制药用水微生物检查方法的验证

1、微生物检查方法验证微生物检查方法验证 介绍内容介绍内容一、微生物的基础知识一、微生物的基础知识二、二、微生物检查方法验证微生物检查方法验证 微生物基础知识微生物基础知识 微生物（微生物（microorganism, microbe）是一些）是一些 肉眼看不见的微小生物的总称。肉眼看不见的微小生物的总称。 微生物（微生物（microorganism）包括细菌、支原）包括细菌、支原 体、螺旋体、衣原体、立克次体、病毒及真菌体、螺旋体、衣原体、立克次体、病毒及真菌 （霉菌、酵母菌和放线菌）等。（霉菌、酵母菌和放线菌）等。 微生物的特点微生物的特点 种类多种类多 分布广分布广 迄今为止，我们知道的微生

2、物约有迄今为止，我们知道的微生物约有10万种，目前万种，目前已知的种类只占地球上实际存在的微生物总数的已知的种类只占地球上实际存在的微生物总数的20%。 微生物的特点微生物的特点 各体小，面积大各体小，面积大 物体的表面积和体积之比称为表面积物体的表面积和体积之比称为表面积 大肠埃希菌的表面积是人的大肠埃希菌的表面积是人的30万倍。万倍。 微生物的特点微生物的特点 吸收多吸收多 转化快转化快 如大肠埃希菌在合适条件下，每小时可以消如大肠埃希菌在合适条件下，每小时可以消 耗相当于自身重量耗相当于自身重量2000倍的数量，而人体则倍的数量，而人体则 需要需要40年之久。年之久。 微生物的特点微生物

3、的特点 适应强适应强 易变异易变异 微生物按其结构、化学组成及生活习性等分微生物按其结构、化学组成及生活习性等分为三大类：为三大类： 细菌（细菌（bacterium）属于原核细胞型微生物，其）属于原核细胞型微生物，其特点是具有细胞壁、原始的核质，以二分裂方式特点是具有细胞壁、原始的核质，以二分裂方式繁殖。繁殖。 细菌的形态细菌的形态细菌体积微小，是无色半透明的，用肉眼直接观细菌体积微小，是无色半透明的，用肉眼直接观 察难以看到，其结构和形状须经过显微镜放大数百察难以看到，其结构和形状须经过显微镜放大数百 倍至上千倍才能观察。倍至上千倍才能观察。一般以微米（一般以微米（m）作为测量单位。）作为测

4、量单位。在细菌学中，按其形态可分为球菌、杆菌、弧菌在细菌学中，按其形态可分为球菌、杆菌、弧菌 和螺杆菌。和螺杆菌。经革兰染色法（经革兰染色法（Gram stain）可将细菌分成两大）可将细菌分成两大类：即革兰阳性菌（类：即革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（）和革兰阴性菌（G-）。）。 真菌（真菌（fungus；eumycetes） 是具有真核和细胞壁的生物。种类很多，已报道是具有真核和细胞壁的生物。种类很多，已报道的种超过的种超过10万个。大多是由纤细管状菌丝构成的万个。大多是由纤细管状菌丝构成的菌丝体。许多菌丝在一起统称菌丝体。菌丝体在菌丝体。许多菌丝在一起统称菌丝体。菌丝体在基质上生长的形态

5、称为菌落。基质上生长的形态称为菌落。 真菌的形态具有多样性，大小不一，大的用肉眼真菌的形态具有多样性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小的用普通光学显微镜放大数倍乃至可以看到，小的用普通光学显微镜放大数倍乃至千倍方可观察到。其形态分单细胞、多细胞，单千倍方可观察到。其形态分单细胞、多细胞，单细胞呈圆形或卵圆形，如酵母菌（细胞呈圆形或卵圆形，如酵母菌（yeast）。多）。多细胞由菌丝和孢子组成，并交织成团。细胞由菌丝和孢子组成，并交织成团。 药品污染常见的真菌药品污染常见的真菌 毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、木霉属毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、木霉属 一、毛霉属（一、毛霉属（Mucor Mic

6、heli ex Fries）毛霉属在自然界分布很广，常用于发酵工业。并引起水分毛霉属在自然界分布很广，常用于发酵工业。并引起水分高的粮食及食品的霉烂变质。高的粮食及食品的霉烂变质。根霉属（根霉属（RhizopusEhrenberg） 根霉属广泛应用于发酵工业，在潮湿的粮食及食品上能迅根霉属广泛应用于发酵工业，在潮湿的粮食及食品上能迅速蔓延生长，引起粮食及食品的腐烂。速蔓延生长，引起粮食及食品的腐烂。 曲霉属（曲霉属（Aspergillus） 曲霉属的菌丝无色、淡色或表面凝聚有色物质，为有隔的多细胞。曲霉属的菌丝无色、淡色或表面凝聚有色物质，为有隔的多细胞。本属的常见产毒霉菌有本属的常见产毒霉菌

7、有8个种，具有强烈的致癌性。个种，具有强烈的致癌性。 青霉属青霉属菌丝无色或有色，为有隔的多细胞。分生孢子梗从菌丝垂直生出，无菌丝无色或有色，为有隔的多细胞。分生孢子梗从菌丝垂直生出，无足细胞，顶端不膨大，无顶囊，产生一轮至数轮分叉，在最后一级分足细胞，顶端不膨大，无顶囊，产生一轮至数轮分叉，在最后一级分枝的小梗上，长出成串的分生孢子，形似扫帚状，称为帚状枝。本属枝的小梗上，长出成串的分生孢子，形似扫帚状，称为帚状枝。本属的常见产毒霉菌有的常见产毒霉菌有9个种，其中展青霉可产生展青霉素，是一种神经个种，其中展青霉可产生展青霉素，是一种神经毒素，并具有致畸、致突变和致癌性；毒素，并具有致畸、致突

8、变和致癌性； 霉菌菌落形态 霉菌在孟加拉红培养基上的形态霉菌在孟加拉红培养基上的形态 酵母菌显微镜下形态酵母菌显微镜下形态 微生物检查法微生物检查法 微生物限度检查方法系检查非规定灭菌制剂及其原料、微生物限度检查方法系检查非规定灭菌制剂及其原料、 辅料受微生物污染程度的方法。辅料受微生物污染程度的方法。 检查项目包括检查项目包括 细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。检查方法检查方法 多用平皿法、薄膜过滤法、涂抹法和多用平皿法、薄膜过滤法、涂抹法和 MPN 法。法。 检查方法的验证检查方法的验证 试验环境试验环境 无菌检查应在环境洁净度无菌检查应在环境洁净

9、度 10 000 级下的局部洁级下的局部洁 净度净度 100 级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。 检验依据检验依据 单向流空气区、工作台面及环境应定期按单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的的现行国家标准进行洁净度验证。现行国家标准进行洁净度验证。 -2010版药典版药典 隔离系统的应用隔离系统的应用 应用隔离系统重要的目的应用隔离系统重要的目的是保护产品免受外源性污染保证无菌实验结果的可靠性，实是保护产品免受外源性污染保证无菌实验结果的可靠性，

10、实现一次检出的要求。现一次检出的要求。是保护操作人员安全。是保护操作人员安全。 隔离系统隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。符合无菌检查的要求。 日常检验还需对试验环境进行监控。日常检验还需对试验环境进行监控。 方法验证的必要性方法验证的必要性为保证检验结果的可靠性，真实性，选择正确的检验方为保证检验结果的可靠性，真实性，选择正确的检验方法是至关重要的。因此试验前必须对选择的方法进行验法是至关重要的。因此试验前必须对选择的方法进行验证。证。 证明所采用的方法是适宜的，确认所采用的方法适宜于证明所采用的方法是适宜的，

11、确认所采用的方法适宜于被检供试品的微生物污染的检验。被检供试品的微生物污染的检验。 检验结果的影响因素检验结果的影响因素供试品的组分供试品的组分 抑菌剂、增溶剂、乳化剂及抗氧化抑菌剂、增溶剂、乳化剂及抗氧化 剂，这剂，这 些组分在一定浓度下对微生些组分在一定浓度下对微生 物起一定的抑制作用也可对污染菌物起一定的抑制作用也可对污染菌 造成损伤。造成损伤。环境影响环境影响 不同类型的微生物及不同的存活状态不同类型的微生物及不同的存活状态 对环境的抗性是不同的。对环境的抗性是不同的。检验方法检验方法检验条件检验条件 如培养基的质量、检验人员的操作误如培养基的质量、检验人员的操作误 差等。差等。 试验

12、全方面验证试验全方面验证 如试验环境，培养基，供试液的制备，灭菌方法等全部进如试验环境，培养基，供试液的制备，灭菌方法等全部进 行验证。行验证。 当验证试验符合要求时，就可认为在该试验条件下该供试当验证试验符合要求时，就可认为在该试验条件下该供试 品对微生物无抑菌作用或抑菌作用可忽略不计，供试品检品对微生物无抑菌作用或抑菌作用可忽略不计，供试品检 验结果可真实的体现。验结果可真实的体现。验证方法验证方法菌液制备菌液制备 5050100cfu/ml100cfu/ml。验证方法验证方法 试验组、菌液组、供试品对照组、释剂对照组。试验组、菌液组、供试品对照组、释剂对照组。结果判断结果判断 供试品组、

13、对照组、供试品组、对照组、稀释剂对照组的稀释剂对照组的菌回收率菌回收率 均不低均不低70% 70% 。验证方法验证方法 按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。验证试验至少应进行验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各次独立的平行试验，并分别计算各 试验菌每次试验的回收率。试验菌每次试验的回收率。试验菌株试验菌株 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、 白色念珠菌、白色念珠菌、 黑曲霉、枯草杆菌。黑曲霉、枯草杆菌。菌液制备菌液制备 同计数培养基的适用性检查。同计数培养基的适用性检查。 （1）试验组）试验组 平皿法平皿法 取最低稀释级供试液取最低稀释级供试液1ml和和50100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基脂培养基(平行制备平行制备2个平皿个平皿)，按平皿法测定其，按平皿法测定其菌数。菌数。 薄膜过滤法薄膜过滤法 取最低稀释级供试液，过滤，冲取最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入洗，在最后一次的冲洗液中加入50100c