大鼠Nogo基因片段的克隆及与GST融合蛋白的表达和纯化

1、大鼠Nogo基因片段的克隆及与GST融合蛋白的表达和纯化 作者：张萍 程希平 费玲玲 王春婷 杨浩 陈镔复 鞠躬 【关键词】 Nogo基因Cloning of adult rat Nogo gene segments and expression and purification of their coding protein fused with GST【Abstract】 AIM: To obtain rat Nogo gene segments, express efficiently in E. coli and purify the target proteins. METHODS:

2、 Nogo gene segments were amplified by RTPCR from normal adult SD rat spinal cord total RNA. After sequenced, the reconstructed expression vectors were constructed by enzyme digestion and subcloned into expression vector pGEX4T1. Then the vectors were transformed into E. coli DH5. Recombinant GST fus

3、ion proteins were expressed via the induction of IPTG and purified through glutathione agarose column. RESULTS: The sequences of cloned adult rat Nogo gene segments (570-691 and 1028-1089 amine acid residues) were identical with those earlier reported. Two protein bands of Mr39 000 and 32 000 appear

4、ed on SDSPAGE gel after the expressed GST fusion proteins were separated by SDSPAGE. Then the expressed fusion proteins were purified to high purity. CONCLUSION: The adult rat Nogo gene segments have been successfully cloned and efficiently expressed in E. coli, and the GST fused target proteins hav

5、e been purified to high purity.2 / 16【Keywords】 Nogo gene；cloning；expression；purification【摘要】 目的: 获取大鼠Nogo基因片段并高效表达纯化. 方法: 用RTPCR技术，从成年SD大鼠脊髓的总RNA中，获得编码Nogo基因功能片段的DNA. 测序后，通过酶切亚克隆至表达载体pGEX4T1，构建重组表达载体，并导入E. coli DH5中，IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白. 对重组融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化. 结果: 获得成年SD大鼠Nogo(570691和10281089氨基酸残基)的基因

6、，测序结果与已发表的基因序列相一致. 重组GST融合蛋白经SDSPAGE分析，在相对分子质量（Mr） 39 000和32 000处，有特异的蛋白条带. 重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化后，得到了高纯度的融合蛋白. 结论: 成功克隆成年大鼠Nogo基因片段，并在E. coli DH5中高效表达，亲和层析后获得高纯度GST融合蛋白.【关键词】 Nogo基因；克隆；表达；纯化0引言哺乳类动物中枢神经损伤后再生困难, 是由于各种营养因子严重匮乏；又存在抑制轴突再生的分子1. 牛神经突起生长抑制因子bNI220 2，以及大鼠和人的bNI220同族体Nogo分子的纯化和鉴定3，4，是中枢神经再生抑制因子

7、研究的重大突破. Nogo被认为是重要的神经突起生长抑制因子5. 为进一步研究Nogo的功能及寻找针对Nogo可能的功能抑制剂，我们尝试克隆表达Nogo片段.1材料和方法1.1材料寡聚核苷酸引物由北京赛百盛公司合成；RNA提取试剂Trizol购自美国Gibco公司；pGEX4T1质粒购自瑞典Pharmacia公司；pGEMT easy载体、RTPCR试剂盒及Tvector试剂盒、各种限制性内切酶、连接酶及Taq DNA聚合酶均为美国Promega公司产品；DNA酶和高纯质粒提取试剂盒为德国Boehringer Mannheim公司产品；IPTG, DTT, DTE, 胱胺、谷胱甘肽琼脂糖及还原

8、性谷胱甘肽，均为Sigma公司产品；其余一般化学试剂均为国产分析纯. 成年SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供.1.2方法1.2.1Nogo片段的扩增取成年SD大鼠的脊髓，按照Trizol操作指南提取总RNA，并以此为模板进行RTPCR，扩增Nogo氮端623640氨基酸残基及胞外段的10241089氨基酸残基的cDNA片段，分别命名为NogoN和Nogo66. NogoN的引物序列如下：5端引物：5GGAATTCACAGCACAGCTTTGC CCAT3，3端引物：5GCGTCGACTTAATCTGGACTTGGCTCAGTGGA3；Nogo66的引物序列如下：5端引物：5GGAATTCT

9、ATAAGGGCGTGATCCAG G3，3端引物：5AACTGAGGCGGCTTTTCTTATAAGTCGACGC3. 48 45 min反转录，94 变性，55 复性1 min 5个循环，60 复性1 min 30个循环.1.2.2RTPCR产物的克隆与鉴定回收RTPCR产物， 与质粒pGEMT Easy进行连接反应，转化感受态DH5. 挑取白色菌落进行酶切鉴定，所获阳性克隆命名为pGEMNogoN和pGEMNogo66，送至上海申友公司进行测序. 经EcoR，Sal双酶切后与经同样酶切的pGEX4T1进行连接反应，挑选的阳性克隆子命名为pGEXNogoN和pGEXNogo66.1.2.3

10、目的蛋白的诱导表达和纯化工程菌在含氨苄青霉素（100 mg・L-1）的LB培养基中过夜培养，按10%的接种量进行转接，250 r・min-1, 37摇菌至A600=1，加入异丙基D硫代半乳糖苷至终浓度为0.5 mmol・L-1，37继续通气培养45 h. 取1.5 mL菌液，7734 g离心30 s收集菌体，菌体加入H2O 60 L，剧烈振荡混匀，再加入4×样品缓冲液20 L，100，5 min；7734 g离心5 min；100 g・L-1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，预计相对分子质量（Mr）

11、 32和39×103处有明显的蛋白表达. 大规模培养细菌，诱导表达目的蛋白，收集菌体，超声破菌. 离心后将上清和沉淀分别制样，进行SDSPAGE. 可溶的目的蛋白直接应用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱进行亲和层析纯化. 以包涵体形式存在的表达产物. 用N十二烷基肌氨酸钠将沉淀蛋白质变性过夜，经缓慢透析去除N十二烷基肌氨酸钠，令蛋白复性后，用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱对目的蛋白进行亲和层析纯化.2结果2.1Nogo片段的扩增及序列测定RTPCR扩增Nogo66和NogoN的部分cDNA，分别得到182 bp和384 bp的片段（Fig 1）. 挑取含插入片段的阳性克隆pGEMNogoN和pGE

12、MNogo66，用高纯质粒提取试剂图1NogoN和Nogo66 RTPCR扩增结果(略)盒提取质粒，测序结果表明所扩增的NogoN和Nogo66与GeneBank公布的序列相符.2.2表达载体的构建pGEMNogoN和pGEMNogo66经EcoR，Sal双酶切后与经同样酶切的pGEX4T1进行连接反应后，转化感受态细胞5，挑选的克隆子进行酶切鉴定，切出约182 bp或384 bp大小片段的为阳性克隆子（Fig 2），命名为pGEXNogoN和pGEXNogo66.图2pGEXNogoN和pGEXNogo66重组质粒酶切鉴定图谱(略)2.3重组蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化将pGEXNogoN和

13、pGEXNogo66转化入E.coli DH5，IPTG诱导，SDSPAGE电泳表明工程菌表达了相应分子质量的GST融合蛋白(Fig 3). 对菌体总蛋白上清和沉淀蛋白分别进行电泳分析，发现GSTNogoN融合蛋白90位于菌体蛋白的可溶性上清中，上清直接经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化，得到Mr约39×图3GSTNogoN融合蛋白的表达及纯化(略)103的目的蛋白. 而GSTNogo66融合蛋白主要位于不溶的包涵体中，对包涵体蛋白用N十二烷基肌氨酸钠变性处理过夜，经缓慢透析除去N十二烷基肌氨酸钠，蛋白复性后，过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化，得到Mr约39×103的目的蛋白(Fig

14、 4).图4GSTNogo66融合蛋白的表达及纯化(略)3讨论近年来对中枢神经系统(CNS)纤维再生的认识已发生了根本性改变6，7. 目前的共识是，成年CNS神经元再生能力弱、中枢环境对再生不利1. 在中枢环境众多不利因素中，近年来发现主要为与髓鞘相关的蛋白，其中尤以Nogo最为重要8. Nogo对神经突起的生长具有很强的抑制作用. 而mAb IN1的在体应用大大促进了中枢神经损伤后功能的恢复9. Nogo功能位点可能位于其氮端623640的氨基酸残基3及胞外段的10241089氨基酸残基4. 这样，制备含Nogo功能区段的重组蛋白对于进一步研究Nogo的功能及制备其功能抑制性抗体将十分重要.

15、 为此，我们克隆表达了Nogo的570691和10281089的氨基酸残基两个区段，为研究Nogo的中枢神经再生抑制功能和制备其功能封闭性抗体提供有利的保障.我们成功地表达了GSTNogoN和GSTNogo66. GSTNogoN位于细菌诱导表达产物的上清中，直接应用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化. 而GSTNogo66位于包涵体中，工程菌经超声破菌，离心后用N十二烷基肌氨酸钠对包涵体蛋白变性. N十二烷基肌氨酸钠是一种温和的阴离子去垢剂，可溶解许多包涵体蛋白. 当用透析或层析将它从蛋白质中去除时，即可使蛋白质复性. N十二烷基肌氨酸钠处理变性的GSTNogo66包涵体蛋白,经缓慢透析降低N十二烷

16、基肌氨酸钠浓度后，蛋白得到很好的复性，过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化后，得到Mr 32×103的目的蛋白. 实验证明N十二烷基肌氨酸钠可以将包涵体蛋白变性，而缓慢透析降低N十二烷基肌氨酸钠浓度可使包涵体复性，是一种有效地纯化包涵体蛋白的方法.【参考文献】1 Dumont AS, Dumont RJ, Oskouian R J. Will improved understanding of the pathophysiological mechanisms involved in acute spinal cord injury improve the potential for the

17、rapeutic intervention J? Curr Opin Neurol, 2002; 15(6):713-720.2 Spillmamm AA, Bandtlow CE, Lottspeich F, Keller F, Schwab ME. Identification and characterization of a bovine neurite growth inhibitor (bNI220)J. J Biol Chem, 1998; 273(30): 19283-19293.3 Chen MS, Huber AB, Haar ME, Frank M, Schnell L,

18、 Spillmann AA, Christ F，Schwab ME. NogoA is a myelinassociated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN1J. Nature, 2000; 403(6768): 434-439.4 Grandpre T, Nalamura F, Vartanian T, Strittmatter SM. Identification of the Nogo inhibitor of axon regeneration as a Reticulon proteinJ. Nature, 2000; 403(6768): 439-444.5 Grandpre T, Strittmatter S. Nogo: A molecular determinant of axonal growth and regeneration J. Neuroscientist,