血脂各个项目的不同测定方法

1、血活脂类测定血浆中的脂类包括胆固醇、胆固醇脂、甘油三酯、磷脂和非酯化脂肪酸等。目前，对有关脂类代谢疾患的诊断和治疗过程， 均必须检测血浆（活）中的脂类， 通过其含量的变化，对临床疾患提供协助诊断的依据。 有关医学科研工作，脂类 的定量检测也是一项必备的研究项目。1 .胆固醇测定血浆中胆固醇及其酯的含量检测，从方法学上可分为两大类：一类是化学法包括 抽提法和直接测定法，这类方法目前仍在沿用；另一类是酶法测定，方法敏感特 异快速，并能自动化分析，已常规应用。化学测定法种类多，由于显色反应的特 异性不同，其结果有一定的差异。目前公认的参考方法是Abell-Kendall（L-B反应）法。另外，三氯化

2、铁-硫酸反应法（Zak法）具有显色稳定法、操作简便、 灵敏度约5倍于L-B反应法，胆固醇酯与游离胆固醇显色程度比较接近等优点， 缺点是特异性差，十扰因素比L-B法多，如冰醋酸中含有的乙醛酸，血活样品中 的血红蛋白，胆红素以及硫酸的质量等因素均可影响Zak方法的准确性，Zak法更适合于科研使用。酶法测定血活胆固醇的方法已被广泛采用，国产试剂已能满足临床的需要。胆固醇测定用的标准品，按美国国家标准局（ NBS出品纯度达 99.8%，是国际公认的参考物，国内李健斋等已纯化制成符合这一要求的胆固醇纯 品，已供临床检测血活胆固醇使用。2. 甘油三酯测定血浆甘油三酯的测定，目前多以化学法和酶法定量。化学法

3、测定甘油三酯是以脂 蛋白变性，水解成甘油，并以甘油为计算依据。酶法是以特异酶水解甘油三酯， 除去脂肪酸，再测定甘油，方法特异，准确而快速，临床广为应用。目前甘油三 酯测定的方法主要以定量甘油为依据，然而血活样品中存在有游离甘油，如何从反应过程中的总甘油中减去游离甘油，多年来一直在研究讨论这一问题。 若不减去，其测定值将会高于血活样品中的真值， 如果要减去，就必须先测出血活样品 中的游离甘油，甘油三酯的测定方法将增加一个繁杂的步骤，实际工作中难以做 到。有报道血活样品中的游离甘油实际量是 0.070.13mmol/L,相当于甘油三 酯的0.56.0mmol/L ,为此建议，实测的甘油三酯量减去一

4、个校正系数即：甘油三酯（mmol/L） =0.98 X 总甘油（mmol/L） -0.07 （mmol/L）。这一校正系数也仅适用于健康人， 对临床病人并不一定适用。据报道，血活样品 的游离甘油一直是个未知数，无法测准。为此，目前临床测定血活甘油三酯时， 基本上未考虑游离甘油，因为其含量很少，暂且忽略不记。甘油三酯测定的参考 物，推荐三油酸甘油酯和三软脂酸甘油酯混合物（2： 1, w/vy ,此参考物适用 于化学法。在酶法测定中，仍以高纯度的三油酸甘油酯为参考物。3. 磷脂测定血活磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神经磷脂、脑磷脂和其他少量磷脂。如需要 分别检测各种磷脂，可以通过薄层层析法、柱层析法

5、和高压液相色谱法。目前， 临床仅测定血活磷脂总量。血活磷脂总量的测定方法有化学方法和酶法两大类。 化学法是以磷脂中的磷为定量依据，因为每磷脂分子中都含有一个磷酸根， 故将 磷脂的磷称为脂性磷。由于血活中磷脂大部分为卵磷脂，其分子量中磷约占4%故将脂性磷换算成磷脂的系数，一般为 25。由于化学法均需要抽提，再测抽提 液中的磷脂的磷，血活中的磷酸盐不可能混入抽提液中， 因此血活中的磷酸盐对 磷脂测定的十扰很少。酶法是利用磷脂酶进行定量测定。 生物体中磷脂酶包括磷 脂酶Ai、A、C和D四种。磷脂酶D特异性差，均可水解卵磷脂、溶血卵磷脂和 神经磷脂，三者约占血活总磷脂的95%临床多用含磷脂酶D的试剂进

6、行磷脂的 定量测定。4. 游离脂肪酸测定游离脂肪酸届于未酯化的一类脂肪酸， 故乂称为非酯化脂肪酸，其量很少，采用 方法必须是灵敏的方法，还需要避免脂肪水解产生脂肪酸的十扰。测定方法有： 滴定法需要微量滴定装置，因为要通过肉眼观察颜色，难免会有主观因素的影 响，所以难以测定准确，彳艮难用于常规；光度法，以铜皂法常用；酶法，主 要采用特异性不强的脂肪酶 D进行检测，方法特异，快速准确，已常规应用于临 床。第一节胆固醇测定 血活中胆固醇包括 CE和FC,酯型的CE占70% FC占30% CE中的G的-OH在 LCAT乍用下，可分别结合业油酸（43%、油酸（24%、软脂酸（10%、业麻 油酸（6%、花

7、生四烯酸（6%、硬脂酸（3%等脂肪酸结合而成。血活中胆固 醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL CMR少。血活总胆固醇测定方法分为化 学法和酶法两大类。1. 化学法化学法一般包括：抽提；皂化；毛地黄皂苜沉淀纯化；显色比色四个阶 段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通过步骤操作过程。常规操作中多 采用省去了、。或者用省去、步骤的Zak-Henly法及省去步骤的Abell-Kendall法,现将此法作为标准参考方法予以引用。2. 酵法测定CE在胆固醇酯酶（cholesterol esterase ）作用下水解成FC和NFFA TC再经 胆固醇氧化酶（cholesterol oxidas

8、e,COD）氧化成ZM 胆笛烯酮和H2Q。再分别 定量Q的消耗或者fQ的生成量，或A4胆笛烯酮生成量，以作为TC的定量依 据。该法是目前常规的应用方法，快速准确，标本用量少，便于自动生化分析仪 作批量测定。一、Abell-Kendall 改良法1. 原理血活加入醇溶性氢氧化钾，使胆固醇从脂蛋白中分离出来，同时使胆固醇酯加水 分解成游离胆固醇，加石油酰振摇、抽提，使胆固醇移入石油酰层，分离并取一 定量的石油酰层，蒸发至十，再进行 Liebermann-Burchard 显色反应，620nm 比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。2. 试剂组成贮存代号种类浓度组成2 8C有效时

9、间R1乙醇优质纯R2石油酰沸点68 C ,特级纯R3水醋酸分析纯R4无水醋酸胆固醇分析用，不含HCIR5浓硫酸分析纯R6 KOK33%(W/W)KOH10g+H)20mlR7 乙醇性KOH®R194ml+R66ml临用前1己制R8 Liebermann配制后R420体积+R51体积Burchard+R310体积1h试剂*内用完R9胆固醇标准液5.17mmol/L胆固醇标准品0200mg+R 1100ml* :在三角烧瓶内，加入无水醋酸，于冰水中冷至10C以下，再慢慢加入浓硫酸, 混合，静置10min, 乂加冰醋酸混匀，备用。3. 操作检作皂化rtlffi(ntl)R90J).L空白杯

10、本0.22.0停m *0.2Z0抽捉'*L振摇，7 V lh再 1取出平衡专室沮 5.05.02.0X0 J一 R2 同）顷（ml）2.01_V充分桐匀4 1 OQOr/min,20两心5min2.0/藩发T爆L - B 反应 R8(ml)3DV|置60 C水您，使1右油醵旅干3.010 ，130mm以空曰性谓蜜， 测定光茫度（6?。加）图15-1血清胆固醇（Abell法）测定操作图4. 计算标准总胆固醇浓度=Esa/EstX 5.17（mmol/L）二、酶法（CEH COD-POD）首先将血活中胆固醇酯在胆固醇酯酶（CEH水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固 醇在胆固醇氧化酶（COD作用下

11、，生成-胆笛烯酮和RQ,再RQ经过氧化 物酶（POD作用在4-氨基安替比林（4-AA-P）及N-乙基-N- （3-磺基醋酸）-3 甲氧基苯胺（N-ethyl-N-（3-sulfopropyl）-manisidine,ESPAS ）参与下，生成红 色西昆业胺色素。胆固醇酷*游肉胆固醇+脂肪酸胆固踪W> A七胆留堆胡T比。2H2O2 + ESPAS+ J镇基安替比林f红色醍亚胺色素H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林r红色醍亚胺色素(一)手工测定法1.试剂组成代号种类NaHPONaRPO胆酸钠4-氨基安替比林R1* ESPASCarbowax-6000CEHCODPODR2标准液浓度组成贮

12、28C 有效时间50mmol/L50mmol/L3mmol/L0.82mmol/L14mmol/L 0.17mmol/L 33U/L 117U/L 6700U/L5.17mmol/L24h用异丙醇溶解 胆固醇*混匀，调pH至6.70 土 0.10(25 C),或购买试剂盒。酶以活性单位表示。2.操作按图15-2操作。3. 计算标准总胆固醇浓度=Esa/EstX 5.17(mmol/L)(二)自动化分析仪测定以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。1. 试剂组成A液：CEH POD抗坏血酸氧化酶等。B液：COD 4-氨基安替比林等。操作预加温RI(nd)穿白管测定管 标准管3,03.03,0437匚预温lOmin r (H/Xgl 30水超及显色醒滑(仍30I R4(pl)30i 37 rjOmin 反应以空白管调零，/、5O0nmt测光密度昏jEsa%图15-2血清胆固醇测定(酶法)操作图2. 上机参数项目方法波长反应温度试剂A反应时间试剂B反应时间样本用量试剂A用量试剂B用量单位参数 终点法双波长(540nm 700nn)37 C2 3min5 6min3 i l250 p