生物样本分析课件

1、生物样本分析生物样本分析生物样本分析岛津岛津自动前处理自动前处理系统系统（Co-Sense for BACo-Sense for BA LCMS LCMS ）生物样本分析药代动力学研究的内容药代动力学应用动力学原理研究药物吸收、分布、代谢和排泄过程。 药物剂量与药理效应的相互关系研究 人体生理及病理状态对药物体内过程的影响 药物制剂的生物利用度测定 药物相互作用评价生物样品包括各种体液和组织血浆中微量药物或代谢产物的测定生物样本分析药物化学结构的特点世界药物索引1999收载药物总数：51596可离子化药物：62.9%，其中 酸性化合物14.5% 碱性化合物67.5% 两性化合物18.0%分子量

2、一般 500 离子化 质谱分析生物样本分析血浆样品的特点基质复杂 选择性强待测物含量低 灵敏度高浓度差异大 线性范围宽生物样本分析生物样品中的药物分析前处理的要点生物样品中的药物分析前处理的要点除蛋白质，分离纯化浓缩液液萃取法 固相萃取法 规模缩小的柱色谱法直接沉淀法 超滤法生物样本分析血浆样品加入提取溶媒（酸化或碱化）血浆样品加入提取溶媒（酸化或碱化）涡旋离心取上清液吹氮气浓缩涡旋离心取上清液吹氮气浓缩残渣溶解过滤进样残渣溶解过滤进样色谱分析色谱分析样本前处理一般步骤样本前处理一般步骤生物样本分析药代动力学研究面临的挑战高效液相色谱法（HPLC）的特点和局限：灵敏度：定量限一般为 10100

3、 ng/ml，选择性差测试速度：每个样品 1520 min，低通量对结构分析提供的信息很少需求：灵敏度： ng/ml 浓度，高选择性制剂生物等效性实验：5001000 样品新药研究：分析超过 10000 个生物样品生物样本分析液相色谱-质谱联用法的发展1977年，LC/MS开始投放市场1978年，LC/MS首次用于生物样品分析1991年，API LC/MS用于药物开发生物样本分析HPLCHPLC85%85%GC/MSGC/MS12%12%LC/MSLC/MS3%3%HPLCHPLC85%85%GC/MSGC/MS12%12%LC/MSLC/MS3%3%HPLCHPLC15%15%GC/MSGC

4、/MS5%5%LC/MSLC/MS80%80%HPLCHPLC15%15%GC/MSGC/MS5%5%LC/MSLC/MS80%80%数据来源：American Society for Mass Spectrometry, 2002药物色谱分析中不同方法的比例1990年2000年生物样本分析LC/MS LC/MS 法测定人血浆中克拉霉素的浓度法测定人血浆中克拉霉素的浓度 克拉霉素克拉霉素( (clarithromycin) clarithromycin) 红霉素衍生物红霉素衍生物新一代对酸稳定的口服大环内酯类抗生素新一代对酸稳定的口服大环内酯类抗生素 以往克拉霉素血药浓度测定以往克拉霉素血药浓

5、度测定多采用微生物法多采用微生物法HPLCHPLC紫外检测紫外检测 生物样本分析CH3CH3OOOCH3H3CH0H3COCH3CH3H3COOOCH3CH3OCH3H0O CH3H0NCH3CH3OH克拉霉素生物样本分析检测检测条件条件 流动相流动相: 0.05%: 0.05%冰醋酸和乙腈（冰醋酸和乙腈（4060 4060 v/vv/v） 流速流速: 0.2: 0.2mL/minmL/min 色谱柱色谱柱: : Shim-pack ODS 150mmShim-pack ODS 150mm2.0 mm I.D. 5m 2.0 mm I.D. 5m 柱温柱温: 40: 40 质谱离子化方式：电喷

6、雾离子化（质谱离子化方式：电喷雾离子化（ESIESI） 离子极性离子极性: :PositivePositive； 选择性离子检测选择性离子检测( (SIM): SIM): 克拉霉素克拉霉素m/z: 748.5M+H+m/z: 748.5M+H+ 罗红霉素罗红霉素m/z: 837.5 M+H+ m/z: 837.5 M+H+ 内标物内标物 14- 14-羟基克拉霉素羟基克拉霉素m/z: 764.5M+H+m/z: 764.5M+H+生物样本分析血浆样品的处理血浆样品的处理 血浆血浆样品样品, , 内标罗红霉素内标罗红霉素, , 碳酸钠溶液碳酸钠溶液碱化后碱化后乙乙醚醚提取提取, , 上清液用氮气

7、吹干。上清液用氮气吹干。最后最后残渣乙腈溶解。残渣乙腈溶解。方法的专属性方法的专属性克拉霉素、内标、克拉霉素、内标、14-14-羟基克拉霉素的保留时间分别羟基克拉霉素的保留时间分别为为1.931.93minmin、1.93min1.93min、1.92min1.92min生物样本分析生物样本分析岛津岛津自动前处理自动前处理系统系统（Co-Sense for BA LCMS ）生物样本分析 内容 自动前处理的优点与问题自动前处理的优点与问题 自动前处理系统自动前处理系统Co-Sense for BA的特长的特长 采用新型色谱柱和稀释系统实现了高回收率 使用新型色谱柱的自动浓缩系统实现了高灵敏度使

8、用新型色谱柱的自动浓缩系统实现了高灵敏度 Co-Sense for BA + LCMS系统的特长系统的特长生物样本分析背景背景p样品前处理是目前分析化学的瓶颈，是分析化学研究的难点和样品前处理是目前分析化学的瓶颈，是分析化学研究的难点和热点问题之一。由于样品数量极多，且分析物含量越来越低、热点问题之一。由于样品数量极多，且分析物含量越来越低、基体越来越复杂，迫切要求发展高通量、高选择性、高效率的基体越来越复杂，迫切要求发展高通量、高选择性、高效率的在线样品前处理技术。因此，开展这方面的研究具有极为重要在线样品前处理技术。因此，开展这方面的研究具有极为重要的意义。的意义。生物样本分析 HPLC/

9、LC-MSHPLC/LC-MS广泛应用于血浆或血清的代谢物分析和原广泛应用于血浆或血清的代谢物分析和原药分析，一般的血浆和血清分析，需要对样本进行预药分析，一般的血浆和血清分析，需要对样本进行预处理，以除去蛋白质，这样会降低精确度和工作效率。处理，以除去蛋白质，这样会降低精确度和工作效率。引入了具有限制性通路媒介（引入了具有限制性通路媒介（restricted access restricted access media -RAMmedia -RAM）的预柱，可对血浆样本进行直接分析，）的预柱，可对血浆样本进行直接分析，而不必进行预处理。这样，可提高精确度、简化操作而不必进行预处理。这样，可提

10、高精确度、简化操作和提高工作效率和提高工作效率 。但是，使用限制性通路媒介柱，。但是，使用限制性通路媒介柱，也存在一些问题，需解决的问题：回收率、灵敏度、也存在一些问题，需解决的问题：回收率、灵敏度、耐用性耐用性。生物样本分析生物样品中的药物分析前处理的要点生物样品中的药物分析前处理的要点除蛋白质除蛋白质浓缩浓缩手工前处理的问题手工前处理的问题处理时间处理时间重现性重现性药物回收率药物回收率前处理的现状生物样本分析除蛋白、浓缩操作自动化的优点除蛋白、浓缩操作自动化的优点提高分析精度提高分析精度脱线处理时，难以保持操作完全一致，有时分析精度变差。脱线处理时，难以保持操作完全一致，有时分析精度变差

11、。提高操作简便性提高操作简便性脱线处理时需操作熟练脱线处理时需操作熟练提高处理效率提高处理效率夜间可自动运行，大幅度地提高了处理效率夜间可自动运行，大幅度地提高了处理效率前处理自动化的课题前处理自动化的课题提高回收率及提高浓缩率提高回收率及提高浓缩率自动前处理的优点和课题生物样本分析提高回收率的手段提高回收率的手段p有必要使与蛋白质结合的药物游离出来有必要使与蛋白质结合的药物游离出来n与蛋白质结合的药物，在除蛋白质处理时，药物也与蛋白质一起被除去，与蛋白质结合的药物，在除蛋白质处理时，药物也与蛋白质一起被除去，药物回收率降低。药物回收率降低。p切断蛋白质结合（离子结合，疏水结合切断蛋白质结合（

12、离子结合，疏水结合）n调整样品导入溶液的调整样品导入溶液的pHpH值值p碱性药物时，使用碱性药物时，使用pHpH值低的溶液值低的溶液p酸性药物时，使用酸性药物时，使用pHpH值高的溶液值高的溶液n调整样品导入溶液的离子强度调整样品导入溶液的离子强度p20-100mM20-100mM的缓冲液浓度的缓冲液浓度n在样品导入溶液中添加有机溶剂在样品导入溶液中添加有机溶剂p在在20%20%以内使用有机溶剂（防止由蛋白质的变性而产生的析出）以内使用有机溶剂（防止由蛋白质的变性而产生的析出）p使用界面活性剂使用界面活性剂( (* *) ) 从药物保持（使用反相柱）的方式看，有抑制药离子化的从药物保持（使用反

13、相柱）的方式看，有抑制药离子化的pHpH 值较为理想。值较为理想。生物样本分析 方法方法 我们研究开发出优质的限制性通路媒介（我们研究开发出优质的限制性通路媒介（RAMRAM）预柱，应用柱切换）预柱，应用柱切换HPLCHPLC系系统及其在线稀释旁路系统，可对血浆直接进行药物分析。统及其在线稀释旁路系统，可对血浆直接进行药物分析。 我们的系统我们的系统 . . 回收率回收率 即使是紧密与蛋白质结合的化合物，也能被预柱吸附（捕集），即使是紧密与蛋白质结合的化合物，也能被预柱吸附（捕集）， 并且回收率几乎达到并且回收率几乎达到100%100% 灵敏度灵敏度 目标化合物可进行浓缩和分离即使是大体积进样

14、分析也如此目标化合物可进行浓缩和分离即使是大体积进样分析也如此。 不会造成峰值恶化。不会造成峰值恶化。耐用性耐用性 新设计的涂渍技术和粒径优化技术，使得数据保持稳定，即使是新设计的涂渍技术和粒径优化技术，使得数据保持稳定，即使是 长时间的实验也能如此。长时间的实验也能如此。生物样本分析Co-Sense for BACo-Sense for BAp何谓何谓C Co-Sense for BAo-Sense for BAn用于分析生物样品的应用系统用于分析生物样品的应用系统p具有在线稀释旁通流路的自动前处理系统和新开发的前处理柱pShim-Pack MAYl-ODS的组合，实现了真正的血浆（血清）的

15、直接大量注入。p特长特长n可对应蛋白质结合率高的药物可对应蛋白质结合率高的药物p使用样品导入用溶液的在线稀释的应用，即使是蛋白质结合率高的药物且在大量注入时 也可有效地捕集，回收率几乎100%。n超高速进样和无限接近零的交叉污染。超高速进样和无限接近零的交叉污染。 -使用高效自动进样器n迅速且有效地除去蛋白迅速且有效地除去蛋白p有效地保护分析柱色谱柱和LC/MS的接口n经久耐用的新型柱经久耐用的新型柱 通过采用新开发的涂覆技术和粒子径的最优化，可得到长期稳定数据。生物样本分析自动前处理系统的基本流路泵泵1泵泵2前处理柱前处理柱分离柱分离柱自动进样器自动进样器检测器检测器流动相流动相 导入溶液导

16、入溶液生物样本分析自动前处理系统的基本流路泵泵1泵泵2前处理柱前处理柱分离柱分离柱自动进样器自动进样器检测器检测器流动相流动相 导入溶液导入溶液通过对样品导入溶液进行最优化，可提高回收率。但是，为了提高浓缩效果而大量进样时的回收率会怎样呢？生物样本分析血浆（血清）样品的大量进样时的回收率？p因大量进样，回收率降低。因大量进样，回收率降低。p通过安装在线稀释旁通流路，可大量注入血浆（血清）通过安装在线稀释旁通流路，可大量注入血浆（血清）样品。样品。这便是Co-Sense的关键技术！自动进样器前处理柱在线稀释流路在线稀释流路 导入泵在线稀释流程图在线稀释流程图生物样本分析样品处理柱的容量样品处理柱

17、的容量 进样体积对色谱图的影响进样体积对色谱图的影响 当进样体积加大的时候，由于样品处理柱子容量的限制会发生峰展宽的现象.100 uL50 uL10 uL100 uL50 uL10 uL生物样本分析不同进样体积的影响不同进样体积的影响10 uLDrugProtein100 uL 小体积进样的时候，预处理柱可捕集几乎所有的药物分子 大体积进样的时候，部分药物被蛋白带走，回收率降低生物样本分析在线稀释泵提高回收率的原因在线稀释泵提高回收率的原因Auto-samplerPretreatment columnSample introduction pump在样品进入预处理柱之前，在线稀释泵可预先将蛋白

18、和药在样品进入预处理柱之前，在线稀释泵可预先将蛋白和药物分子分离物分子分离Auto-samplerPretreatment columnSample introduction pump90%10%Free DrugDilution pump生物样本分析Shim-pack MAYI-ODS Shim-pack MAYI-ODS （RAMRAM）预处理柱）预处理柱p采用采用Shim-pack MAYI-ODSShim-pack MAYI-ODS除蛋白除蛋白蛋白质等大分子蛋白质等大分子药物药物涂覆膜涂覆膜将硅胶（50m）的外表面用亲水性聚合物涂覆，只将细孔内部用十八烷基进行化学修饰。象蛋白质这样的高

19、分子不能进入细孔内部，并被外表面的亲水性聚合物阻挡，不在固定相上保留，很快地洗脱。另一方面，诸如药物这样的通常的小分子化合物则浸透到细孔内部，被保留在内部表面的固定相上。生物样本分析pcolumn name ; Shim-pack MAYI-ODSppacking material ; silica particleouter surface methyl celluloseinner surface octadecylsilyl grouppparticle size ; 50mmpcolumn size ; 4.6mm i.d. x 10mmppH range ; 2 - 7.5pmaxi

20、mum pressure ;20MPa涂渍的甲基纤维素表面涂渍的甲基纤维素表面药物药物蛋白质蛋白质ODS 表面表面预处理柱预处理柱生物样本分析生物样本分析Co-Sense for BACo-Sense for BA的流路构成的流路构成样品通过在线稀释旁通的作用 ，导入溶液自动稀释，被导入MAYI-ODS前处理柱。在除蛋白的同时，捕集、浓缩药物Step1. Step1. 除蛋白质的捕集浓缩除蛋白质的捕集浓缩分析用高压梯度泵分析柱自动进样器前处理柱在线稀释旁通 导入样品泵检测器被MAYI-ODS捕集的药物，经阀切换，导入分析柱Step 2. Step 2. 分析经浓缩的药物分析经浓缩的药物 导入样

21、品泵分析用高压梯度泵分析柱自动进样器前处理柱在线稀释旁通检测器生物样本分析在线自动稀释用旁通流路的效果在线自动稀释用旁通流路的效果0412168Time (min)标准标准溶液溶液无旁通无旁通有旁通有旁通样品：消炎痛(1 mg/L) 添加血浆样品导入液（稀释液）：0.1磷酸水溶液：乙腈=95：5注入量：500L稀释倍率：8倍检测：UV 315nmp用蛋白结合率较高的消炎痛进行评价用蛋白结合率较高的消炎痛进行评价p无稀释旁通流路：回收率约50%。p有稀释旁通流路：回收率几乎100%生物样本分析自动浓缩带来的高灵敏度自动浓缩带来的高灵敏度100L注入注入200L注入注入500L注入注入012481

22、6Time (min)样品：消炎痛(1 mg/L) 添加血浆 无峰形歪斜样品导入液（稀释液）：0.1%磷酸水溶液：乙腈混合液（95：5）检测：UV 315nm实现高灵敏度实现高灵敏度p实现高灵敏度的大量注入的稳定性实现高灵敏度的大量注入的稳定性n捕集效率p即使注入血浆500L，回收率也几乎达到100%。n峰形状p样品名：添加消炎痛的血浆生物样本分析Recovery（ %)Injection Volume(L)KetoprofenNaproxenWarfarin5098100100Bypass2509790100500968399No Bypass500542160Recovery（ %)Inj

23、ection Volume(L) ChlorpropamideIbuprofenAcetohexamide509499100Bypass250-9950010010099250-56No Bypass5007157-流动相 (样品导入溶液) ：100mM 醋酸钠缓冲液 血浆样品中药物回收率测定血浆样品中药物回收率测定 在线自动稀释用旁通流路的影响 各药物在有稀释旁路下的回收率结果 (spiked 2ug/mL each)生物样本分析Table. 血浆样品中药物回收率(spiked 2ug/mL each, 50uLinj.)样品导入溶液样品导入溶液 pH值变化值变化对回收率的影响对回收率的影响

24、 样品导入溶液对回收率的影响 1 Recovery (%)Mobile phase (Sample injection liquid)Injection Volume Ketoprofen NaproxenWarfarin100mM phosphate (Na) buffer / acetonitrile = 9 / 1 (v/v) 50L979898250L969596100mM phosphate (Na) buffer 50L882086250L-100mM acetate (Na) buffer50L98100100250L9790100100mM ammonium acetate50

25、L977592250L923486生物样本分析10mM ammonium acetate100mM ammonium acetate200mM ammonium acetateNaproxen-75%85%Lidocaine100%99%-Noscapine96%94%-Chlorpheniramine80%99%-Propranolol87%91%-Diphenhydramine93%96%-Verapamil80%90%-Acetohexamide62%100%-Imipramine78%80%-Table血浆样品中各药物回收率结果 (spiked 0.5ug/mL each (Napro

26、xen:2ug/mL), 50uLinj.)2样品导入溶液样品导入溶液 离子强度变化离子强度变化对回收率的影响对回收率的影响 生物样本分析100mM ammonium acetate / Acetonitrile = 95/5 (v/v) / Acetonitrile= 90/10 (v/v)200mM ammoniumacetate / Acetonitrile= 98/2 (v/v)Naproxen63%85%97%Lidocaine99%99%-Noscapine94%96%-Chlorpheniramine99%100%-Propranolol91%99%-Diphenhydramin

27、e96%100%-Verapamil90%94%100%-Acetohexamide100%-Imipramine80%86%95%-Table Recovery of drugs in plasma (spiked 0.5ug/mL each (Naproxen:2ug/mL), 50uLinj.)3样品导入溶液 乙腈溶剂添加乙腈溶剂添加对回收率的影响对回收率的影响生物样本分析出色的柱使用寿命出色的柱使用寿命08.517Time (min)08.517Time (min)第第1次次第第300次次阀切换阀切换阀切换阀切换p连续注入时的稳定性n血浆基底的洗脱p从稳定的MAYL-ODS洗脱蛋白质等

28、血浆基底p峰及回收率p稳定的峰形状及回收率（几乎100%）样品 ：添加异丙基安替比林的血浆注入量 ：100L样品导入液 ：0.1%磷酸水溶液乙腈混合液稀释倍数 ：8倍检测 ：分析；275nm，血浆基质；280nm生物样本分析Co-Sense for BA-LCMS系统的特长通过在通过在Co-Sense for BACo-Sense for BA系统上连接系统上连接LCMS-2010EVLCMS-2010EV，成为更强有力的生物样品分析系统，成为更强有力的生物样品分析系统LCMSLCMS所具有的高选择性检测，在有复杂的基底的生物样品的分析中，发挥威力所具有的高选择性检测，在有复杂的基底的生物样品

29、的分析中，发挥威力。生物样本分析何种化合物可用 LC/MS分析? 取决于化合物的离子化效率；取决于化合物的离子化效率； 化合物分子自身的极性，结构及其所含的功能基团等因素均会化合物分子自身的极性，结构及其所含的功能基团等因素均会影响离子化情况；影响离子化情况； 多数具有一定极性的有机化合物可以通过多数具有一定极性的有机化合物可以通过ESI 或或APCI的方式离的方式离子化，如子化，如: : 药物及其代谢产物药物及其代谢产物天然产物天然产物 ( (生物碱生物碱, , 配糖物、苷配糖物、苷glycosides, taxanes, glycosides, taxanes, 毒毒素素, , 糖类糖类,

30、 , 脂类脂类, , 维生素等等维生素等等) )蛋白质，多肽；蛋白质，多肽；杀虫剂，除草剂杀虫剂，除草剂表面活性剂和染料表面活性剂和染料生物样本分析LC/MS的优势p强大的定性和选择性能力强大的定性和选择性能力n多组份样品的准确定性；多组份样品的准确定性； n未充分分离组份峰的鉴别；未充分分离组份峰的鉴别；n消除杂质干扰；消除杂质干扰；p可作为便捷的定性分析可作为便捷的定性分析n用于合成和衍生反应的研究用于合成和衍生反应的研究；n作作NMR预分析的质谱鉴定；预分析的质谱鉴定；p广泛适用于难挥发性化合物的分析广泛适用于难挥发性化合物的分析n扩展了大气压离子化扩展了大气压离子化的多种应用的多种应用

31、 生物样本分析对液相色谱分离组份进行强有力的定性确证M/ZM/ZM/ZTIC色谱图色谱图 质谱图质谱图生物样本分析强大的选择性A:100D:150B:100C:150m/z=150TIC m/z=100ABCD生物样本分析未充分分离峰的鉴别椰子油的分析椰子油的分析2.55.07.510.012.515.017.5min0e610e620e630e640e650e660e6Int.三烷基甘油用反相三烷基甘油用反相HPLC方式分离，方式分离，洗脱次序基于同系物的炭数洗脱次序基于同系物的炭数ECN = CN - 2 x DBElution order is based on equivalent c

32、arbon number m/z 439.5 : C38 DB=0 m/z 467.5 : C40 DB=1 m/z 495.5 : C42 DB=2 m/z 523.5 : C44 DB=3TIC生物样本分析 高效液相色谱高效液相色谱HPLC与质谱与质谱MS的接口技术研究始于的接口技术研究始于1970s ; 大气压下的离子化大气压下的离子化API (atmospheric pressure ionization) 于于1987年商品化。年商品化。 大气压下的离子化接口大气压下的离子化接口: : 电喷雾离子化电喷雾离子化 Electrospray ionization (ESI)；大气压大气压

33、下化学离子化下化学离子化 Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) ；大气压下光离大气压下光离子化子化Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI) LC/MS离子化接口高效液相高效液相HPLC质谱质谱MS离子化接口离子化接口 含缓冲盐的水含缓冲盐的水/ /有机相；有机相； 非挥发性的流动相非挥发性的流动相Non-volatileNon-volatile 高真空状态高真空状态分析离子（分析离子（m/zm/z） 去除液相色谱导入去除液相色谱导入的溶剂的溶剂 将待分析物离子化将待分析物离子化关键技术关键

34、技术生物样本分析 大气压状态大气压状态低真空区域低真空区域+ + + + + + +机械泵机械泵 涡沦分子泵涡沦分子泵TMP1 涡沦分子泵涡沦分子泵TMP2MS质量分析器质量分析器高真空区域高真空区域LC/MS系统硬件主要构造系统硬件主要构造离子源离子源离子化接口离子化接口生物样本分析大气压下的离子化API方法的优势电喷雾电喷雾Electrospray(ESI)w适于极性样品的分析；适于极性样品的分析；w推荐使用半微量流速，在雾化气条件下推荐使用半微量流速，在雾化气条件下LC可实现高至可实现高至 1ml/min的流速的流速； w用该种离子源能形成多电荷离子用该种离子源能形成多电荷离子，扩展了所

35、能检测的分子量范围；扩展了所能检测的分子量范围；大气压下化学电离大气压下化学电离Atmospheric Pressure Chemical Ionization(APCI)w低极性化合物；低极性化合物；w推荐使用半微量流速，在雾化气条件下推荐使用半微量流速，在雾化气条件下LC流速可实现高流速可实现高至至2ml/min；w比热喷雾具有更好的稳定性；比热喷雾具有更好的稳定性；大气压下光电离大气压下光电离Atmospheric Pressure Photo Ionization(APPI)Atmospheric Pressure Photo Ionization(APPI)w弱极性和非极性化合物弱极

36、性和非极性化合物w直接直接APPI离子化及掺杂物离子化及掺杂物APPI离子化方式的正确选择离子化方式的正确选择生物样本分析- 干燥气体干燥气体- 保护保护TMP 1TMP 2旋转泵旋转泵废废液管液管检测器检测器四极杆四极杆前杆前杆入口镜入口镜聚焦镜聚焦镜八极八极Q-阵阵列列Skimmer保护阀保护阀来自来自LC雾化气体雾化气体ESI或或APCI或或APPI源源 CDL干燥气体干燥气体 岛津岛津QoQ设计设计生物样本分析允许流速：允许流速：0.0011 ml/min；操作温度：室温；操作温度：室温；雾化气流速雾化气流速N2 ：1.5 L/min 高电压高电压 雾化气雾化气+-+-+-+-+-+-

37、+-+-+-+-+-+-+ 大气压下的离子化大气压下的离子化(API) 原理原理电喷雾离子化电喷雾离子化 ESIESI液相流出组份液相流出组份1)1)带电液滴带电液滴2)溶剂蒸发溶剂蒸发3)离子蒸发离子蒸发生物样本分析大气压下的离子化大气压下的离子化 (API)原理原理大气压下化学离子化大气压下化学离子化 (APCI) 高压放电针高压放电针 离子离子- -分子反应分子反应允许流速：允许流速：0.05 2 ml/min加热模块加热模块: : 400oC雾化气流速雾化气流速N2 ： 2.5 L/minAPCI液相流出组份液相流出组份雾化气雾化气生物样本分析大气压下的离子化大气压下化学离子化 (AP

38、CI) LC 流份在雾化气作用下进入加热模块；流份在雾化气作用下进入加热模块；流动相蒸发；流动相蒸发；高压放电条件下高压放电条件下，质子化溶剂被离子化质子化溶剂被离子化 ( (产生反应离子产生反应离子) )；4) 样品和已产生的反应离子发生离子样品和已产生的反应离子发生离子- -分子反应生成质子化分子反应生成质子化分子分子离子离子- -分子反应分子反应生物样本分析Schematic diagram of APPI CDLUVLampHeaterNebulizerGasFromHPLCESIAPCIAPPIpolarityVery polarnonpolarMolecular Weight10,

39、0001,000100生物样本分析正离子或负离子模式采集数据? p质谱数据以正离子还是负离子模式采集，需考虑被测样品结构和质谱数据以正离子还是负离子模式采集，需考虑被测样品结构和特性等特性等 由于由于C-O、C-N、双键、三键及碱性化合物具有较强的质子亲双键、三键及碱性化合物具有较强的质子亲和力，上述基团或化合物更倾向于形成正离子和力，上述基团或化合物更倾向于形成正离子； 含含COOH, -F, -Cl, -HSO3 的偏酸性化合物由于具有较强的质子的偏酸性化合物由于具有较强的质子给予能力，更倾向于形成负离子给予能力，更倾向于形成负离子；还有许多化合物既可形成正离子，也能生成负离子；还有许多化

40、合物既可形成正离子，也能生成负离子；生物样本分析LC/MS 2010EV的硬件结构正交设计的离子源正交设计的离子源加热的毛细管加热的毛细管Q-array八极杆八极杆Octapole四极杆质量分析器四极杆质量分析器检测器检测器离子转移离子转移质量过滤质量过滤生物样本分析CDL(Curved Desolvation Line )单元和QoQ系统加热模块加热模块Block Heater端口端口Tip废液孔废液孔CDL 单元单元Q-array Q-阵列阵列八极杆透镜八极杆透镜Qctopole四极杆四极杆QuadrupoleQ-阵列阵列侧面侧面八极杆透镜八极杆透镜四极杆侧面四极杆侧面 QoQ系统是一套包

41、含系统是一套包含Q- 阵列阵列(Q-array) + + 八极八极杆透镜杆透镜(Qctopole lens) + +四极杆四极杆(Quadrupole)。 这套离子光学系统是岛津公司集这套离子光学系统是岛津公司集30年质谱设计、年质谱设计、生产经验的结果，具有优异的离子传输和离子会生产经验的结果，具有优异的离子传输和离子会聚性能聚性能 。生物样本分析QoQ 系统介绍Q-array（ （Q-阵列）阵列）三排四极板平行排列，形成一锥形区域，使离子能被三排四极板平行排列，形成一锥形区域，使离子能被有效地引入八极杆。有效地引入八极杆。Octopole Lens（ （八极杆透镜）八极杆透镜）八极杆透镜实

42、现稳定的离子会聚八极杆透镜实现稳定的离子会聚, 不易受不易受系统真空变化的影响。系统真空变化的影响。Quadrupole（ （四极杆）四极杆）带有预杆的钼制双曲线四极杆系统作为带有预杆的钼制双曲线四极杆系统作为 质量过滤器。预杆保护主四极杆免受污染，质量过滤器。预杆保护主四极杆免受污染，并延长使用寿命。岛津公司多年来并延长使用寿命。岛津公司多年来 不断不断改进、优化改进、优化四极杆系统的性能四极杆系统的性能, 最终实现最终实现优异的离子传输效率，质量数的稳定性和优异的离子传输效率，质量数的稳定性和峰形。峰形。QQO生物样本分析Q-array中离子轨道示意图 上图显示具有不同入射角度的离子集穿过

43、上图显示具有不同入射角度的离子集穿过Q-array的轨迹的轨迹。离子的运行路线被校正离子的运行路线被校正后后，汇聚在中心的汇聚在中心的Skimmer入口处入口处。 。这一离子运行轨道是依据这一离子运行轨道是依据Optdesign模型（岛津研模型（岛津研发中心）计算优化得到的。发中心）计算优化得到的。各种方向运动矢各种方向运动矢量的离子集量的离子集通过通过Q-array后的离子集，后的离子集，经会聚作用具有同一矢量经会聚作用具有同一矢量 三排四极板成锥形平行排列，三排四极板成锥形平行排列， 使离子被会聚于一狭窄区域。使离子被会聚于一狭窄区域。 这与具有高频电压这与具有高频电压的四极杆工作原理类似

44、。的四极杆工作原理类似。锥形设计提高了离子会聚能力，这也是提高灵敏度的关锥形设计提高了离子会聚能力，这也是提高灵敏度的关键。键。 Performance of the Q-array and related optics is up to 10 times more sensitive than other designs.生物样本分析典型的LC/MS质谱图NNNOSCH3NH2(H3C)3CMetribuzin C8H14N4OSExact Mass: 214.09Mol. Wt.: 214.29NNNHOSCH3(H3C)3CDesaminometribuzin (DA)C8H13N3OS

45、Exact Mass: 199.08Mol. Wt.: 199.27NNHNOONH2(H3C)3CDiketometribuzin (DK) C7H12N4O2Exact Mass: 184.10Mol. Wt.: 184.20NNHNHOO(H3C)3CDesaminodiketmetoribuzin (DADK) C7H11N3O2Exact Mass: 169.09Mol. Wt.: 169.1850100150200250300350400450m/z0e350e3100e3150e3200e3250e3300e3350e3Int.18519720722739110529516725

46、714226831742528036912815524340434149766824694535748250100150200250300350400450m/z0e3100e3200e3300e3400e3500e3Int.183243168153265207113228281893562973681413221934612504354844164054997150APCI正离子模式正离子模式APCI负离子模式负离子模式生物样本分析Co-Sense for BA-LCMCo-Sense for BA-LCMS S分析血分析血浆样浆样品品通过在通过在Co-Sense for BACo-Sens

47、e for BA系统上连接系统上连接LCMS-2010EVLCMS-2010EV，成为更强有力的生物样品分析系统，成为更强有力的生物样品分析系统LCMSLCMS所具有的高选择性检测，在有复杂的基底的生物样品的分析中，发挥威力所具有的高选择性检测，在有复杂的基底的生物样品的分析中，发挥威力。生物样本分析分析条件 PretreatmentColumnShim-pack MAYI-ODS (4.6mmi.d. x 10mm)Extraction mobile phase10mM ammonium acetate/acetonitrile = 95/5Flow rate3mL/minColumn te

48、mperature45CInjection volume5, 10 or 50LExtraction time1 or 2minDilution factor8 foldAnalysisColumnPhenomenex Mercury MS (4.0mmi.d. x 10mm, 5m)Mobile phaseA : 10mM ammonium acetate, B : acetonitrileGradient programExtraction time 1min5%B(0-0.5min) 90%B(3-4min) - 5%B(4.01min)- STOP(5min) orExtraction

49、 time 2min5%B(0-1.5min) 90%B(4-5min) - 5%B(5.01min)- STOP(6min)Flow rate0.8mL/minSplit ratio1 : 3 (mass spectrometer : waste)Column temperature45CIonizationElectrospray ionizationProbe voltage+4.5 kV or 3.5kVNebulizing gas flow4.5L/min生物样本分析1234min500e31000e31500e32000e32500e3Int.1 :1 :倍他乐克 m/z 268m

50、/z 2682 :2 :普萘洛尔 m/z 260m/z 2603 :3 :利多卡因 m/z 235m/z 2354 :4 :狄布卡因 m/z 344m/z 3445 :5 :布比卡因 m/z 289m/z 289123451 g/mL each, 5 LSIM chromatograms of standards 生物样本分析RSD, % (n=5)CompoundStandardPlasma spikedMetoprolol1.21.0Propranolol1.01.4Lidocaine0.92.6Dibucaine1.62.5Bupivacaine0.71.5each 1ug/mL, 5u

51、L重现性生物样本分析2.5min500e31000e31500e32000e32500e3Int.2.5min500e31000e31500e32000e32500e3Int.标准 血浆中的药物倍他乐克95.0% 普萘洛尔97.4%利多卡因94.0%狄布卡因107.7%布比卡因97.1%each 1ug/mL, 5uL, n=5回收率生物样本分析05000000100000001500000000.20.40.60.811.2Conc.( g/mL)Area1 :倍他乐克r=0.999542 :普萘洛尔r=0.999583 :利多卡因r=0.999814 :狄布卡因r=0.999785 :布比

52、卡因r=0.999860.01 1ug/mL, 10uL, n=5, plasma spiked12345校正曲线 生物样本分析提取液中含乙腈对回收率的影响a. 提取液 : 10mM 乙酸铵/乙腈 = 95/5b. 提取液 : 10mM 醋酸铵C Co om mp po ou un nd d R Re ec co ov ve er ry y w wi it th h A Ac cC CN N, , % %a a R Re ec co ov ve er ry y w wi it th ho ou ut t A Ac cC CN N, , % %b b 倍倍他他乐乐克克 9 95 5. .0 0 7 79 9. .3 3 普普萘萘洛洛尔尔 9 97 7. .4 4 8 80 0. .6 6 利利多多卡卡因因 9 94 4. .0 0 8 88 8. .6 6 狄狄布布卡卡因因 1 10 07