PCR技术的过程和意义

1、PC限术的过程和意义一、PCRfc术的根本原理类似于DNA勺天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核昔 酸引物。PCR1一种体外DNA扩增技术，是在模板DNA引物和4种脱氧核甘酸存在 的条件下，依赖于DNAK合酶的酶促合反响，将待扩增的DNAt段与其两侧互补 的寡核甘酸链引物经高温变性一一低温退火一一引物延伸三步反响的屡次循 环，使DN*段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特 定基因片段。在环境检测中，靶核酸序列往往存在于一个复杂的混合物如细胞提取液中， 且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。使用PC曲术可将靶序列放大几个数量

2、级，再用探针杂交探测对被扩增序 列作定性或定量研究分析微生物群体结构。二、PC淑术的步骤PCRtt变性-退火-延伸三个根本反响步骤构成： 1、模板DNAB变性模板DNAS加热至93c左右一定时间后，使模板 DNAK链或经PCFT增形 成的双链DNA单离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作准备； 2、模板DNAtf引物的退火（复性）模板DNAS加热变性成单链后，温度降至 55c左右，引物与模板DNAI链 的互补序列配对结合； 3、引物的延伸DNA真板-引物结合 物在TaqDNAK合酶的作用下，以dNTF%反响原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板DNA链互

3、补的半保存复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保 存复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 （Plateau） 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 三、PCRfc术的意义1、特异性强PCRE响的特异性决定因素为：引物与模板DNA($异正确的结合；碱基配对原那么；Taq DN咪合酶合成反响的忠实性；靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原那么的。聚合酶合成反响的忠实性及 TaqDNAK合酶耐高温性，使 反响中模板与引物的结合复

4、性可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大 增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。 再通过选择特异性和保守 性高的靶基因区，其特异性程度就更高。2、灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克 (pg=10-12量级的起始 待测模板扩增到微克以g二6水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在 病毒的检测中，PCR勺灵敏度可达3个RFU空斑形成单位；在细菌学中最小检 出率为3个细菌。3、简便、快速PC阪响用而寸高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反响液加好后，即在 DNA 扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反响，一般在24小时完成扩增反响。 扩增产物一般用电泳分析，不一

5、定要用同位素，无放射性污染、易推广。4、对标本的纯度要求低不需要别离病毒或细菌及培养细胞， DNA粗制品及RNA匀可作为扩增模板。 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNAT增检测。四、PCRK术主要应用的领域1、核酸的根底研究：基因组克隆2、不对称PCR®J备单链DNAffl于DNAW序3、反向PCRM定未知DNAg域4、反转录PCRRT-PCR用于检测细胞中基因表达水平、RNAW毒量以及直接克隆特定基因的cDNA5、荧光定量PCRffl于对PCR物实时监控6、cDNAHC端快速扩增技术7、检测基因的表达8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊

6、断月中瘤；应用于法医 物证学。五、关于RT-PCR4月17日，在北京检验检疫局承当的国家质检总局科技方案工程“禽流感 病毒H7N9亚型双重荧光RT-PCRS型技术研究鉴定会上，专家组一致认为：该 工程创新性地实现了对禽流感病毒 H7N9亚型的一步快速定型，可在一次检测中 确认样品中是否存在H7N9亚型禽流感病毒或其他H7亚型和N9亚型的禽流感病 毒;在通用性、特异性、灵敏性上，技术优势突出。专家组同意工程成果通过鉴 定，并建议在进一步扩大和完善动物临床验证实验根底上，尽快推广应用。RT-PCR为反转录 RCR reverse transcription PCR 和实时 PCRreal time PCR共同的缩写。逆转录PCR或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)是聚合酶链式反响(PCR)的一种广泛应用的变形。在 RT-PCR, 一条 RNAg被逆转录成为互补DNA再以此为模板通过PCR®T DNAT增。RT-PCRg 术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平， 细胞中RNAW毒的含量 和直接克隆特定基因的cDNAff列。作为模板的RNA以