X射线衍射技术在药物分析中的应用

1、X射线衍射技术在药物分析方面的应用 张静 华信学院10级资源勘查3班 410417100313摘要 x射线衍射分析技术是20世纪50年代末到60年代初进入我国，目前广泛应用于我国的物理、化学、地质、材料、石油、药学等方面。X射线衍射分析已成为当今药物研究与开发中普遍应用的一种物理分析方法和常规检测技术，他不仅广泛应用于化学药物研究领域，而且在中药研究与质量控制方面正发挥着其他分析技术不可代替的重要作用。关键字 x射线，化学药物，中药，单晶x射线衍射，多晶x射线衍射，粉末x射线衍射1 前言X射线有两方面的应用，即X射线荧光光谱和X射线衍射。X射线荧光光谱用于检测元素分析和元素定量，但其无法识别元

2、素价态。X射线衍射主要应用于两方面，一方面是单晶衍射，用于多晶型的结构确认，是国际上确证多晶型结构的最可靠的方法。另一方面是粉末衍射，即根据对粉末供试品作研究得出的一系列晶面间距及相对衍射强度与标准数据或由标准数据得到的相应数据，比较进行物相鉴别的方法。X射线晶体结构分析是晶体学中最活跃的研究领域之一。自1913年布拉格测定了氯化钠等矿物晶体结构，展示了其在空间排列的分子立体结构后，使化学家对分子结构的认识开始进入了“真实”的微观世界。这些成就终于使X射线衍射分析打开了有机分子 （特别是生物活性分子）立体结构测定的大门，为研究以药物分子结构、药物的结构改造、新药的结构预测、药物的结构与功能关系

3、等为目标的药物晶体学奠定了基础。此外，在晶型固体化学药物研究中，单晶X射线衍射分析技术不仅能够提供同质异晶（相同物质，不同晶型）样品的分子排列规律，同时可以给出样品中结晶水与各种溶剂的定量数值，阐明造成固体化学药物形成多晶型的原因，为寻找高效低毒的晶型固体化学药物，为人们安全用药提供可靠的技术保障。在化学药物的制药研究过程中，粉末X射线衍射技术主要应用于固体状态下单一化合物的鉴别与晶型确定、晶态与非晶态物质判断、多种化合物组成的多相体系中的组分分析（定性或定量）。该技术不需要制备单晶，而且快速、方便，样品可以回收，是研究药物多晶型最常用的方法之一。2 x射线分析原理X射线衍射分析是利用晶体形成

4、的X射线衍射，对物质进行内部原子在空间分布状况的结构分析方法。将具有一定波长的X射线照射到结晶性物质上时，X射线因在结晶内遇到规则排列的原子或离子而发生散射，散射的X射线在某些方向上相位得到加强，从而显示与结晶结构相对应的特有的衍射现象。衍射X射线满足布拉格（W.L.Bragg）方程：2dsin=n式中：是X射线的波长；是衍射角；d是结晶面间隔；n是整数。波长可用已知的X射线衍射角测定，进而求得面间隔，即结晶内原子或离子的规则排列状态。将求出的衍射X射线强度和面间隔与已知的表对照医学教育网搜集整理，即可确定试样结晶的物质结构，此即定性分析。从衍射X射线强度的比较，可进行定量分析。本法的特点在于

5、可以获得元素存在的化合物状态、原子间相互结合的方式，从而可进行价态分析，可用于对环境固体污染物的物相鉴定，如大气颗粒物中的风砂和土壤成分、工业排放的金属及其化合物（粉尘）、汽车排气中卤化铅的组成、水体沉积物或悬浮物中金属存在的状态等等。X射线衍射方法具有不损伤样品、无污染、快捷、测量精度高、能得到有关晶体完整性的大量信息等优点。3单晶衍射技术在药物分析中的应用1）天然产物中微量成分的结构测定从天然产物中寻找药物先导化合物是我国药物研究中的一条重要途径，通常从中草药中提取分离得到微量的有效化学成分，由于单晶 X射线衍射结构分析仅需一颗适合衍射实验的单晶体（样品量小于1mg），即可完成化合物分子立

6、体结构测定，所以衍射分析技术在微量成分的结构研究中具有独特优势。10-Deacetyl-7-epitaxol为天然紫杉醇二萜类化合物1，与紫杉醇具有相同的骨架和C13侧链基团，其活性弱于紫杉醇。样品是从植物中提取的，获得样品量很少，所以只能应用单晶X射线衍射结构分析方法测定该化合物分子立体结构（图1），为进一步阐明该化合物与紫杉醇结构和药效活性的差异提供了依据。图1 10-Deacetyl-7-epitaxol分子的相对构型图和立体结构投影图2）天然产物中全未知化合物的结构测定随着提取分离技术的不断提高，在自然界中存在的许多新颖结构骨架化合物被不断发现。这些全新未知化合物的结构测定依赖于单晶X

7、射线衍射分析，以阐明其准确的立体结构特征。目前，国际化学界对发现的具有新颖骨架类型的化合物结构，需要应用以下两种方法之一来证明其结构的存在：(1)利用全合成方法来证明结构；(2)利用单晶 X射线衍射结构分析来确定结构。龙胆草的根茎入药历史悠久，有泻肝胆实火、除下焦湿热的功效，临床上主要用于治疗急慢性肝炎、乙型脑炎、甲状腺机能亢进、胆囊炎、胃病等。通过对龙胆地上部分的乙醇提取物进行研究2，发现了6种首次在该植物中提取出的组分，并对其晶体结构进行了分析，为该类天然产物的结构表征提供了重要依据。图2 龙胆草提取化合物6的晶胞堆积图3）手性药物绝对构型分析在化学药物研究中，有一类药物为手性药物，确定药

8、物手性基团构型是需要解决的关键问题，手性问题会直接影响药物的疗效与毒副作用。我国今年即将颁布的手性创新药物指导原则中明确规定：“手性药物分子绝对构型测定的直接方法为单晶 X射线衍射结构分析”。对于一般非手性创新药物而言，也要求有单晶X射线衍射结构分析结果，这表明单晶 X射线衍射技术在我国新药研究中发挥着重要作用。利用手性试剂测定分子绝对构型：利用手性试剂(如D型或 L型酒石酸等)与被测药物样品形成共晶化合物，以手性试剂的已知构型为参照，即可获得待测药物分子的绝对构型。例如：利用L型苏糖酸试剂，测定了诺氟沙星药物分子的绝对构型，图3所示为分子绝对构型图与分子立体结构投影图。图3 诺氟沙星分子和L

9、型苏糖酸分子的绝对构型图(a)与分子立体结构投影图(b)京尼平是天然植物中存在的生物可降解分子，具有很低的细胞毒性和生物兼容性，其各种性能指标明显优于目前常用的化学交联剂戊二醛，可以用于生物勃合剂、伤口敷裹、骨骼和神经修复与重生等。通过单晶X射线衍射法测定其晶体结构3，发现分子中的三个手性中心分别为C3（S）、C2（S）和C1（R）构型，且分子内形成了多个氢键。这些为进一步研究药物分子的药效及理化性质奠定了基础。图4 京尼平的晶体结构图4）固体药物晶型分析化学结构相同的药物，可因结晶条件不同而得到不同的晶型，这种现象称为多晶型。药物的晶型不同，其物理性质如密度、熔点、溶解度和溶出速度均有不同。

10、在一定温度与压力下，多晶型中只有一种是稳定型，溶解度最小，化学稳定性好，而其他晶型则为亚稳定型，它们最终可转变为稳定型。但由于从亚稳定型转变为稳定型的过程通常比较缓慢，因此许多结晶药物都存在多晶现象。亚稳定型的溶解度大，故溶出速度也较快，一般来讲，亚稳定型的生物利用度高，为有效晶型，而稳定晶型药物往往低效甚至无效。因此，药物多晶型的研究已经成为新药开发和审批，药物的生产和质量控制以及新药剂型确定前设计所不可缺少的重要组成部分4。沙利度胺是一种具有2种晶型的药物，单晶 X射线衍射分析发现1：沙利度胺形成多晶型的原因是由于分子间作用力与分子排列规律差异造成的 (如图5所示)。图5 沙利度胺药物结构

11、图:(a)分子结构图；(b)分子立体结构投影图；(c)不同晶型的晶胞堆积图5）生物大分子结构测定蛋白质 X射线晶体学是分析蛋白质三维结构最有效的方法，目前已经测定了分子量达到近百万的病毒蛋白质和核糖体结构。由于蛋白质结晶比较脆弱，而且晶胞较大，通常使用同步辐射光源获得高分辨的衍射结构数据。Shinya5测定了一个含有十个氨基酸的蛋白质的结构，并且将晶体结构与溶液中的分子结构作了比较，分别考察了晶体结构中极性基团、疏水性基团之间的相互作用，及水溶液中不同基团的相互作用（如图6所示）。图6 A蛋白质晶体结构；B蛋白质在水溶液中的结构；C晶体中的主要作用力；D水溶液中基团间的相互作用4 X射线粉末衍

12、射技术在药物研究中的应用早在20世纪70年代，美国药典就将粉末 X射线衍射技术列为固体药物的检测分析方法。目前我国药典也收载了该分析技术，主要是应用于有机化学药物的检测分析。1）单一化合物的鉴别单一化合物的粉末X射线衍射谱的形成取决于两个因素：组成分子的化学元素与分子在晶胞的排列方式。为标示粉末X射线衍射图谱，通常使用两个主要参数：表示衍射线在空间分布的衍射角或晶面间距与衍射线的强度。对于给定的单一晶型化合物，其粉末X射线图谱具有专属性和指纹性，对创新药物及缺乏对照品的固体类新药，以此可以建立药物样品的标准X射线衍射谱图6。2）固体化学药物纯度鉴别固态下药物样品的纯度检测也是药物质量控制的重要

13、环节。每种药物均有不同的纯度要求，纯度指“化学纯度”和“晶型纯度”，粉末X射线衍射分析技术可给出被测药物的“化学纯度” 和“晶型纯度”的定量结果。与晶型状态，掌握组成药物制剂的各种辅料成分与含量。此外，需要对被测药物样品进行定量的X射线衍射分析，方可获得原料药物及其制剂的标准含量曲线，从而计算固体药物制剂中原料药成分含量。图7为吲哚美辛纯晶型样品与含有微量杂质成分样品的粉末 X射线衍射图谱，从中可以观察到微量杂质衍射峰的存在。图7 吲哚美辛纯晶型样品与含有微量杂质成分样品的粉末X射线衍射图3）中药材真伪鉴别中药中含有数十乃至上百种化学成分，由于目前对于中药尚没有有效的质量控制标准和整体的定量检

14、测分析方法，所以制约了中药的发展及全面走向世界。为此，需要在继承已延续数千年的传统中药宏观鉴定结果的前提下，引入能够再现其整体结构的现代物理分析技术。应用粉末 X射线衍射分析技术，可以在微观世界再现中药整体结构特征。粉末 X射线衍射分析技术在中药鉴定分析中有着独特的优势：（1）实验样品不需要化学处理，保持了中药各种成分的原始存在状态；（2）样品处理简单，经研磨并过100200目筛后即可作为实验样品；（3）实验获得的衍射图谱是中药中各种成分衍射图谱的信息叠加，完全符合傅里叶变换线性定理。在线性叠加的衍射图谱中，包含了全部成分的种类、存在状态及含量等结构信息.（4）不同种类的中药(中药材，中成药

15、)，由于其成分、状态、含量差异造成其衍射图谱的指纹特征不同，包括衍射图形的几何拓扑与特峰值。依此可以实现对不同种类中药的微观鉴定实现真伪、优劣、分类和药材质量控制目的。虫草作为一种被广泛使用的中药材是因为其含有虫草素，虫草素具有抗菌、抗肿瘤和调节免疫力的作用，具有很大的开发价值。采用粉末X射线衍射技术可以对虫草中的虫草素进行定性分析，对鉴定虫草的真伪、质量具有很大的意义7。图8 棒状虫草素晶体的粉末X射线衍射图吴云山8等对4个熟地黄及1个生地黄中药材进行实验、分析，得到了熟地黄的标准X射线衍射Fourier图谱及特征标记峰值。又对1个白芍对照品、1个白芍标本和3个白芍中药材进行实验、分析，获得

16、了白芍的标准X射线衍射Fou rier图谱及特征记峰值，表明X射线衍射Fourier图谱鉴定熟地黄、白芍是可行的。此外，郑笑为，张继等9 应用粉末 X衍射 Fourier谱分析，建立各类珍珠的 X衍射特征标记峰，对其进行鉴定，取得了满意的结果。4）原料药的稳定性和影响因素测定为确认生产工艺的稳定性，通常采取对三个不同批号的原料药样品进行检测。对存放时间、环境温度、湿度与光照、加速实验等可能改变药物药品性质的影响因素，也需要粉末X射线衍射分析方法进行检测，给出定性定量的分析结果。5）药物的筛选XRD是一门研究药物与辅料的相互作用的优秀技术。在固体混合物中，每一种晶型都产生相互独立的粉末衍射图谱，

17、因此混合物的粉末衍射图谱就是各粉末衍射图谱的累加。如果药物与赋形剂的相互作用结果产生一种新的晶型，那么反映在混合物的粉末衍射图谱中就会出现新的峰。如果药物与赋形剂的相互作用结果产生无定型，那么反映在混合物的粉末衍射图谱中就会出现钝的峰。因此XRD在药物处方筛选方面可发挥一定的作用10。5结束语XRD技术在药物分析中的应用，是20世纪80年代蓬勃兴起的新领域，系统理论的形成及深人物质微观结构的探讨，还在继续发展中。该方法具有简便易行、直观、图谱信息量大、指纹性强、稳定可靠、所需样品量少、结果可靠的特点。XRD技术能有效地运用于药物的晶型识别、复方药物中各成分的鉴定、药物处方筛选以及在药物生产与贮

18、存过程中反应动力学的监控等方面。这些强大的功能必将极大地促进药物处方的开发、新药剂型确定前设计、生产工艺的优化、药品质量控制以及临床药效的发挥。X射线衍射技术应用前景十分广阔，值得我们深人研究和广泛运用。参考文献1 常颖,郑启泰,吕扬.X射线衍射分析技术在药物研究中的应用J.物理,2007,36(6):452-459. 2 张敬莹,王世盛,赵伟杰,宋其玲,孟庆伟.龙胆草地上部分的化学成分J.天然产物研究与开发,2009,21:556-558.3 孙杨,丁晓琴,丁俊杰. 京尼平的制备、晶体结构及分子旋光度密度泛函计算Z.公共安全中的化学问题研究进展，2011,508-515.4 陈莉敏,林友文,蔡荣祥. 重视对固体口服药物多晶型的研究J.中国药业,2008,17(4):59-60.5 Shinya Honda,Toshihiko Akiba, Yusuke S. Kato,Yoshito Sawada,Masakazu Sekijima, Miyuki Ishimura, Ayako Ooishi, Hideki Watanabe,Takayuki Odahara, and Kazuaki Harata. Crystal Structure of a Ten-Amino Acid ProteinJ. J. AM. CHEM. SOC.2008,130,1532715331.6 吕扬