分子诊断学完整终结版

1、分子诊断学完整终结版1 .分子诊断学：是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学 的技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子和2 .SNP:单核音酸多态性，指在基因组上单个核昔酸的变异， 形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。3 .基因（gene）:是有功能的DNA片段，含有合成有功能蛋 白质多肽链或RNA所必学的全部核音酸序列，是遗传的结 构和功能单位。分为结构基因和调控基因。4 .结构基因：编码蛋白质或 RNA的编码序列 调控基因： 保证转录功能起调控作用的非编码序列5 .操纵子（operon）操纵基因与其控制下的结构基因共同组 成的功能单位6 .断裂基因：指基因的内部存在间隔区，间隔

2、区的DNA序列与该基因所决定的蛋白质没有关系。间隔区又称为内含子。出现在成熟 RNA中的有效区段为外 显子。7 .重叠基因：指基因的开放阅读框（ORF）存在一个或多个 核昔酸重叠的基因8 .跳跃基因：又称转座子，基因在染色体上的位置不固定， 能由一条染色体跳到另一条染色体上。9 .必须基因：生物体中存在的一些维持生物细胞生长所必需 的基因，缺少或突变这些基因均能导致生物体死亡10 .基因组（genome）:细胞中一套完整单倍体的遗传物质的 总和.11基因组结构主要指不同的DNA功能区在DNA分子中的分 布和排列12 .多顺反子（polycistron ）:操纵子中常常有一至多个功能 相关的结构

3、基因串连一起，受同一个调控区调控，转录在同 一个mRNA分子中。13 .黏性末端：基因组双链两端具有能够互补的单链DNA部分14 .末端正向重复序列：又称末端冗余，指病毒双链DNA分子两端有一段相同的核昔酸15 .末端反向重复序列（ITR ）:指病毒基因组两端的反向互补 重复序列16 .重叠基因：指两个或两个以上基因的ORF共有一段DNA 序列17 .分段基因：指病毒基因组由几条不同的核酸分子组成，多 冗于tDNA病毒，RNA病毒及双链RNA病毒18 .LTR:即长末端重复序列，逆转录病毒逆转录后生产的 dsDNA中，两端有LTR结构19 .DNA重组：是指将不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键

4、 将末端连接形成重组DNA.20 .DNA克隆（分子克隆）：将某一特定DNA片段通过重组 DNA技术插入到一个载体（质粒和病毒等）中，然后在宿主 细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片段的群体。21.限制性片段长度的多态性（RFLP：个体之间DNA勺核昔 酸序列存在差异，称为 DN够态性。若因此而改变了限制性 内切酶的酶切位点可导致相应的限制性片段的长度和数量发 生变化，称RFLP22.限制性核酸内切酶（RD :重要的工具酶之一。RE是一 类能识别和切割双链DNA寺定核昔酸序列的核酸水解酶.（水 解磷酸二酯键）23.DNA聚合酶I是从大肠杆菌中发现的第一个 DNA聚合 酶，分子量为

5、109000具有5 '3'聚合酶活性、3'5'核酸外 切酶活性、5'-3'核算外切酶活性的工具酶。24.Klenow片段：用特异性的蛋白酶可将 DNA聚合酶I裂 解为小片段与大片段，大片段即 Klenow片段，具有5'-3' 聚合酶活性及3'-5'外切酶活性，而失去了 5'一科切酶活 性，是分子生物学研究的常用工具酶25 .TaqDNA聚合酶：一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶。 具有5'一整合酶活性和依赖于聚合作用的 5'一科切酶活 性。（最佳作用温度是7080C , TaqDNA聚合酶可

6、用于DNA 测定及通过聚合酶链反应（PCR）对DNA分子的特定序列 进行体外扩增）26 .同工异源酶：在DNAk,来源不同但能识别和切割同一位 点的酶。27.逆转录酶：是具有依赖 RNA的DNA聚合酶活性、核酸 酶H的水解作用、以DNA为模版的DNA聚合酶作用的多功能酶。28 .末端脱氧核糖核昔酰转移酶（简称末端转移酶） TdT :在 二价阳离子存在下，催化d NT P转移到单链或双链 DNA 分子的3'-OH末端的工具酶。29 . DNA连接酶：催化双链DNA一端的3'0H与另一双链DNA5 '端的磷酸根形成3 ',5,一磷酸二酯键，将 具有相同黏性末端或平端

7、的两条双链 DNAf段连接起来，实 现DNA勺体外重组，其催化黏性末端连接效率要比平末端高 得多。30 .碱性磷酸酶：用于催化去除 DNA RNM dNTP上的5'-磷 酸基团的工具酶。31 .T4多核昔酸激酶：来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌. 包 括前向反应和交换反应。用于催化 ATP上的丫 -磷酸转移 到DNA链的5 /端上的工具酶.32 .核酸酶S 1 :可用于水解双链 DNA、RNA或DNA R N A杂交分子的单链部分的工具酶.33 .载体（vector ）:是携带靶DNA（目的DNA片段进入宿主 细胞进行扩增和表达的运载工具，本质为 DNA34 .克隆载体：能将目的基因在受

8、体细胞中复制扩增并产生大 量目的基因的载体称为克隆载体。35 .分子诊断主要特点：直接以疾病基因为探索对象，属于病 因学诊断，对基因的检测结果不仅具有描述性，更具有准确 性；可准确诊断疾病的基因型变异，基因表型异常以及由外湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！ 源性基因侵入引起的疾病；灵敏度高，便于早期诊断及疾病 预防；以基因分析为基础，特异性高。36分子诊断三个阶段：（第一个阶段：准备和酝酿阶段 1953 年前，蛋白质是生命的物质基础，DNA是遗传物质基础。（三 个实验：肺炎双球菌转化实验、体外转化实验、噬菌体转导 实验）、第二个阶段：DNA双螺旋结构、中

9、心法则、PCR技 术第三个阶段：2001年，首张人类基因组序列图谱及其他物 种基因组序列的公布。基因组分、蛋白质组学等方面的巨大 技术进步，促进进入第三阶段，即以生物芯片技术为代表的 高通量密集型技术。主要应用：感染性疾病、遗传性疾病、肿瘤的分子诊断， 个体化医疗，其他如耐药性、疗效监测，多基因疾病37 .四项生物技术：细胞融合技术，分子克隆技术，蛋白工程 技术，基因扩增技术38 .C值：基因组的大小，常用碱基数目或碱基对数目来描述 C值是特异的，物种不同，差异极大，真核生物中，一般随着进化，C值增大C值矛盾：又称C值悖论，生物的进 化程度与基因组大小不完全成比例的现象39 .真核生物基因组基

10、本特征：有细胞核基因组和细胞器基 因组之分；核基因组以线状 DNA分子的形式存在于染色 质上；基因多数为断裂基因，有内含子结构和大量重复序 列；单顺反子，基因家族；核基因组由染色体DNA组成，分子量较大，结构复杂，与蛋白质结合。40 .注意点：染色质的基本组成单位是核小体，由组蛋白核 心和周围的 DNA组成。组蛋白 H2A、H2B、H3和H4各2 个分子组成核心即组蛋白八聚体一个基因有 n个内含子， 则相应有n+1个外显子重复序列分为4类：单一序列、轻 度重复序列（210个拷贝）、中度重复序列（1012个拷贝）、 高度重复序列（1万以上）多基因家族：一些有编码功能 的重复序列，即指起源相同，序

11、列相似，功能相关的的一组 基因，分为基因簇（相对集中分布在某一染色体的特定区域） 和另一类基因家族成员在整个染色体上散在分布，甚至位于 不同染色体超基因家族：由基因家族和单基因组成的较大 的基因家族，结构不等的同源性，功能不一定相同假基因： 基因家族中有的成员因突变而失活，不能表达出有活性的产 物。41 .人类基因组计划（HGP）:旨在测出人类基因组30亿碱 基对的核昔酸序列，发现所有人类基因并确定它们在染色体 上的位置，破译人类全部遗传信息，发展基因组学新技术， 探讨人类基因组研究的社会法律与伦理等问题的一个国际性 研究项目。1）主要任务：人类的DNA测序，包括序列图谱、遗传图谱、 物理图谱

12、、转录图谱等的绘制 2）测序策略：经典的逐步克 隆法、全基因组鸟枪法3）人类基因组概貌：GC含量：平均41% （33%65%）CpG岛：即二核昔酸CG染色 体的重组率 基因突变率：男性多见重组序列的含量，包括SINE、LINE、LTR、卫星DNA、Tn等单核音酸多态 性（SNP）含量基因数量：2、6万一3、9万个蛋白质数 量：选择性剪接较多，使得蛋白质多而复杂疾病基因 人 基因组序列：99、99%相同4）人类基因组多样性：同一人 种或不同人种基因组存在或多或少的差异。通常DNA分子中某一特定位点的变异频率低于 1%为基因突变，高于1%为 DNA分子多肽。人类DNA分子多肽性的产生有以下几种主

13、要方式：重复序列单元的拷贝数变异，如微卫星DNA多态性转座因子导致的分子多肽，如Alu序列多态性单个 核昔酸的变异即SNP42 .原核生物基因组一般特点：基因组相对较小，通常为 一条双链DNA分子功能相关的基因高度集中，构成操纵 子重复序列少，大多数的蛋白质基因保持单拷贝形式， RNA基因常是多拷贝没有内含子，基因连续多顺反子， 构成转录单位绝大部分 DNA都是用于编码蛋白质的，只 有很少不编码序列DNA分子中有各种功能区43、质粒是多数细菌和某些真核生物细胞的染色体外的双链 环状DNA分子44 .遗传特性：双链环状DNA分子，且为共价闭合环状DNA （cccDNA）质粒复制有赖于宿主细胞的复

14、制， 但其自 身基因可控制合成的时限及拷贝数垂直传递不影响宿主细胞代谢，但可能赋予宿主细胞新的表型治理的复制方式为半保留复制。单向/双向，单向，双向。45 .特性：质粒的不相溶性：两种不同质粒如果利用同一复 制和维持机制，会在复制和随后向子代细胞分配的过程中相 互竞争，因而不能在同一宿主细胞内稳定存在，其中一种质 粒将被丢失的现象。这两种质粒属于同一不相容群（InC）。 质粒的稳定性：质粒在宿主细胞内能稳定存在不被丢失称 为质粒的稳定性。质粒的转移性。质粒的选择性标记。46 .质粒的拷贝数：在正常生长条件下，每个宿主细胞或每 条染色体所对应的平均质粒数。由其携带的复制子决定。 复制子是一个复制

15、单位，包括复制起点及其相关的调控元件。 质粒的复制由复制子与调节因子协同作用来启动。47 .松弛型质粒：以RNA为调节因子的质粒的复制不需任何 自身编码的蛋白质，完全由宿主细胞提供的寿命较长的酶 及其他蛋白质因子来完成，这些质粒的复制不受宿主细胞 的控制，以所谓的“松弛”方式进行。属高拷贝质粒。48 .严紧型质粒：携带与蛋白质调节因子相互作用的复制子的 质粒。属低拷贝质粒。49 .转座因子：又称可转座元件，指能在基因组中从一个位点 移至另一位点的DNA序列。1）转座现象或移位：指由可移动因子介导的遗传物质重排 现象。转座作用结果：a.导致宿主细胞基因组DNA的插入突变或基因重排，是毗邻基因失活

16、或表达水平下降。 b.转座 因子被认为是基因组进化的重要推动力量， 还可作为遗传 学研究及基因工程的工具。2）原核生物转座因子的种类：插入序列（IS）、转座子（Tn）、 可转移性噬菌体。IS: a.IS两端有正向重复序列（DR）和反向重复序列（IR）; b.IR结构的对称使IS既可正向插入靶位点，也可反向插入 靶位点；c.IS的中间位编码序列，仅编码与转座有关的酶， 含有依赖p因子的转录终止信号及终止密码，从而导致插入 位点的基因失活或表达水平下降。Tn :基因组中存在的能自主复制和位移的一些 DNA序列。 特点：a.两端有反向重复序列；b.转座后靶位点重复序列是正 向重复序列；c.编码与转座

17、有关的蛋白；d.可以在基因组中移 动。50.转座类型：复制型转座、非复制型转座。复制型转座：转座因子在转座过程中能够复制，结果是供 体与受体都有一个拷贝的转座因子。需转座酶和解离酶。非复制型转座：转座因子不复制，直接从一个位点移到另 一个位点，结果是供体失去一个转座因子而受体得到一个转 座因子。需转座酶。51.病毒基因组：1）特点：只有一种核酸，4种类型，为双 链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA核酸大小差 别较大（1.3X103bp3.6X106bp）具有启动子和操纵子结-10 -湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！ 构具有重叠结构2）结构：帽子

18、和 poly （A）尾结构，对 RNA起保护作用，并于病毒感染性有关52 .分子克隆技术中，常用的工具酶有：限制性核酸内切酶， DNA聚合酶I ,逆转录酶，DNA连接酶，碱性磷酸酶，多核 昔酸激酶等。53 .限制性核酸内切酶（RB命名：HindmH产生该酶的 宿主菌属名-大写，斜体in代表宿主菌的种名缩写一小 写，斜体d代表宿主菌的株或型-正体III代表同一种菌 株中不同限制酶的编号（按发现先后顺序）-罗马数字。回 问结构：通常是双链DNM子中按对称轴排列的反向互补序 列。星号活力：RE在非标准条件下，能切割一些与其特异识 别顺序类似的序列，酶的特异性降低，这种现象称为星号活 力，使用时应避免

19、产生星号活力。54 .DNA聚合酶.（1） DNA聚合酶I 和Klenow片段（2） TaqDNA聚合酶55 .Klenow片段的主要用途：补齐双链DNA的3'端，使3' 端标记；在cDNA克隆中，第二股链的合成；DNA序列 分析56 .逆转录酶：（多功能酶）功能：（1）依赖RNA的DNA聚 合酶活性，以RNA为模版，4种dNTP为底物（此过程称为 逆转录作用），催化合成DNA。（2）核酸酶H的水解作用（3） 以DNA为模版的DNA聚合酶作用湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！57 .末端脱氧核糖核昔酰转移酶（简称末端转移酶）TdT功能:

20、在载体或目的基因3'端上加上互补的多聚体尾，形成便于 重组的人工黏性末端用于 DNA片段3'端的同位素探针标 记58 .DNA连接酶主要有两者：大肠杆菌 DNA连接酶和T4噬 菌体DNA连接酶辅基分别为NAD+ （只能连接黏性末端）ATP （既能连接黏 性末端，又能连接平末端）重组DNA技术中常用T4噬菌体 DNA连接酶T4DNA连接酶最初来自受T4噬菌体侵染的大 肠杆菌，但目前的分离纯化手段已能快速而又简便的得到大 量高度特异性酶。注意：DNA分子磷酸二酯键的断裂称为切口（ Nick）,可以 用T4 DNA连接酶来修复。DNA分子中核酸缺失，称缺口 （gap）,不能单独用连接

21、酶来修复。59 .碱性磷酸酶（1）细菌碱性磷酸酶（BAP）一由大肠杆菌分离 出来的（2）小牛肠碱性磷酸酶（CIP）一由牛肠道分离出来的（两个催化去除DNA、RNA或dNTP上的5'-磷酸基团）主要用途：.除去DNA段上的5,磷酸，以防自身连接。.在使用T4多核昔酸激酶和32P同位素标记前，除去 RNA 或DNAk 5,端的磷酸，以便进一步用32P标记的r-磷酸重新 磷酸化，使5'端段被32P标记。60核酸酶Si的作用：.除去双链DNA勺黏性末端以生产平 末端。.除去cDN始成时形成的发夹结构。湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！.分析RNA

22、的茎环结构和DNA-RN粉子的杂交情况 等。载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色 体等多种类型。根据其用途分为克隆载体和表达载体61.克隆载体常有两种：质粒载体和噬菌体载体1 ）质粒载体复制特性：紧密型和松弛型（与宿主有关） 作为克隆载体的质粒具备特点：具有松弛型复制子；在 复制子外存在几个单一的酶切入点，以便目的DNA插入；具有插入失活的筛选标记，理想的质粒载体应具有两种抗 生素抗性标记；分子量相对较小和较高的拷贝数。质粒缺点：容量较小，一般只能接受小于15kb的外来DNA。 质粒克隆载体用途保存和扩增 2kb目的DNA构建cDNA 文库目的DNA勺测序作为核酸杂交时的探针来源

23、。目前常用的质粒有PBR322, PUC系列，以及由后者衍生而 来的PSP和PGEM系列等。PBR322系列载体特点：带有一个复制起始点具有 二个抗生素抗性基因具有较小的分子量具有较高的拷贝 数2） PUC18、PUC19质粒载体 2）噬菌体载体：入噬菌体载体、 M13噬菌体 噬菌体是指感染细菌的病毒，按其生活周期分为溶菌性噬菌 体和溶源性噬菌体1）入噬菌体包括插入型和置换型两类，其主要用途：用 作一般的克隆载体；用于构建一般的基因体或cDNA文湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！库（小于22kb）;用于抗体库或随机肽库的构建；核 酸的序列分析。3、表达载

24、体和穿梭载体讲的很少，了解它们的结构便可 P39-41.62 .分子克隆的基本步骤：目的基因的制备载体的选择和 制备目的基因与载体的连接重组 DN碍入受体细胞 目的基因的筛选和鉴定63 .目的基因的获取制备方法：（1）基因从文库中获取【基因 文库（G-文库）：是指含有某种生物全部基因随即片段的重组 DN“隆群。（C-文库）：将细胞的全部mRNAS逆转录制备出 全套的cDNA隆群】（2）逆转录合成cDNA3）人工合成DNA 片段（100bp） （4） PCR合成（5）直接从染色体DNA中分离 目的基因2）载体的选择：入噬菌体和黏性质粒载体常用来构建基因组文库，pUC系列常用于构建cDNAC库和克

25、隆较小DN* 段，M13噬菌体则用于克隆一些待测的 DNA列3）目的基因和载体的连接：平末端连接和黏性末端连接（容 易些）黏性末端DN吩子连接（目的基因或 DNA甫入片段与适 当的载体存在同源粘性末端）：用牛小肠碱性磷酸酶去除载 体的5'磷酸抑制DNA的自身环化，使它只能与未经碱性 磷酸酶处理的外源DNM段连接平末端连接法（质粒与目的基因无相同的酶切位点）有湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！以下几种方法T4DNA连接酶连接人工头连接通 过同聚尾连接4)将重组DNA导入受体细胞(1)重组DNA分子导入原核细胞目的基因与载体在体外连接成重组体后，需先

26、导入受 体细胞，常用的受体细胞是大肠杆菌。转化方法：Cacl2处理法电击法转化作用：将重组的DNA分 子引入细菌(原核细胞)，使其在细菌体内扩增及表 达的过程称为转化作用转染：将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的 DNA重 组体导入真核细胞的过程(2)重组DNA分子导入真核细胞Cacl2处理法 电击法聚聚乙二醇介导的转染法磷酸钙-DNA共沉淀法二乙胺乙基-葡聚糖介导的转染原生 质体融合脂质体法细胞核的显微注射法5)重组体的筛选和鉴定(1 )根据载体的性状变化进行筛选：筛选出转化菌， 筛选带重组体的克隆，对DNA重组体进行鉴别。根据载体的性状变化进行筛选根据载体抗药性标志插入失活选择3 -半乳糖普

27、酶系统根据插入的外源性DNA片段的性状进行筛选(2)根据重组DNA的结构特征进行筛选重组子大 小鉴别筛选限制性内切酶图谱进行分析 PCR湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！ 扩增方法进行鉴定核酸分子杂交方法进行鉴定 DNA序列分析鉴定64 .插入失活效应：选用含有两个以上的抗药基因的载体，外 源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活， 就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选含重组DNA 的菌落65 .核酸分子杂交基本原理：利用核酸变性和复性的性质，使 具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按照碱基互补 配对原则形成异质双链的过程。(可发生在

28、同源或异源的DNA链与DNA链之间，也可在 RNA链与DNA链) 66.核酸变性(denaturation ):指维系核酸双链互补碱基对之 间的氢链断裂变成单链的过程，并不涉及共价键的断裂。(黏 度减小，浮力密度增大，260nm处紫外吸收增加，活性降低) (热变形，酸碱变性，化学变性)67 .Tm (melting temperature ):通常把热变性过程中 DNA 变性一半所需要的温度成为融解温度。DNA的Tm值在8295c之间 Tm影响因素：DNA的均一性碱基组成 溶液的离子强度pH变性剂68 .DNA复性(renaturation ):当变性条件缓慢去除后，两条 彼此分开的互补单链重

29、新缔合成双螺旋结构的过程。(许多理 化性质恢复，但热变性后骤然冷却，DNA则不可复性)退火(annealing):热变性后，将温度缓慢降低而使 DNA 逐渐冷却即可复性的过程。湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！复性过程分两步：成核作用( nucleation )和拉链作用 (zippering)成核作用：两条核酸单链随机碰撞形成暂时局部双链，如果局部双链周围碱基不能配对，则迅速解离，重 新碰撞直到找到正确的互补序列，这个过程称为成核作用。 拉链作用：在成核的基础上，两条单链的其余部分碱基迅速 互补配对，就像拉链那样形成完整的双链分子。复性速度用Cot 1

30、/2衡量，Co:单链DNA的起始浓度(mol/L), t为时间(s), Cot1/2表示单链DNA的起始浓度与复性一半所需时间之积，与复性速度成反比，与 DNA复 杂度有关影响因素：DNA的分子大小和复杂度，离子强度， DNA的浓度，温度69 .探针(probe):广义上指的是能特异性与特定靶分子发生 相互作用，并能被某些方法所检测的分子。70理想探针的特点：高度特异性易于标记和检测灵敏度高稳定且制备方便71核酸探针：指能与特定靶基因序列发生特异性互补结合， 并可用特殊方法检测的被标记的已知核酸序列72核酸探针的种类：基因组 DNA探针、cDNA探针、RNA 探针、寡核昔酸探针1)基因组DNA

31、探针：制备方法：a.分子克隆b.采用聚合 酶链反应扩增特定的基因组 DNA片段优点：制备方法简 便、省时、易得，稳定不易降解，标记方法多样也较成熟 2)cDNA 探针：cDNA (complementary DNA ):指与 mRNA互补的DNA分子，它是以mRNA为模板，遵循碱基互补配 对原则，由逆转录酶催化合成 优点：具有基因组DNA优 点，且不存在内含子和其他高度重复序列，尤其适用于基因 表达研究（但制备困难）3） RNA探针：杂交效率高，杂交分子稳定，不存在高度重 复序列，非特异性杂交较少，不易标记，易降解4）寡核音酸探针：特点：a根据实验需要合成b.长度一般 为2050nt c.可以

32、识别靶分子的单个碱基变化 d.特异性不 高，杂交信号不强 设计原则：a.探针长度一般2050nt b. 剪辑成分，Gtc含量在40%60%为宜c.不应存在大于4bp 的互补序列d.避免同一碱基重复出现多于 4次e.同源性不 应超过70%或有连续8个上碱基同源73核酸探针的标记，两大类（1）放射性核素：最常用，灵 敏度和特异性极高，但半衰期短，检测时间长，污染环境（2） 非放射性核素：稳定、安全、经济、检测时间短，但灵敏度 74.理想探针标记物特点：高灵敏度标记物与探针结 合后，不影响碱基对的特异性，杂交体的稳定性及其Tm值。 检测方法应高灵敏度、特异、假阳性率低标记物与探针 结合后稳定，保存时

33、间长 标记物对环境无污染、对人体 无损伤、价格低廉。75放射性核素的标记物类型常用32P 35S 3H125I131I其类型特点：32P:比放射活性3.4X 1014Bq/mmol.最常用。放射性强，释湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！ 放的6粒子能量高，穿透能力强，灵敏度高，半衰期仅 14.4d, 射线散射严重而影像分辨率，影响结果分析。35s：比放射活性5.55 x 1013Bq/mmol.释放的3粒子较 32P稍低，半衰期 87.1d,灵敏度比32P低，散射作用弱，分辨率较高，适用于原 位杂交。3H:比放射活性1.07 x1012Bq/mmol,释

34、放的3粒子 能量较低，半衰期12.1年，采用延长曝光时间的方法可产生 本底低，分辨率高的结果，金庸与细胞原位杂交，可反复使用， 对环境影响大。1251、1311 :释放6粒子和丫射线，具有较高 敏感性，较强分辨率，危害性大。76放射性核素的标记标记法： 采用体外标记法，包括化学法和酶法1）化学法：利用标记物分子和探针分子上活性基团间的化 学反应，将标记物结合到探针分子的标记方法。2）酶法：预先将标记物标记在核昔酸分子上，经过酶促反 应将标记号的核昔酸分子或标记基因掺入或交换到探针分子 中的方法，有切口平移法，随机引物法，末端标记法，PCR标记法，体外转录法（1）切口平移法：DNaseI Mg2

35、+随机切割3'OH力口 d NTP（被标记）E.coliDNA聚合酶I全酶切除5'端的核昔酸 合成互补单链，适用于任何形式的双链 DNA但不适合单链 DNA和RNA （2）随机引物法：随机引物是人工合成的由 6 个核昔酸残基构成的寡核昔酸片断的混合物。模版 DNA变 性，加入随机引物在 Klenow酶催化加入d NTPs（一种被标 记），变性形成标记探针，适合单双链 DNA和RNA探针标记3）末端标记法：3'端标记法：模版 DNA经限制性内切 酶形成5'端突出的DNA, klenow酶+d NTPs变性得到3'端 标记DNA ,经变性成3'端标记

36、单链DNA探针 5'端标记 法；T4噬菌体多核昔酸激酶（PNK）标记法、碱性磷性磷酸 酶（ALP）切除5'端的磷酸基团PNK作用转移77 .非放射性核素标记：生物素、地高辛、光敏生物素、荧光 素、酶标法ALP和辣根过氧化酶（HRP） 核酸探针的纯化：乙醇沉淀法凝胶过滤色谱法核酸探针 的检测：（1）放射性：放射自显影 液体闪烁计数法（2） 非放射性：偶联反应、显色反应（酶促显色法、荧光法、化 学发光法）78 .核酸分子杂交的类型：固相杂交和液相杂交两大类1）液相杂交：将待测核酸样品和核酸探针同时放入杂交 液中进行反应，然后分离杂交分子和过量的未杂交探针，再 对杂交结果进行检测固相

37、杂交：预先将待测的靶核酸链固 定在固相支持物上，然后与溶解于杂交液中的核酸探针进行 杂交反应，洗去支持物上未参加反应的游离核酸探针，再检 测杂交信号，分析结果。2）常用固相杂交：Southern印迹杂交 Northern印迹杂 交、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、原位杂交Southern印迹杂交：指经凝胶电泳分离的待测 DNA片断 转印并结合到一定固相支持物（尼龙膜或硝酸纤维素膜），然 后用标记的探针DNA分子检测靶DNA的一种方法。湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！基本过程：限制性核酸内切酶消化待测DNA一琼脂糖凝胶电泳分离DNA片断-DNA变性并转

38、印到固相支持物上- 预杂交一与特异DNA探针杂交-杂交信号检测及结果分析 （转膜方法有毛细管转移、电转移、真空转移）Northern印记杂交：指待测 RNA （主要是mRNA）从 凝胶转印到固相支持物上，与标化的DNA探针进行杂交的印迹技术。与Southern印迹杂交不同点：a . RNA易被环境 中存在的RNA酶降解，应避免RNA酶污染 b. RNA需要 在变性剂（甲醛、乙二醛、甲基氢氧化汞）存在下进行电泳， 保持其单链状态，防止 RNA分子形成二级结构，不能用碱 变性c.印迹前将含有变性剂的凝胶用水浸泡除去。79 .聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR

39、）技术是 指生物技术领域中最重要的四项技术之一（细胞融合技术， 分子克隆技术，蛋白工程技术，基因扩增技术）特异，敏感， 高效，简便，重复性，移易化等优点。80 .PCR的原理：模拟体内DNA半保留复制过程，通过变性， 退火，延伸，三步反应的循环完成，靶基因的双链 DNA通 过变性解链为单链，特异的引物通过退火与单链 DNA模版 结合，在靶DNA的指导下引物的3'端延伸靶DNA的互补 链完成一个循环，理论上每次循环结束后靶 DNA扩增一倍， 即靶DNA数目以2?几何级数方法。（1）反应体系：模版 DNA,四种dNTP,引物，TaqDNA 聚合酶、缓冲液（含 Mg2+）（2）变性（dena

40、turation ）:模版DNA经加热至95c左右一 定时间后，使模版DNA双链或经PCR扩增形成的双 链DNA解离，使之成为单链。退火（annealling）:将 下降至适宜温度（一般较 Tm低5C）引物与变性的 DNA单链在碱基互补的基础上形成引物，模版杂交双 链。延伸（exension）:将温度上升至在 70 c左右时， TapDNA聚合酶催化以引物为起点的从5'3'端DNA 链延伸反应，随着4种dNTP的掺入，合成新的DNA 互补链。（3）动力学：y=A（1+R） ?估算PCR产量，A为起始模板量， R为扩增效率，有平台期81常见问题原因分析和处理（1）假阳性。靶 DN

41、A和非靶 DNA的污染（2）假阴性标本处理的原因PCR试剂问 题PCR扩增仪故障或扩增过程中的其他 PCR产物鉴定 的问题（3）引物二聚体两引物分子间有较多的碱基配对， 特别是引物3'端有互补区引物模版比例太高，可增加模版 用量退火温度过低循环次数过多（4）非特异性PCR产 物（5） PCR污染与预防（6） RNA酶的污染与预防去除 外源RNase污染抑制内源性RNase的活性82扩增产物的检测与分析（1）凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳， 聚丙烯酰胺凝胶电泳。（2） PCR产物的酶切技术：PCR限 制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP ） （3） PCR单链构象 多态性分析PCR-SSC

42、P （4）核酸探针杂交分析点杂交反湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！向点杂交微孔板杂交RNA探针杂交酶免疫分析Southern印迹杂交（5） PCR-酶联免疫吸附法（6） PCR产 物测序（双脱氧核昔酸链末端终止法、化学裂解法）83 .PCR衍生技术：巢式 PCR,逆转录PCR,多重PCR,锚 定PCR,反向PCR,免疫PCR,原位PCR,定量（QPCR） 巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR）,使用两对（而 非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对 PCR引物扩增 片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们 在第一次PCR扩增片段的内

43、部）结合在第一次 PCR产物内 部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式 PCR 的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能 在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式 PCR的扩增非常特异。84 .荧光定量PCR技术：1）基本原理：基于荧光能量传递技 术，通过对PCR扩增反应每个循环结束时产物荧光信号的检 测，对起始模版进行定量分析。85 .实时荧光定量 PCR（real time FQ-PCR ）:在荧光定量PCR 反应中，引物的荧光化学物质，在每经过一个循环后，产生 一个荧光强度信号，利用荧光信号累积及荧光强度变化实现 对整个PCR过程实现监测。荧光阈值：设定

44、在荧光扩增曲线上处于荧光信号指数扩增阶 段是的任意一个值，一般荧光阈值设置在3-15个循环内 湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系86 .荧光定量PCR技术：荧光染料法（常用染料：SYBBGreenl） 和荧光探针法探针法：TaqMan技术，LightCycler探针技术，分子信 标技术，复合探针法TaqMan技术:3端的荧光Q分子吸收5'端荧光R分子 的荧光信号/探针5'端连接的荧光R分子被Taq酶切割下 来/荧光R分子发出荧光，切割的荧光分

45、子数与PCR数量 成比例LightCycler探针技术：有R发光探针和Q淬灭探针 荧光淬灭的程度与起始模版数的量成正比分子信标技术：分子灯塔形成茎环发夹结构，使荧光剂 和淬灭剂紧密接触，导致荧光淬灭/单链寡核昔酸探针由 于与靶基因碱基序列互补而与之杂交/探针5'端和3'端分 离，淬灭剂对荧光剂的淬灭作用消失，产生荧光复合探针法：有R发光探针和Q淬灭探针 当PCR扩 增溶液无模版时，两探针特异性结合，无荧光；有模版， 荧光探针与模版结合，两探针分离，有荧光87 .实验区分为四个独立的工作区域：试剂贮存和准备区，标 本制备区，扩增区，扩增产物分析区四个基本原则：1.四个区域必须是相

46、互独立的，2.各区的仪器 设备及物品必须是专用的，3.各区不能直通，应设有缓冲间，湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！4.产物分析区产安装排风扇或其他抽风装置十六字口诀：各区独立，注意风向，因地制宜，方便工作。还应设立临床标本接收区88 .室内质量控制（IQC）包括测定前的质量控制，统计学质 量控制，质量控制的评价等89 . DNA序列测定：即DNA 一级结构的测定，指用人工的 方法测定并分析核酸的碱基组成及排列顺序。它是研究基 因结构，功能及其关系的前提，是临床疾病的分子诊断最 为精确的判定依据四种常用方法：Sanger双脱氧链末端终止法， Manxam

47、-Glibert化学降解法，焦磷酸测序技术，杂交测 序法（1） Sanger双脱氧链末端终止法原理：利用 DNA聚合酶， 以单或双链DNA为模版以d NTPs （一种被标记）为底 物，在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的2',3'-双脱氧核昔三磷酸（ddNTP）作为链反应终止剂，根据 碱基配对原则，在测序引物引导下，合成四组有序列梯度 的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙稀酰胺凝 胶电泳分离，放射自显影检测后识度待测 DNA的互补序 列（2） Manxam-Glibert化学降解法原理：首先对待测单或双 链DNA作末端（5'端或3'端）放射性标记，标记

48、后的DNA 分四组，分别用不同的化学试剂对不同的碱基进行特异性湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！ 的化学切割，通过控制化学反应条件，使碱基断裂只随机 发生在某一个特定的位点，由此各组均产生不同长度的 DNA片段，通过 （同上）90.自动化测序与传统方法比较1 .标化物不同：荧光染料（自动）放射性核素（传统）2监测手段不同： 扫描仪/PCR循环测序反应方法/集束话 的毛细管电泳放射自显影酶反应方法凝胶电泳特点：简便，快速，结果准确可靠，安全无污染，测序能力 增强91、生物芯片技术：指通过微加工和微电子技术，在固相基 质表面集成了成千上万密集排列的分子微阵列

49、，以实现对组 织、细胞、核酸、蛋白质及其他生物分子进行高效、准确、 高通量检测（微阵列芯片、微流体芯片）常用：基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片、液相芯片、缩微 芯片实验室等。92、基因芯片（Gene Chip）:又称DNA芯片，DNA微阵列； 将大量的基因片段有序的、高密度的固定排列在载体上制成 点阵，称之为芯片。其原理：经过标记的待测样品DNA通过与芯片上特定位置的探针按碱基配对原理杂交后，经激光 聚集荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过检测杂交信号强 度来获取样品分子的数量和序列信息，用计算机软件进行数 据比较和分析，从而对基因序列及功能进行大规模、高通量研究。主要包括四个基本技术环节：芯片微

50、阵列制备、样品制备及 标记、样品与基因芯片的杂交、信号的检测及 分析。93、蛋白质芯片：指固定于支持节制上的多肽或蛋白质构成 的阵列。据用途分：蛋白质功能芯片、蛋白质检测芯片。据 载体分：蛋白质微阵列、微孔板蛋白芯片、三位凝胶块芯片。 还可分：抗体芯片、抗原芯片、肽芯片、小分子芯片、适配 体芯片。94、组织芯片：也称组织微阵列（TMA ）,将成百上千个不 同组织标本按预先设计的顺序排列固定在一张载玻片上所成 的微阵列。95、液相芯片：又称悬浮阵列，流式荧光技术，是基于XMAP 技术的新型生物芯片技术平台。其核心技术是把微小的聚苯 乙烯微球用荧光染色的方法进行编码，然后将每种颜色的荧 光编码微球

51、共价交联上针对特定检测物的寡核昔酸或蛋白质 探针。优点：仅需少量样本即可同时定性、定量检测同一样本中 的多种不同目的分子一一最突出优点高通量、高效率灵 敏度高线性范围宽重复性好操作简单灵活性好96、缩微芯片实验室：又称微型生物全分析系统（ TAS） 把生物和化学等领域所（波 or谱：不认识）及的样品制备， 生物化学反应和检测分析的整个过程集成化，并缩微到一张湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！ 芯片上自动完成，形成所谓的微型全分析系统。97、分子诊断法：（目的物：病原微生物的 DNA或RNA） 对病原体特异性核酸序列的杂交，对病原体基因序列的限 制性内切酶

52、酶谱分析，限制性片段长度多态性连锁分析， 对病原体基因保守序列的扩增检测基因芯片技术，支链 DNA技术依赖核酸序列的扩增，连接酶链式反应等。乙型肝炎病毒：PCR临床意义：HBV感染的早期诊断，监 测治疗效果，判断病情，指导制订合理的治疗方案。结核分枝杆菌TB: TB DNA检测可采用PCR, FQ-PCR, 竞争性PCR,免疫杂交PCR等，PCRSSCP血红蛋白病两类：由于珠蛋白一级结构的变化所导致的异 常血红蛋白病；由于珠蛋白多肽链的组成比例改 变和珠蛋白含量降低所导致的地中海贫血镰状细胞贫血：0珠蛋白基因中第六位密码子的序列由原来 的GAC改变为GTG ,使对应的氨基酸由原来的谷 氨酸一缴

53、氨酸用RE酶切法诊断地中海贫血：分为a地贫，3地贫，Y地贫，S地贫，S3 地贫，丫 3地贫等（一）核酸的分离纯化与鉴定：1、核酸分离制备总原则：保证核酸一级结构的完整性 尽量排除其他的污染，保证核酸的纯度核酸提纯的主要步骤细胞裂解抽提分离核酸纯化核酸鉴定湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！2、完整性鉴定：可采用凝胶电泳法，DNA看是否拖尾，RNA为2:1的关系3、核酸的保存：双蒸水及 TE缓冲液储存DNA,醋酸钠 溶液或三蒸水、RNA酶储存RNA4、抑制剂：抑制DNase: A、柠檬酸、EDTA等金属螯 合剂 B、加去污剂SDS C、加蛋白变性剂 抑制RN

54、ase： A、高温高压灭菌或用 DEPC处理 B、加强的蛋白变性剂 C、加核糖核酸酶阻抑蛋白真核细胞的破碎方法有超声波破碎法、匀浆法、液氮破碎法、低渗等物理法和蛋白酶 K和去污剂温和处理法DNA分离纯化的方法：酚提取法、甲酰胺解聚法、玻棒缠 绕法5、技术路线的设计：(1)核酸的释放 目的：裂解细胞、 释放核酸物理方法：物理干燥法、冻融法、渗透压 调节法化学法：酶解法(2)核酸分离纯化：除去非核酸类大分子污染物不需要的核酸溶剂等(3)核酸的浓缩沉淀洗涤：多价阳离子沉淀， 70%-75% 乙醇洗涤(4)核酸的鉴定：紫外分光光度法检测核酸的浓度及 纯度(>0.25ug/ml)荧光分光光度法：澳

55、化乙锭染料 6、酚抽提法制备哺乳动物细胞 DNA (前处理一粗分离一 精分离)1)、EDTA、SDS等存在下用蛋白质酶K消化细胞湖北中医药大学09卫检"考试突击小分队” 2012岁末倾情奉献！2）酚-氯仿抽提含核酸的水溶液，除蛋白质 3）氯仿抽提， 取水相7、质粒提取方法：碱裂解法、煮沸裂解、SDS裂解、CsCl8、蛋白酶K-酚抽提法：（DNA）匀浆组织-（SDS、蛋白 一，.一一 .,、r I 离心、蛋白质.一._.酶K、EDTA）7酚氯仿抽提 喇DNA水相/有机相一取上层水相一乙醇沉淀一重溶解DNA9、异硫氟酸月瓜-酚-三氯甲烷一步法：（RNA）匀浆组织一苯酚-氯仿抽提一离心后取上层水相一乙醇沉淀-DEPC水重新溶解RNA （4'C/细胞裂解液、异硫氧酸月瓜、硫基乙醇、SDS）mRNA提取：Oligo（dt）-柱层析法实验区分为四个独立的工作区域：试剂贮存和准备区，标本制备区，扩增区，扩增产物分析区HGP图谱：包括序列图谱、遗传图谱、物理图谱、转录图谱等的绘制如何提高PCR