胃癌细胞表面,唾液酸糖链的表达与其侵袭、

1、胃癌细胞表面,唾液酸糖链的表达与其与侵染、转移相关性的研究 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 摘 要本设计为了研究唾液酸在胃癌发病过程中的相关作用，探讨,唾液酸糖链结构在胃癌发生中所造成的影响。设计内容主要分为两部分：,唾液酸糖链结构在不同分化程度的胃癌细胞表面的表达对胃癌细胞侵染能力相关性的研究；,唾液酸糖链结构对胃癌细胞的转移能力相关性的研究；第一部分分为两个实验设计用MAL细胞化学染色法选出阳性细胞计算出MAL胃癌细胞的阳性率和体外细胞粘附试验测得吸光度测试唾液酸跟细胞粘度的关系；第二部分通过重组基底膜实验来计数胃癌细胞的穿膜细胞数，确定,唾液酸对胃癌细胞的侵染、转移的影响。为

2、胃癌疾病的研究和治疗提供一定的理论及实验基础。关键词：,唾液酸；表达；胃癌细胞；侵染；转移目 录第一部分： 文献综述1 唾液酸11.1简介11.2唾液酸的生物学功能12 胃癌22.1胃癌发生的过程22.2胃癌的侵染、转移23 唾液酸与肿瘤作用33.1唾液酸与恶性肿瘤33.2唾液酸与胃癌44凝集素54.1简介54.2 MAL简介54.3 MAL对胃癌细胞表面糖链的标记6第二部分 课程设计部分1材料71.1细胞株及细胞培养81.2试剂81.3试剂配制91.4仪器设备92方法102.1 MAL细胞化学染色102.2 体外细胞粘附试验112.3 重组基底膜侵袭实验113 设计123.1 胃癌细胞表面,

3、唾液酸糖链结构与其转移能力的相关性123.2 胃癌细胞表面,唾液酸糖链结构与其侵染能力的相关性124 总结125 设计体会13参考文献152第一部分 文献综述1 唾液酸1.1简介 唾液酸是一种神经氨酸乙酰衍生物，广泛分布于体内各组织中，被认为是重要的肿瘤标志物，并在检测疗效、复发和预后判断等方面都有一定的价值。唾液酸是一类含个碳原子的羧基化单糖酰化衍生物的总称，在人体的唾液酸主要为N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸两种，大多由葡萄糖代谢生成。唾液酸广泛分布于真核细胞表面糖蛋白或糖脂的寡糖链的最末端，是细胞膜上糖蛋白、糖脂的重要成分1。体内大多是葡萄糖代谢生成，在血清中以糖结合和脂结合两种形式

4、存在。根据唾液酸与糖残基的连接方式可将其分为, 2,3-、 2,6-或 2,8-三大类。1.2唾液酸的生物学功能唾液酸具有的末端定位性及带负电荷两大特性，使他们对调节细胞间、细胞与间质、细胞与分子的相互作用有特殊意义，在机体生理、病理过程中发挥重要的作用。唾液酸化修饰屏蔽了与之相连的糖蛋白及糖脂结构，稳定细胞膜结构，提高了热稳定性，并保护细胞和大分子不受酶及免疫系统的攻击，从而起保护细胞的作用。很多恶性肿瘤细胞和一些病原体则利用唾液酸修饰，逃避机体免疫监视和攻击。唾液酸作为识别为点，参与细胞识别及信息传递。唾液酸可被选凝素、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族等粘附分子识别。也是一些信号分子、病

5、原体如流感病毒的作用位点。表面唾液酸话使得细胞外表面带负电荷，有利于与带正电荷的物质结合，从而参与细胞水盐代谢、物质转运等生理过程。带负电荷的唾液酸具有亲水性，在周围形成很大的水合半径，造成细胞间距离的增加，并通过电荷排斥阻止分子间相互作用，所以说唾液酸对分子间甚至细胞间的相互作用都有潜在的抑制作用2 。这种特性可阻止血红细胞的凝聚、粘附，有利于细胞的迁移，对于人体的生理活动、生长发育有重要意义。唾液酸化修饰是生命活动所必需的，有实验证实抑制唾液酸的生物合成对幼鼠是致命的3。唾液酸在脑中的含量很高，它能够促进神经细胞的分化、发育和再生，参与突出的传递，参与记忆和学习功能，机体发育阶段各种组织唾

6、液酸表达水平较高。而在成年人的组织中则为低表达，如成年人组织中出现唾液酸化水平升高，则提示发生病变的可能。2 胃癌2.1胃癌发生的过程胃癌是最常见的恶性肿瘤，我国的病人主要以进展性胃癌为主，确诊时绝大多数已经发生转移，这是造成治疗失败的主要原因之一。因此，研究胃癌细胞的侵袭转移机制，早期发现和预测癌的转移、观察治疗效果和评价预后是胃癌研究的重要内容。与大多数肿瘤相类似的是，胃癌的侵袭与转移机制也极其复杂，参入的因素非常多，包括与细胞质/核有关的因素，细胞膜及表面结构的改变等，是一个多步级联过程。其中主要包括以下步骤：癌细胞从原发灶脱落；与细胞外基质(Extracellular matrix，E

7、CM)、基底膜(Basement membrance，BM)发生粘附并降解；穿越血管壁进入循环并到达远处部位；肿瘤血管形成；在继发部位不断增殖形成转移灶。在这些多步骤的动态、连续的侵袭转移过程中，癌细胞由原发灶脱落，是肿瘤发生侵袭转移的始动因素4。2.2胃癌的侵染、转移肿瘤细胞游走性增加，即肿瘤细胞之间及与周围组织粘附作用的减低是肿瘤细胞由原发灶脱落的主要原因。而粘附作用的减低又主要与肿瘤细胞表面糖蛋白糖链结构的改变有密切关系5。细胞膜糖蛋白是蛋白质和寡糖链(糖链)的共价复合物，其糖链在维持细胞分化、功能和形态方面起着非常重要的作用。一旦细胞膜表面糖链结构发生异常变化，就预示着其基本的生物学行

8、为发生了改变6-9，尤其在细胞的粘附、运动、分子识别及细胞识别等基本功能方面的改变，与肿瘤细胞的恶性增殖和转移有直接关系陋10。因此，研究细胞膜表面糖蛋白及糖链结构变化对于揭示肿瘤细胞的侵袭与转移是非常重要的。胃癌致死率高的两个重要因素是胃癌患者确诊时多数处于中晚期以及缺乏有效的治疗手段。胃癌患者治疗失败和致死的主要原因就是肿瘤的侵袭和转移。胃癌发生侵袭和转移是一个多基因、多阶段、连续复杂的过程，这一过程包括肿瘤细胞从原发灶脱离，穿越基膜及细胞外基质浸润迁移并进入血管，黏附于血管内皮，进入循环系统并随血流到达远处，穿出血管侵入细胞外基质并形成转移灶。癌细胞脱离原发灶后，穿越组织屏障是转移的关键

9、步骤。细胞外基质和基膜(BM)是肿瘤生长和扩散的自然屏障，细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)主要成份由胶原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基葡聚糖组成。ECM在上皮或内皮细胞的基底部，即以基底膜2usememmembranes，BM)的形式存在，在细胞间结构以间质结缔组织形式存在11。肿瘤细胞的侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动的相关基因及其表达调控模式的改变和促进细胞移动的外界因素两者的共同作用。虽然肿瘤细胞侵袭的分子机制还不是十分清楚，但已发现许多调控细胞侵袭转移的关键分子及其信号通路。肿瘤细胞通过其表面受体与ECM中的各种成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶类来降解基质，从而形成

10、局部溶解区，构成了肿瘤细胞转移运行通道。一般恶性程度高的肿瘤细胞具有较强的蛋白水解作用，可侵蚀破坏包膜，促进转移。目前研究认为，MMPs不但介导肿瘤细胞对宿主细胞外基质的降解，还控制肿瘤新生血管的生成，影响细胞黏附分子的功能及调控肿瘤细胞的生长等。而肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移所必须的，被认为是很重要的预后因素11。3 唾液酸与肿瘤作用3.1唾液酸与恶性肿瘤有关恶性肿瘤与唾液酸关系的研究是从发现恶性肿瘤血清唾液酸升高开始的。早在1955年，Winzle等首次报道，恶性肿瘤患者血清唾液酸升高。上世纪七十年代，国外学者们通过动物实验及人体肿瘤研究，证实一些恶性肿瘤个体血清唾液酸水平异常升高。到上世

11、纪九十年代，唾液酸开始作为血清肿瘤标志物用于临床。尽管血清唾液酸水平升高的机制尚未完全明确，但目前的研究普遍认为这是由癌变细胞过表达的唾液酸大量脱落入血所致。在一些非肿瘤性病变中，血清唾液酸也可能会升高，如：感染、炎症等，但一般而言，其升高幅度远较恶性肿瘤的为小，而且作有效抗感染治疗后可下降至正常。众多的研究提示恶性肿瘤患者血清唾液酸升高程度较非肿瘤性病变的大，所以尽管血清唾液酸对恶性肿瘤的诊断并非特异性，但具有较高的敏感性，联合检测血清唾液酸及其他肿瘤标记物对恶性肿瘤的筛查、早期诊断有很大的临床意义。有文献报道,血清唾液酸水平与肿瘤恶性程度、肿瘤临床分期相关,分化越低、分期越晚血清SA水平越

12、高;作有效治疗后血清唾液酸可下降，肿瘤复发、转移后又上升，提示血清唾液酸不但可作为恶性肿瘤辅助诊断的指标，还可作为病情发展、肿瘤消长的监测指标。然而，血清唾液酸检测并不是直接检测细胞表面的唾液酸表达情况，不能深入了解肿瘤细胞唾液酸表达的具体情况12。3.2唾液酸与胃癌细胞癌变过程中常伴有细胞膜表面糖蛋白N-糖链结构的异常改变，其中肿瘤细胞表面唾液酸化水平增加与肿瘤的恶性进展及早期转移有密切联系。有关唾液酸在人胃癌细胞表面表达的特异性及其临床意义的研究，国内外相关报道较少。唾液酸在胃癌细胞表面的表达与胃癌侵袭、转移潜能之间的相关性，尚有待进一步研究与探讨。利用能够特异性识别、结合NeuAc 2,

13、3Gal1,4GlcNAc/Glc唾液酸结构的朝鲜槐凝集素，检测2,3唾液酸在胃癌组织及其转移性淋巴结以及大肠癌组织中的表达。化学上，当糖链结构的末端连接上唾液酸便意味着糖链延伸的终止。因此，唾液酸一般是糖链末端结构。研究发现，SA是血清糖蛋白与糖脂生物效应的重要成分，在细胞的恶性转化中起特殊作用。而血清中存在一种新蛋白脂质，是含唾液酸的糖脂，是神经节甘脂的衍生物，而正常人缺少这种糖脂或含量甚微。这类糖脂结合唾液酸的异常升高与恶性肿瘤的发生密切相关。肿瘤细胞的转移和细胞表面糖复合物的异常表达特别是糖复合物末端的唾液酸化改变密切相关。由于它位于糖链末端并携带负电荷，唾液酸对分子之间甚至细胞间的相

14、互作用都有潜在作用。一方面唾液酸可通过增加肿瘤表面负电荷和掩盖其表面抗原，从而有利于肿瘤细胞在血液循环中逃避宿主免疫细胞的杀伤；此外，唾液酸的聚积，能够直接影响糖链分子的连接，增加细胞之间排斥性，可使得肿瘤细胞之间及与周围组织的粘附性降低，细胞容易由原发灶脱落而发生转移。胃癌细胞表面异常唾液酸化的发生可能是由于,唾液酸转移酶表达水平增加或活性增强，导致这种带负电荷的,唾液酸糖链结构在肿瘤表面增加，从而使得肿瘤细胞之间的粘附力减弱，转移能力增强。因此研究其细胞表面糖蛋白糖链结构特点，将有助于从新的角度探讨胃癌发病机制，为临床诊断及预测预后提供实验和理论依据。研究胃癌细胞表面MAL特异性识别、结合

15、的糖蛋白糖链结构特点，有可能利用这些特异性糖蛋白作为靶点或抗原，研制、开发其抑制剂或单抗，通过对末端糖链的修饰作用，消除或降低肿瘤细胞的恶性转移或侵袭性能，为临床提供新的治疗方法13。4凝集素4.1简介凝集素是一类糖结合蛋白，广泛分布于各种有机体中。凝集素的最大特点是能专一的识别糖蛋白或糖脂中某一特定的单糖或寡聚糖中特定的糖基序列而与之结合14。细胞膜及细胞浆内存在凝集素受体，正常情况下这种凝集素受体相对稳定，当细胞恶变时，受体的数量和性质随机改变。利用凝集素具有与特定糖基转移性结合的特性，将其作为分子探针检测肿瘤细胞表面及细胞内糖基受体的分布，研究肿瘤细胞的恶性进展和侵袭、转移情况，对于肿瘤

16、的早期诊断、监控肿瘤进展及评价预后具有重要的临床价值13。4.2 MAL简介植物凝集素MAL是从植物朝鲜槐的种子中提取的一种糖结合蛋白，是一种有效的淋巴细胞有丝分裂促进剂。研究发现MAL对NeuAc 2,3Gal1,4GlcNAc/Glc这一完整的三糖结构具有特异性识别与结合作用，且MAL仅能够识别N-型糖链的末端唾液酸，MAL仅对胃癌细胞表面糖链结构有特异性结合反应，而在正常胃粘膜细胞表面无MAL识别的糖蛋白糖链结构NeuAc 2,3Gal1,4GlcNAc/Glc的表达15、16。近年来被广泛的应用于检测和分析肿瘤细胞表面唾液酸水平的改变。4.3 MAL对胃癌细胞表面糖链的标记胃癌细胞表面

17、存在MAL特异性识别并结合的NeuAc 2,3Gal1,4NAc/Glc糖链结构，且这一糖链结构仅存在于胃癌组织的细胞表面，在正常胃粘膜细胞表面无表达。此外，2,3唾液酸与胃癌的侵袭深度及淋巴结转移有显著相关性。胃癌细胞表面出现的这一唾液酸水平的改变以及这种改变与胃癌侵袭、转移潜能之间的相关性，其生物学机制迄今仍然未知，国内外文献对其亦鲜有报道。在目前研究中，检测了几种胃癌细胞表面2,3唾液酸的表达水平，并对其表达与胃癌细胞的侵袭、迁移潜能之间的相关性做了进一步研究。2,3唾液酸在三种不同胃癌细胞表面的表达存在差异，且均显著高于正常胃粘膜细胞。此外，细胞表面唾液酸化水平最高的C-7901表现出

18、更强的与人工基膜Matrigel的粘附能力和侵袭、迁移能力。第二部分 课程设计部分 胃癌细胞表面,唾液酸糖链表达与其 侵袭、转移相关性的研究胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、发展迅速、死亡率高的特点。在我国许多地区的恶性肿瘤死亡统计中，胃癌多居前位，往往一经发现已经处于中晚期，失去了手术根治的机会。因此，早期发现和科学诊断胃癌的发生是胃癌研究的重要内容。胃癌的的侵染、转移成为胃癌疾病研究的一个重要方向。研究表明胃癌细胞的转移主要是因为肿瘤细胞游走性增加，即肿瘤细胞之间及与周围组织粘附作用的减低是肿瘤细胞由原发灶脱落的主要原因。而粘附作用的减低又主要与肿瘤细胞表面糖蛋白糖链结构的改

19、变有密切关系5。其中肿瘤细胞表面唾液酸化水平增加与肿瘤的恶性进展及早期转移有密切联系。有关唾液酸在人胃癌细胞表面表达的特异性及其临床意义的研究，国内外相关报道较少。所以本实验通过用凝集素对胃癌细胞表面唾液酸的检测，细胞粘附性检测和胃癌细胞在重组基底膜中的转染来研究唾液酸与胃癌细胞侵染、转移的相关性，为研究胃癌药物研究提供理论基础。1材料1.1细胞株及细胞培养人中分化胃腺癌细胞SGC-7901以及人低分化胃腺癌细胞BGC-823由中科院上海细胞生物研究所提供。人高分化胃腺癌细胞MKN-28和人正常胃粘膜细胞GES-1由北大医学部细胞生物学教研室提供。SGC-7901、BGC-823和MKN-28

20、生长于含1096小牛血清的RPMI一1640培养液中，GES-1生长于含1096胎牛血清的高糖DMEM培养液中。1.2试剂 药品厂家 生物素标记MAL(Biotin-MAL)Vector，美国 小牛血清白蛋白北京中山生物科技有限公司 辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记链霉卵白素 北京中山生物科技有限公司 苏木素福州迈新生物技术开发有限公司 DMEM培养基Gibco，美国 RPMI 1640培养基Gibco，美国 胰蛋白酶Gibco，美国 , sialyllactoseSigma，美国 新生小牛血清兰州民海生物技术有限公司 胎牛血清JRH bioscien

21、ce，澳大利亚 异硫氰酸荧光素标记MAL laboratori es，美国 DAB显色试剂盒北京中山生物科技有限公司 MatrigelBecton Dickinson，美国 纤粘连蛋白(Fibronection，FN)北大医学部病理学教研室 结晶紫中国远航试剂厂 Transwell小室Corning Costar，美国 96孔、24孔培养板Corning Costar，美国 1.3试剂配制1.3.1 D-HankS液配制NaCl 8.0gKCl 0.4gNa2HP0412H20 0.12gKH2P04 0.06g无水葡萄糖 1.0g双蒸水加至 1000ml将上述溶液用NaHCO3。调节pH至7

22、.2-7.4，分装，于121高压蒸汽灭菌30，-20以下冰冻保存。1.3.2 0.25%胰蛋白酶溶液配制胰蛋白酶粉 2.5gD-HankS液加至 1000ml将上述溶液用NaHCO2。调节pH至7.2.-7.4，用0.22um微孔滤膜滤过除菌，无菌分装，-20以下冰冻保存。1.3.3 0.4%台盼蓝溶液配制台盼蓝粉 0.4gPBS液加至 l00ml 将上述溶液加热使之完全溶解，用滤纸过滤除渣，装入瓶内室温保存。1.3.4 0.1%结晶紫溶液配制结晶紫粉 0.1g20%甲醇溶液加至 l00ml将结晶紫粉完全溶解，用滤纸过滤除渣，装入瓶内室温保存。1.4仪器设备仪器 厂家 型号倒置显微镜 NIKO

23、N，日本 ECLIPSE TE2000一S倒置生物显微镜 重庆光学仪器厂 XDS-1B二氧化碳培养箱 美国SHELLAB 2406-2 多功能酶标仪 广州云星科学仪器有限公司 LB940电子恒温水浴锅 黄骅市卸甲仪器厂 DZKW-C电热干燥箱 青岛铁器二厂 Te202-1净化工作台 苏州净化设备厂 SW-CJ一2F立式压力蒸汽灭菌器 上海中安医疗器械厂 LDZX-50KBS电子分析天平 Shimadzu，日本 AWl20托盘式扭力天平 上海第二天平仪器 TN-IOOB湿盒 北京中山生物科技有限公司2方法2.1 MAL细胞化学染色2.1.1 细胞玻片的处理将盖玻片置清洁液中浸泡过夜，自来水冲洗2

24、0遍，双蒸水冲洗3遍，烘干后高压消毒，然后放入24孔培养板内备用。2.1.2 细胞消化取指数生长期细胞，PBS洗细胞两次，用0.25%胰蛋白酶消化，加入含10%小牛血清的RPMI 1640培养液或含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，轻轻吹打成单细胞悬液。2.1.3 接种、染色调整各细胞浓度为1×105/m1，接种于载有盖玻片的24孔板内，每孔接种lml，每种细胞设3个复孔，置370C、5%C02培养箱内常规培养。待细胞爬满盖玻片后，从培养箱内取出培养板，PBS洗3次，每次3分钟，4%多聚甲醛固定30min。将盖玻片浸入到0.75%H202/PBS溶液中，370C孵育3分钟，以阻断内

25、源性过氧化物酶。PBS洗，每张盖玻片滴加1%BSA 50 ul，370C孵育30min以消除非特异性染色。弃去BSA溶液，每张盖玻片滴加50 ul Biotin-MAL(4 pg/m1)，370C孵育1h。PBS液振洗，每张盖玻片滴加HRP标记的链霉卵白素，室温孵育30min。滴加DAB显色剂，显微镜下观察显色情况。水洗，苏木素复染，流水冲洗3min，以洗去未与组织结合的染液。盖玻片经梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照：用PBS缓冲液代替Biotin-MAL，其余步骤不变。2.2.4 结果判断及分析显微镜下观察并拍照(×400)，以细胞膜或细胞浆内出现棕黄染色者判断

26、为阳性。按照上、下、左、右、中五个视野分别计数总细胞数和阳性细胞数，计算不同细胞株MAL的阳性率。. 体外细胞粘附试验在96孔板中分别加入含Matrigel 2ug的RPMll640培养液50u1，抽气干燥备用。每孔加入含3%BSA的无血清培养液20u1，370C孵育1h。每孔加入200u1PBS，振摇冲洗10min。弃去PBS，每孔加入50u1 0.04%结晶紫染液，静置20min。弃去结晶紫染液，PBS洗三次以去除剩余染液，显微镜观察并成像(×200)。每孔加入10%冰醋酸100u1抽取结晶紫染液10min，于多标记分析仪560nm处检测吸光度值。. 重组基底膜侵袭实验2.3.1

27、 包被基底膜Transwell 小室上室面包被Matrigel 5ug，在下室面铺10u1FN，4风干。2.3.2 水化基底膜每个小室加入250u1预温的含1%BSA的无血清培养液，37孵育30min，使基质胶水化，弃去剩余培养液。2.3.3 接种细胞制备细胞悬液前先将细胞撤血清饥饿12d,时，进一步去除血清的影响。取胃癌细胞,台盼蓝染色,检查活细胞比例为95%以上。将细胞悬浮于含0.1%BSA-RPMI 1640培养液中。调整细胞浓度为1×106/ml。将细胞悬液加到Transwell小室，每小室100ul，每种细胞设三个复室。将24孔板各孔内加入600ul含0.1%BSA的RPM

28、ll640培养液，将小室浸入含有培养液的24孔板中，置于5%CO2培养箱内，37常规培养8d时。2.3.4 细胞染色取出小室，用棉签仔细擦去Matrigel基质胶和上室面未侵袭的细胞。以4%多聚甲醛固定20min ，0.1%结晶紫染10min ，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，用中性树胶将膜封于载玻片上。2.3.5 穿膜细胞计数显微镜观察并成像(×400)，计数10个视野侵袭细胞的数量，取其平均值为每种细胞的侵袭转移数量。2.3.6 统计学分析采用单向方差分析评价体外细胞粘附实验及重组基底膜侵袭实验结果，SPSSl1.O统计学软件进行分析。3 设计3.1 胃癌细胞表面,唾液酸糖链结构

29、与其转移能力的相关性 胃癌细胞表面,唾液酸的检测。高度分化、中度分化、低度分化的胃癌细胞和正常胃癌细胞进行实验，将实验分为4组，每种细胞作为一组，用Biotin-MAL对细胞进行侵染，在显微镜下进行观察。用PBS液代替Biotin-MAL对细胞进行侵染，作为阴性对照组，其他条件不变，统计出各种细胞的MAL阳性细胞数，计算出各种细胞的MAL阳性细胞率。 实验分为4组，将四种细胞在RPMll640培养液培养一定时间，用结晶紫染色，在显微镜下进行观察，并用分光光度计检测出各种细胞的吸光度，来区分他们与EMC的粘附能力。粘附能力强的转移能力强，通过两个实验的结果对比分析，看,唾液酸在不同胃癌细胞表面的

30、表达与ECM粘附能力是否有关。3.2 胃癌细胞表面,唾液酸糖链结构与其侵染能力的相关性 实验分为四组，用重组基底膜接种四种细胞，将重组基底膜放到培养基中进行培养一段时间，在显微镜下进行观察，统计出细胞的转移数目。用不同种细胞的转移数同上述MAL细胞化学染色的结论进行对比分析，看,唾液酸与胃癌细胞侵袭是否有关。4 总结胃癌细胞表面唾液酸的检测选用MAL凝集素是因为MAL对NeuAc ,Gal1,4GlcNAc/Glc这一完整的三糖结构具有特异性识别与结合作用，且MAL仅能够识别N-型糖链的末端唾液酸，MAL仅对胃癌细胞表面糖链结构有特异性结合反应，而在正常胃粘膜细胞表面无MAL识别的糖蛋白糖链结

31、构NeuAc , Gal 1,4 GlcNAc/Glc的表达，能够明显的区分出胃癌细胞和正常细胞。所以凝集素的选用非常重要。此结果还可以通过用流式细胞仪进行检测。唾液酸在胃癌细胞表面特异性表达，对胃癌细胞的侵袭、转移非常重要。通过用体外粘附能力的测定来测定细胞的转移的能力。体外细胞粘附实验测定的为细胞和之间的粘性，粘性越大细胞随的流动能力强，细胞的转移能力就会增加。胃癌细胞的侵染是侵染其它细胞，穿过其它的细胞膜，所以细胞的侵染能力的测定过程中模拟细胞的生理环境非常的重要，因此选用基底膜的包被，此实验对基底膜的选用和处理非常重要。5 设计体会本次课程设计我选择的设计题目是胃癌细胞表面2,3唾液酸

32、糖链结构的高表达及其与胃癌细胞的转移的相关研究 ，课程设计期间，紧张而充实，我们查阅资料文献、阅读文献、提出自己的设计方案、撰写设计论文、修改实验论文在此期间虽然遇到很多的问题，但是我们从中也学习到了很多关于癌症的相关知识。我之所以选择胃癌细胞的相关问题为这一设计课题是因为现在胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一。在我国许多地区的恶性肿瘤死亡统计中，胃癌多居前位，我们周围就有很多胃癌患者，而胃癌之所以很难治愈是因为胃癌的起病隐匿，一般发现症状很多都是胃癌晚期不再适合做手术，无法医治，而且胃癌的发展非常迅速，死亡率高，而癌症的最大问题所在是因为胃癌细胞的扩散问题。通过查阅资料，我了解到胃癌细胞的侵染

33、、转移的研究是一个潜在的研究方向。在设计过程中我遇到了几个难题，目前国内有关癌症转移的为题研究还不是很明确，参考资料还不是很多。后来随着参考资料的进一步阅读和理解，还有和同学的讨论，最终提出和完成了自己的设计方案，此外在设计过程中和设计方案的书写过程中也遇到了问题，在什么是方法什么是设计，方法和设计之间有什么区别，该如何书写方法和设计，这一问题让我很伤脑筋，最终通过和同学的讨论决定用本设计的书写方式。在书写论文的时候在排版格式和内容上和老师所给模板有所出入，经过再三的修订最终定稿。如今，这门课程马上要接近尾声了，看着自己这些天通过奋斗设计的成果，在欣慰的同时也认识到自己的不足。这门课程设计对我

34、来说是一次学习和提高的经历，他将会激励我今后更加努力得学习和丰富自己。在此次学习课程中，我将以往那些学到的专业知识得意加强和综合，更有助于我们下一步的学习。这次课程设计不仅提高了我的专业知识，提高自己的思维动手能力，同时也提高了我的计算机水平。这次课设对我来说是一个非常难得的学习机会，对此我非常感谢学校给我们开设了这门课程和赵红卫老师对我们的悉心指导，让我受益匪浅。也感谢我的同学在我设计过程中给予的帮助和支持，在此对他们表达我真挚的谢意！参考文献1 Varki A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recog

35、nizing proteinsJ. Nature, 2007, 446: 1023-1026.2 Varki A. Sialic acids as ligands in recognition phenomenaJ. FASEBJ, 1997, 11(4):248-255.3 Fukuda M. Possible roles of tumor-associated carbohydrate antigensJ. Cancer Res,1996, 56(5): 672-679. 4 崔淑香. 胃癌细胞表面,唾液酸糖链结构高表达与胃癌袭相关性研究D. 山东: 山东省医学科学院, 2008.5 Fan X, She YM, Bagshaw RG, Callahan JW eta1. Identification of the hydrophobic glycoproteins of Caenorhabditis elegansJ. Glycobiology, 2005, 15(10): 952-964.6 Oube DH. Bertozzi CR. Glycans in cancer