细胞复苏及细胞鉴别与计数

1、 细胞生物学实验报告细胞复苏及细胞鉴别与计数 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： Part1、细胞复苏一、实验原理细胞复苏是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。复苏细胞原则：快溶。防止在融化过程中已融解水渗透入细胞导致的二次结晶对细胞形成损害。使培养物能快速通过对细胞有损害的50摄氏度区域，细胞仍能生长，活力受损不大。二、实验目的掌握细胞复苏的基本方法三、实验器材（1）仪器  CO2培养箱，显微镜、倒置显微镜，超净台 （2）材料  培养瓶，试管，移液管，废液缸

2、，75%酒精棉球，酒精灯，冻存的Hela人宫颈癌细胞，滴管（3）试剂  完全培养基（DMEM），小牛血清，双抗四、实验步骤1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯40的温水。2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟内融化。3、将冻存管放入离心管中800rpm离心10分钟，取出冻存管拿入超净台中，75%酒精消毒管口，打开冻存管，弃上清。4、沉淀加1ml完全培养基吹打细胞使之均匀，将细胞转移至25ml培养瓶中，补加3ml新鲜培养基于干净培养瓶中培养。5、另取90微升细胞悬液于1.5ml离心管中，再加入10微升0.4%台盼蓝染色,取80µ

3、l细胞液镜下观察活力。6、再向上述培养瓶中加入4ml10%含FCS及双抗的DMEM培养基，轻轻混匀，显微镜下观察。盖上瓶盖, 去倒置显微镜上观察细胞形态。做好标记。将瓶盖适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。7、将用过的试剂仪器等摆回原处，将超净台打扫干净，关闭照明灯及抽风机。8、实验后数小时后去观察细胞生长情况，并拍摄照片。五、实验结果传代后在显微镜下可看到细胞呈悬浮状态，全部为单个的分散的细胞。复苏后大部分细胞生长状态良好，透明度大，细胞内颗粒少，没有空泡,细胞形态完整。也存在少数颜色较暗的死细胞，无立体感，细胞通透性差，有颗粒状物质。 我们5小后对复苏后的

4、人宫颈癌Hela细胞进行拍照，可观察到细胞复苏效果较好，多数细胞处于开始贴壁状态，细胞呈现扁平或梭型，透明度较好。仍有少数细胞成悬浮状态，未贴壁 （冻存的人宫颈癌Hela细胞复苏 倒置显微镜20×）Part2、细胞的计数与死细胞的鉴别一、实验原理 细胞计数方法：血球计数板。 血球计数板：由一块长约7.5cm，宽3.5cm的厚玻璃制成。计数室的边长为1mm，中间平台下陷0.1mm，盖上盖片后计数室的容积为 0.1mm3。所以，可根据在显微镜下观察到的细胞数目，换算成单位体积中细胞的数量。 细胞计数：细胞压格计上线不计下，计左不计右，如有少量两个以上细胞按一个细胞计数，如超过10%说明消

5、化不充分。 通常认为细胞膜丧失完整性,细胞即可被认为已经死亡.台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂.健康的正常细胞能够排斥台盼蓝,而死亡的细胞,膜的完整性丧失,通透性增加,细胞可被台盼蓝染成蓝色.依据此原理,细胞经台盼蓝染色后,可通过显微镜,直接镜下计数或拍照后计数,实现对细胞存活率比较精确的定量分析.二、实验目的1、掌握用血球计数板进行细胞计数的方法。2、学习死活细胞的鉴别方法三、实验器材（1）仪器 CO2培养箱，显微镜、倒置显微镜，超净台 （2）材料 培养瓶，试管，移液管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，冻存的Hela人宫颈 癌细胞，滴

6、管、血球计数板（3）试剂 完全培养基（DMEM），小牛血清，双抗，台盼蓝染料四、实验步骤1、检查记数板：在正式计数前，先用显微镜检查记数板的计数室，看其是否沾有杂质或干枯的菌体。若有污物，则需作以下几步清洗：（1）、擦洗 用药棉蘸取95%酒精，轻轻擦洗计数板的计数室。（2）、冲洗 用蒸馏水冲洗计数板，并用毛边纸吸干其上的水分注意：勿用内火焰来烤干，最后用擦镜纸揩干净。2、镜检：镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时，才可用于细胞的计数。3、加样：先将盖玻片安放在计数室上面，然后摇匀样品取悬液，从盖玻片边缘滴加细胞悬液，连续23次，直至充满计数板和盖玻片间的空隙。4、计数： 将加好样品

7、的记数板置于显微镜载物台的中央，然后按下列步骤操作：（1）找计数室：先在低倍显微镜下寻找计数板上的大方格网位置。寻找时显微镜的光圈要适当缩小，使视野偏暗。然后顺着大方格线，移动计数板，使计数室位于视野中间。（2）转高倍镜：转至高倍镜后，适当调节光度，使细胞和计数室线条均清晰为止。然后将计数室一角的中格移至视野中。（3）计数：计算计数板的四角大格内的细胞数，压线者只计算左侧和上方的，右和下的不计算在内。5、清洗：计数完毕后，记数板先用95%酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最后用擦镜纸揩干净。五、实验结果我们共取了16个计数室，体积均为0.1mm3。得到的细胞数量数据如下表所示。 第一组细

8、胞计数结果计数室细胞总数/个死细胞数/个125424233531318818417522519421628724715617821419第二组细胞计数结果计数室细胞总数/个死细胞数/个118721221726323427419721515016616618717820818722两组细胞计数总计细胞总数/个死细胞数/个总数3319347平均值27422 根据上表可得：细胞总数/ml = 274×104 ×10/9=3.04×106个/ml细胞活力(细胞总数 - 蓝色细胞数)/细胞总数X100% = 89.545%六、结果分析：观察表格中的数据可得，本次实验我们小组

9、所复苏细胞的细胞存活率为89.545%，细胞总数为3.04×106个/ml。总体而言每个计数室细胞总数相差不大，说明细胞悬液中的细胞分散良好，整体而言细胞悬液较为均匀，提高了计数的准确性。实验时可能因镜检时间过长、因镜检而导致的细胞死亡数增多，导致得到的存活率偏小。七、思考题1、细胞计数应注意的问题？ 细胞计数时要求悬浮中细胞数目在50×104个/ml左右，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中。 细胞压格计上线不计下，计左不计右，如有少量两个以上细胞按一个细胞计数。镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团占10%以上，说明消化不充

10、分，细胞数少于200个/10平方毫米或多于500个/10平方毫米时，均说明稀释不当，需重新置备细胞悬液，再重新记数。 在加样时要摇匀样品取悬液，从盖玻片边缘滴加细胞悬液，连续23次，直至充满计数板和盖玻片间的空隙。操作时注意盖片下不能有气泡，否则要重新计数。染色时间不宜过长，以免对细胞造成严重损伤。2、检测细胞的死活还有哪些方法？(1)染色法亚甲基蓝溶液染色：亚甲基蓝为活体染色剂，可以让活细胞染色,死细胞不能染色。活细胞被染为深蓝色的部分是（细胞核）亚甲基蓝可以结合核酸，使细胞核呈蓝色。中性红染色：中性红是液泡系的专有染料，也是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。(2)仪器分析法：可采用微电极技术（利用死活细胞膜两侧电位的差异）、全自动分析细胞记数仪和流式细胞仪等，可对细胞的死活进行精确的批量检测。流式细胞仪法用来判断细胞死活的常用荧光探针有二大类：一类是能透过活的细胞膜进入细胞内而发出荧光的物质，例如