸气分子带到前置泵里，从而逐渐达到高真空。再次被加热循环工作。在此泵内，要有一定的冷却水，防止油蒸汽过多污染镜筒，前置泵需要开启一段时间后才能开启油泵。真空度能达10-639、 成像过程：有四种物理过程：吸收，散射，干涉，衍射。样品室薄膜样品，吸

10、收少，如果吸收过多会烧毁样品。40、 弹性散射：一个高速运动的电子打入薄膜样品的原子核，由于原子核的质量比电子大很多，入射电子与核发生弹性碰撞，即弹性散射。电子不损失能量，方向偏转。#41、 非弹性散射：一个电子与原子核外的一个电子碰撞，相互作用后快速电子将一部分能量交给核外电子。改变速度和方向。散射角越大，电子在物镜后的焦面上离轴越远。当散射角大到一定程度，被物镜后焦面上的物镜光阑所拦截，样品的像就有一个暗点。电子散射形成图像反差。#42、 影响散射的因素：一，总散射量与样品厚度、密度、质量与厚度的乘积成正比；二，原子核越大，被散射的可能行也就越大。质量与厚度的乘积为质量厚度。43、 振幅反

11、差：样品各处质量厚度不同，在荧光屏上就形成明暗不同的黑白图像。44、 非染色情况下：原子间距是1A或更大些，原子核和电子的大小是10-510-6A，样品对于入射电子来说几乎是全空的空间，大量入射电子打在荧光屏上形成亮背景。45、 电子的运动可以看做电子波，则在电子与样品的作用中形成投射波和散射波。#46、 相位反差：干涉波和透射波在振幅上表现出差别，在最终的像中就会出现亮暗不同的区域，这种反差就是相位反差。#47、 反差：指底片上相邻的两部分亮度的比，即样品的像与其背景在亮度上的差别。透射电镜图像反差由振幅反差和相位反差两部分组成。低原子序数的样品（生物样品），相位反差几乎成了唯一的反差来源。

12、#48、 衍射：可以加强图像的反差，但是像的分辨率下降。49、 生物样品的图像主要由振幅反差提供。弹性散射对提供反差有利，非弹性散射对提供反差不利。提高反差的方法：一，加入物镜光阑（拦截部分大角度散射电子，使散射强的部位变暗，形成振幅反差限制照明孔径角，提高分辨本领）二，提高样品中某些部分的原子序数（用重金属盐染色铀，铅，锇，比如正染色和负染色，或者重金属投影喷涂法金，铂对样品进行喷涂）三，选用较低的加速电压（降低加速电压可以增大弹性散射，有利于反差的提高，但是会使色差加大，分辨本领降低，故一般适用于低放大倍数）四，暗场显微法：亮场像是直接透过样品的电子和部分散射电子成像；暗场像是利用样品的散

13、射电子所成的像，明暗与亮场像相反。暗场像反差高，但强度很低。五，适当控制切片厚度，要高反差，就要切片厚些，但是太高电子束穿不过，而且增大色差。在50-60KV下，切片厚度在500-600A反差好。50、 由于电子透镜存在的一系列缺陷，所引起的图像偏离理想成像的现象叫做像差，包括几何像差，色差和像散三种。#51、 几何像差：在电子显微镜中，实际上电子束满足旁轴条件并不够好，引起的像差叫做几何像差。#52、 色差：各个电子的速度严格来说是不同的，与速度对应的电子波长就有一定的分散度，因而引起的像差成为色差。#53、 像散：因各种原因引起磁场不严格轴对称，产生的像差叫做像散。#54、 扫描电镜的基本

14、结构（sem）：电子光学系统（电子枪、电磁透镜、扫描线圈），样品室，信号收集及显示系统，真空系统，供电保护系统等。#55、 透射电镜主要步骤：固定脱水块染渗透和包埋聚合切片捞片染色镜检。#56、 固定：其目的是杀死组织，保存活体形态、结构及其组成，防止在固定后的可能损伤，如自溶或被微生物侵袭。#57、 固定的方法：物理固定法：高温、冷冻、干燥等物理手段。化学固定法：用化学试剂来固定细胞结构。#58、 透射电镜样品主要的制备方法：滴样法、投影法、超薄切片法、冷冻蚀刻法、电镜放射自显影、免疫电镜和电镜细胞化学。59、 固定剂：四氧化锇、戊二醛、多聚甲醛、高锰酸钾和重铬酸钾等。#60、 四氧化锇：唯

15、一脂肪性物质固定剂，对磷脂蛋白质和核蛋白保护好。固定的组织不收缩、不膨胀、不变硬发脆。缺点是对糖原、核酸、微管固定作用较差，不适于超微细胞化学工作，分子量大，渗透能力差，大于1mm3组织块固定不好，有挥发性，对粘膜有毒性，四氧化锇固定之后必须用缓冲液或水冲洗后才能转到酒精中脱水。#61、 戊二醛：对糖原，核酸，微管。内质网和细胞基质固定作用好。适于超微细胞化学研究，能较好保存蛋白质。缺点是对脂类保护不好，不提供电子反差，对缓冲液要求高。62、 双固定法：先用戊二醛固定后，再用四氧化锇固定，两种固定剂相互补充，取得好的固定效果。63、 甲醛：固定迅速，对酶活性保护比戊二醛好，经济方便。缺点是脱水

16、时细胞中的某些物质流失，超微结构保存不好，形成长度不均的聚合物，影响渗透结构。其可作为前固定剂或与戊二醛组成混合固定液。#64、 缓冲液：常采用醋酸巴比妥缓冲液（为四氧化锇缓冲液，不适用于戊二醛），磷酸缓冲液（临时配制）。65、 脱水：除去细胞和组织中的游离液态水。用既能和水，也能和包埋介质中单体相混合的液体（酒精和丙酮）代替样品中的游离态水。在低温（4）进行，时间尽可能短。原因：为使包埋介质完全渗入组织块，水溶性包埋介质可以不经过脱水，湿样品本身的反差很低。常用的有乙醇和丙酮，其他还有甲醇，异丙醇，包埋介质。#66、 块染：提高图像的反差，脱水前或脱水时对组织块的染色叫做块染，切成片后的染色

17、叫做片染。#67、 渗透和包埋：用一种溶液或者混合液逐渐取代组织内的脱水剂（或前介质）使细胞内外所有空隙都被这种液体充填叫做渗透，包埋是指将渗透好的样品放入适当的模具中，灌上包埋液包埋，经加温聚合形成一种固体基质，牢固的支持组织，又不混乱其空间联系。#68、 包埋介质：现在常用的有环氧树脂，还有聚酯树脂和水溶性包埋介质。环氧树脂：指一族加热后变硬的含有环氧基团的脂肪族合成树脂，淡黄色或蜜糖色。#69、 增塑剂：又叫柔韧剂，防止组织太脆，增加聚合快的塑性，改善切割性能，常用邻苯二甲酸二丁酯，其缺点是粘度较大，渗透过程慢，包埋块机械弹性小，较硬，提供的反差小，必须进行电子染色，其优点是保存组织超微

18、结构好。#70、 切片：切出500A左右厚的切片。准备工作：载网的清洗，支持膜的制备，包埋块的修整，切片刀的制作等。#71、 载网一般是铜网，其作用是，承载支持膜和样品，照射到网孔中的电子，穿过样品，成像，放大，样品上的热量传走，减少样品的热漂移。#72、 铜网的网孔不足以平坦的支持切片。要在铜网上覆盖一层透明的薄膜支持膜，其材料有火棉胶和聚乙烯醇缩甲醛，碳膜。#73、 切片刀的制备：玻璃刀，制作简单价格便宜。#74、 修块：将包埋快修成一定的形状和大小，修成四边角锥形。目的是除去组织块周围多余的包埋介质，或不感兴趣的部分，有一定的形状，大小适合包埋块，才能切出理想连续切片。75、 切片：超薄

19、切片机分为机械推进式，热膨胀式和冷缩式。#76、 捞片：用眉毛笔把碎片和厚片去掉。使超薄切片汇集于刀槽中间。用镊子夹住铜网边缘，使边稍稍弯曲，而铜网是水平的。有膜面的朝下，水平至切片上方，让铜网和切片平行，切片都集中在铜网的中央部位，快速让铜网与切片接触，切片牢固粘在铜网上，取出。切片面朝上，放在垫有干净滤纸的培养皿中。77、 电子染色：对样品进行增强反差的处理，一般用重金属盐类做染色剂。在固定脱水时进行块染，在切成薄片时进行片染。影响因素：包埋剂种类，染液PH值，浓度，染色温度和时间等。#78、 常用的电子染色剂：铀染色剂，铅染色剂（应用最广泛，与含有还原锇组织最有亲和力），高锰酸钾，磷钨酸

20、，后两个不常用。#79、 染色机理：染色剂和生物样品成分以静电力结合；络合物或复合物的方式结合，金属粒子选择性沉着在特定部位上。最常用的染色剂是铅盐和铀盐。#80、 染色方法：高密度的重金属染色剂和样品的细微结构成分结合，增加样品局部的电子散射能力，是图像反差增强。荧光屏上显示正像，叫正染色。#81、 负染色：利用高密度的重金属染色剂把生物样品包绕，作为衬托，增加背景对电子的散射作用，生物样品结构却相对多的通过电子，在荧光屏上形成暗背景的亮像。常用的负染色剂：磷钨酸和磷钨酸钾。82、 透射电镜制样技术新进展：冷冻电镜技术：快速冷冻，冷冻超薄切片技术，冷冻断裂和蚀刻技术。快速冷冻的目的是不让样品

21、内形成大冰晶，避免细胞形态被破坏。#83、 冷冻断裂和蚀刻原理：样品冷冻真空喷镀仪中冷冻断裂断面上细胞器和已冻结水分。加热升温冰升华细胞器膜结构暴露出来蚀刻，切面上喷镀一层铂-碳投影膜复型，把复型膜下组织腐蚀掉复型膜捞到铜网上电镜观察。（图像立体感强，分辨率高，并且样品可长期保存。）#84、 扫描电镜（SEM）样品要求：固定和干燥状态优良，导电性能良好。#85、 常规制样法：取样缓冲液漂洗戊二醛固定锇酸后固定梯度脱水醋酸戊酯代换液体二氧化碳临界点干燥真空喷涂仪或离子溅射仪喷金等观察。（常用来研究物体表面结构）#86、 胶体金的好处：金化学性质稳定，不影响样品结构，又有导电性；能产生大量二次电子

22、，提高图像质量；加强样品对电子束轰击抵抗力，减少电子束的损伤。#87、 酶细胞化学的基本原理：某种底物经过酶的专一性作用初级反应产物捕获剂（重金属离子）最终反应产物（为不溶性电子致密物沉淀），在特定条件下，细胞内某种酶在原位与特定的底物发生反应后，再与捕获剂进行反应，产生电镜下能检测到的电子致密物沉淀；沉淀部位代表了酶在细胞超微结构中定位；定位精确性决定于酶与底物反应特异性。#88、 ATPase、腺苷酸环化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、DNA酶、RNA酶、转氨酶和酯酶等可以用铅盐沉淀法检测。89、 酶电镜细胞化学流程：取材固定（不用之前两种电镜方法中的固定剂，易伤酶，多采用多聚甲醛固定）孵育（

23、孵育液里有酶反应底物和捕获剂，如铅，铜，钡等）漂洗脱水包埋超薄切片与染色对照试验（一定要有，与前两种电镜方法不同）。ATP经过ATP酶反应ADP+磷酸根铅盐捕获磷酸铅沉淀（可被电镜检出）90、 氧化酶反应原理：双氧水氧化酶氧化水+氧气氧气与DAB（四盐酸3,3，二氨基联苯胺）结合生成强嗜锇性物质，再经过锇固定后生成锇黑为高电子密度物质，被电镜检出。#91、 孚尔根-六亚甲四胺银染色法（染DNA有一定的特异性）：作用机理，浓盐酸处理样品，使DNA水解并暴露醛基，醛基与底物中的银离子发生沉淀反应，生成还原银电子致密物。具体方法：1，多聚甲醛或戊二醛固定，2，常规脱水包埋，超薄切片，捞片，3,5mo

24、l/L的盐酸处理，20，1h，重蒸水清洗，4，六亚甲基胺银溶液孵育，60，避光，1-2h。对照组是省去HCL水解。#92、 碳水化合物（淀粉，糖原，粘多糖，黏蛋白）染色方法：过碘酸氧化法，测定与糖残基相邻的醛基，羟基，氨基。步骤：多聚甲醛固定，包埋，切片，捞片至铜网上，1%过碘酸20-30min，室温，水洗，六亚甲基胺银溶液，避光，60，40-60min，自然冷却，水洗：5%-10%硫代硫酸钠溶液洗（除去表面螯合银）。对照组是省去过碘酸水溶液处理。#93、 无机离子电镜细胞化学：金属离子与无机离子发生特异性结合的反应，生成电子致密物沉淀，有沉淀的区域即是该无机离子在细胞中的定位。#94、 Ca

25、离子的定位：高度隔室化的，形成钙离子浓度不同的钙池；正常情况下，细胞质，线粒体，核部位都有钙的分布。原理：磷酸盐或草酸盐与钙离子反应，在原位形成沉淀，再与焦锑酸盐反应，替代磷酸盐或草酸盐形成焦锑酸钙，焦锑酸钙在电子显微镜下为电子致密物。操作流程：组织块用0.09mol/L磷酸钾与3%戊二醛固定，4，0.09mol/L磷酸钾与4%蔗糖漂洗2-4h，三次。1.5%-2%焦锑酸钾与1%锇酸固定2h，4。蒸馏水漂洗3次，10min，脱水包埋切片染色或不染色。#95、 免疫电镜细胞化学：免疫学技术与电镜技术有机结合的产物。定义：利用抗体和抗原特异性结合的原理和免疫电镜技术，在超微结构水平上定位，定性及半

26、定量显示抗原的技术方法。原理：使抗原与已标记了电子致密物的抗体结合，在细胞内发生专一的免疫化学反应，在用高分辨率的电子显微镜检测免疫反应产物。研究细胞表面和细胞内抗原的定位和定性。应用：抗原-抗体复合物的精细结构；鉴定免疫损伤引起的细胞病理变化；研究细胞超微结构及其功能。#96、 标记的免疫球蛋白G：免疫球蛋白G能通过双功能试剂（戊二醛）与铁蛋白或某种酶结合，形成被电子致密物体标记的抗体，分别称为铁蛋白标记抗体和某种酶标记抗体等。标记物：铁蛋白，铀，金。辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等酶类。#97、 免疫电镜细胞化学发展：铁蛋白标记技术酶标记免疫电镜技术胶体金标记免疫电镜技术。#98、 免疫电镜包埋前、后染色流程图：包埋前染色：组织固定厚切片免疫染色包埋超薄切片透射电镜观察；包埋后染色：组织固定包埋超薄切片免疫染色透射电镜观察。#9