兰州熊蜂卵黄原蛋白基因的转录调控

1、兰州熊蜂(膜翅目：蜜蜂科)卵黄原蛋白基因的转录调控 在生殖过程中 ,卵黄原蛋白作为卵黄前体 , 是卵生生物包括昆虫中非常重要 的。卵黄原蛋白的转录通常是由激素调控的 , 比如保幼激素、蜕皮激素及某些神 经肽。关于昆虫卵黄原蛋白的转录调控研究主要集中在双翅目与鳞翅目, 膜翅目昆虫的卵黄原蛋白转录调控研究较少。兰州熊蜂作为一种重要的授粉昆虫 , 扩大其 繁殖量, 产生更多的工蜂后代可更好地满足实际应用中授粉的需求。基于此, 研究兰州熊蜂的转录调控具有十分重要的意义。主要结果如下 :1、 兰州熊蜂卵黄原蛋白基因结构及表达特性兰州熊蜂卵黄原蛋白基因 (Genbank 号:MF632304)全长为722

2、7bp,包含7个外显子和6个内含子,其mRNA(Genbank 号:MF632303)序列长度为5319bp,编码的蛋白长度为1772个氨基酸、分子量 201.5 kDa 及等电点为 6.21 。对兰州熊蜂的卵黄原蛋白 (BlVg) 进行保守域分析 , 发现其具有典型的卵黄原 蛋白结构域：第一，在N端附近的Vitellogenin_N保守域从第28个氨基酸开始，到第750个氨基酸终止；第二，中间部位有保守域DUF1943自第783个氨基酸起 至第1043氨基酸；第三，在C端第1450个氨基酸至第1620个氨基酸为保守域VWD 通过系统进化分析发现 , 其与其他熊蜂物种位于一个分支上。分别取处女

3、蜂王及产卵蜂王的头、飞行肌、卵巢与脂肪体组织 ， 采用实时荧 光定量PCF方法检测BlVg的mRN表达量。qRT-PCR吉果显示，相同生殖状态下 的蜂王，在脂肪体中表达量最高 (处女王为 383.9-倍；产卵蜂王为 3357.07倍)， 飞 行肌、头次之 ， 卵巢最低 ， 且不同组织之间均存在显著性差异 (p&lt；0.05)。在相同组织中，产卵蜂王的BlVg的mRNAft达量显著高于处女蜂王(p<0.05) 。2、兰州熊蜂转录因子 Broad-Complex 基因的特征及真核表达兰州 熊蜂Broad-Complex基因选择性剪切体众多,通过PCR获得Z1-Z4这四种剪切

4、体, 分别命名为 BlBrC-Z1 、2、BlBrC-Z3 和 BlBrC-Z4, 它们的核苷酸长度分别为 1491 bp、1293 bp 、1257 bp 与 1239 bp 。兰州熊蜂BIBrC蛋白具有典型的Broad-Complex蛋白应有的保守域：第一， 在N端附近的中心区域由BTB保守域及Linker组成；第二,在C端为各种选择性 剪切体特异的锌指结构域。通过与兰州熊蜂基因组数据 (未发表)比对,发现这四 种剪切体在DNA上的排列顺序为Z4、Z3、Z2、Z1。通过荧光定量PCR发现,与处女蜂王相比,产卵蜂王的卵巢中BlBrC-Z1与 BlBrC-Z3表达量显著升高。将这四种剪切体构建

5、至 pBmFlag-B1BrC重组质粒进 行真核表达。通过 Western blot 证明这四个蛋白均成功表达。 3、兰州熊蜂卵黄原蛋白基 因BlVg启动子的活性分析采用染色体步移法,以兰州熊蜂腹部DNA为模板,获得 卵黄原蛋白基因BlVg起始密码子上游1517 bp长度的5'侧翼序列。生物信息学分析显示,该序列具有TATAbox CAATbox C/EBP等基本元件和 DBrC3 DE74等响应蜕皮激素信号的重要结合元件。随后构建不同长度的启动子 缺失片段 , 最后利用瞬时转染技术分析该基因启动子的转录活性及调控应答激素 的相关元件。结果显示, 保幼激素诱导没有显著改变 BlVg 启动子的活性 ,而 20-羟基蜕皮 酮对BlVg启动子活性具有明显的诱导作用。4、转录因子Broad-Complex对BlVg 启动子活性的调控作用运用点突变技术，发现启动子上DBrC3结合位点碱基的突 变会导致其不能被20-羟基蜕皮酮诱导；此