实验四DNA回收纯化及重组体的构建 ppt课件

1、实验四实验四 DNA回收纯化及重组体的构建回收纯化及重组体的构建实验目的和要求实验目的和要求学习和掌握从学习和掌握从PCRPCR产物中回收产物中回收DNADNA片段的方法。片段的方法。并了解从琼脂糖凝胶中纯化并了解从琼脂糖凝胶中纯化DNADNA片段的有关技片段的有关技术。术。本实验采用粘末端衔接法将本实验采用粘末端衔接法将PCRPCR扩增的扩增的DNADNA片段片段插入到插入到pBluescript KSpBluescript KS质粒载体中，掌握质粒载体中，掌握DNADNA重组方法。经过本实验了解重组方法。经过本实验了解DNADNA重组技术在分重组技术在分子生物学研讨中的重要意义。子生物学研

2、讨中的重要意义。 DNA片段的纯化：片段的纯化： DNA纯化的主要目的是纯化的主要目的是回收得到纯的目的回收得到纯的目的DNA片段，去除影响片段，去除影响DNA衔接酶活性的物质以及其它的衔接酶活性的物质以及其它的DNA片片段。纯化段。纯化DNA片段的方法有多种，如：电片段的方法有多种，如：电洗脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回洗脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回收、玻璃珠纯化、柱层析以及硅胶吸附等收、玻璃珠纯化、柱层析以及硅胶吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接从方法。目前一些生物公司推出了直接从 PCR产物中或琼脂糖凝胶中回收产物中或琼脂糖凝胶中回收DNA片段片段的试剂盒，有效地加快了的试

3、剂盒，有效地加快了DNA的纯化的速的纯化的速度。度。相关根底知识相关根底知识 DNA重组本质上是一个酶促生化过程，是指重组本质上是一个酶促生化过程，是指将外源目的基因片段经过将外源目的基因片段经过DNA衔接酶的的作衔接酶的的作用插入到质粒载体中的过程。用插入到质粒载体中的过程。DNA片段只需片段只需与载体重组并转入适宜的宿主细胞中才干进与载体重组并转入适宜的宿主细胞中才干进展复制。经过此方法可以对单个基因的功能展复制。经过此方法可以对单个基因的功能进展研讨。结合进展研讨。结合PCR技术还可以运用于疾病技术还可以运用于疾病诊断、合成具有商业意义的产品，如胰岛素、诊断、合成具有商业意义的产品，如胰

4、岛素、干扰素等。干扰素等。DNA重组重组由于载体具有可以在特定宿主细胞中独立自我由于载体具有可以在特定宿主细胞中独立自我复制的复制起始点，保证插入的外源片段的复复制的复制起始点，保证插入的外源片段的复制；并且具有多个限制性内切酶的单一位点，制；并且具有多个限制性内切酶的单一位点，即多克隆位点，用于插入外源片段，而又不破即多克隆位点，用于插入外源片段，而又不破坏质粒本身的构造；还具有易于挑选和检测的坏质粒本身的构造；还具有易于挑选和检测的标志性基因，如抗药性基因、酶基因或营养缺标志性基因，如抗药性基因、酶基因或营养缺陷型等。但针对不同的研讨目，选择的择载体陷型等。但针对不同的研讨目，选择的择载体

5、也是不同的，不仅要思索上述特性，而且还要也是不同的，不仅要思索上述特性，而且还要思索所选载体是表达载体还是非表达载体、是思索所选载体是表达载体还是非表达载体、是真核生物表达载体还是原核生物表达载体以及真核生物表达载体还是原核生物表达载体以及酶切位点等方面的问题。酶切位点等方面的问题。载体的选择：载体的选择：主要有两种：主要有两种：T4T4噬菌体噬菌体DNADNA衔接酶和大肠杆衔接酶和大肠杆菌菌DNADNA衔接酶。衔接酶。E. coli DNA E. coli DNA 衔接酶催化衔接酶催化DNADNA分子衔接的机理与分子衔接的机理与T4T4噬菌体噬菌体DNADNA衔接酶衔接酶根本一样，只是辅助因

6、子不是根本一样，只是辅助因子不是ATPATP而是而是NAD+NAD+。T4T4噬茵体噬茵体DNADNA衔接酶催化衔接酶催化DNADNA衔接反响分为衔接反响分为三步。三步。DNA衔接酶衔接酶 T4噬菌体DNA衔接酶还有一种E. coli DNA衔接酶没有的特性即将两个平末端的双链DNA分子衔接起来的功能。对于这种衔接反响的机理目前还不清楚，总的来说这种衔接的效率比粘性末端的衔接效率要低得多，可以是由于平末端DNA分子无法构成类似粘性末端分子那样的相对稳定的构造。WeissWeiss单位单位WeissWeiss等等,1968,1968，是指在，是指在37oC37oC下下2020分钟内催化分钟内催化

7、1nM 32P1nM 32P从焦磷酸根置换到从焦磷酸根置换到 , ,- -32P ATP32P ATP所需酶量；所需酶量；NEBNEB公司，粘性末端将公司，粘性末端将1 1g g由由HindIIIHindIII酶解酶解的的DNADNA的的1212碱基对粘性末端在碱基对粘性末端在160C160C条件下、条件下、3030分钟、分钟、2020l l反响体系中衔接反响体系中衔接5050时所需酶量。时所需酶量。(Takara(Takara公司公司) )在在2020l l的反响体系中，的反响体系中，6 6g g的的DNA-HindIIIDNA-HindIII的分解物在的分解物在160C160C反响反响30

8、30分钟时，分钟时，有有9090以上的以上的DNADNA片段进展衔接的酶的活性为片段进展衔接的酶的活性为1U1U。 相当于相当于 ATP-PpiATP-Ppi交换反响中交换反响中0.008 Weiss U0.008 Weiss U。对于对于T4-T4-噬菌体噬菌体DNADNA衔接酶的活性测定至少有衔接酶的活性测定至少有三种以上的方法：三种以上的方法：衔接反响的一项重要参数是温度。实践上衔接反响的一项重要参数是温度。实践上讲衔接反响的最正确温度是讲衔接反响的最正确温度是37，此时衔，此时衔接酶的活性最高。但接酶的活性最高。但37时粘性末端分子时粘性末端分子构成的配对构造极不稳定，因此人们找到构成

9、的配对构造极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限制地发扬衔接酶的活性，了一个既可最大限制地发扬衔接酶的活性，又有助于短暂配对构造稳定的最适温度即又有助于短暂配对构造稳定的最适温度即1216。DNA的衔接主要有粘性末端和平端衔接法，的衔接主要有粘性末端和平端衔接法，这些主要根据外源片段的末端性质、质粒这些主要根据外源片段的末端性质、质粒性质以及两者的酶切位点来确定。性质以及两者的酶切位点来确定。 衔接衔接粘末端衔接法粘末端衔接法假设假设DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。同源粘性末末端，这将是最方便的克隆途径。同源粘性末端包括一样内

10、切酶产生的粘性末端和不同的内端包括一样内切酶产生的粘性末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端。一样内切酶产生的切酶产生的互补粘性末端。一样内切酶产生的粘末端衔接得到的重组质粒可以保管接合处的粘末端衔接得到的重组质粒可以保管接合处的限制酶切位点，因此可以运用原来酶将插入片限制酶切位点，因此可以运用原来酶将插入片段从重组体上完好地重新切割下来。而不同酶段从重组体上完好地重新切割下来。而不同酶产生的粘性末端衔接得到的重组质粒不可以保产生的粘性末端衔接得到的重组质粒不可以保管接合处的限制酶切位点，因此不可以运用原管接合处的限制酶切位点，因此不可以运用原来酶将插入片段从重组体上完好地重新切割下来酶将插入片

11、段从重组体上完好地重新切割下来。以上两类粘性末端的衔接方法都很重要。来。以上两类粘性末端的衔接方法都很重要。另外，当用单酶切时，虽然产生了互补的粘性另外，当用单酶切时，虽然产生了互补的粘性末端，但由于载体存在自连景象，也会降低正末端，但由于载体存在自连景象，也会降低正确插入的频率。经过一些处置可以减少自连景确插入的频率。经过一些处置可以减少自连景象的发生。常用的方法是用小肠碱性磷酸酶象的发生。常用的方法是用小肠碱性磷酸酶(CIP)去掉载体去掉载体5-磷酸来到达抑制磷酸来到达抑制DNA片段的片段的本身环化的目的。本身环化的目的。综上所述，在进展基因重组时，普通采用插入综上所述，在进展基因重组时，

12、普通采用插入片段及载体两端具有两个相应的可以产生粘性片段及载体两端具有两个相应的可以产生粘性末端的酶进展酶切后重组，如插入片段和载体末端的酶进展酶切后重组，如插入片段和载体的一端为的一端为EcoR I ，另一端为，另一端为BamH I，它们都，它们都能产生粘性末端，不仅易于衔接，而且又不能能产生粘性末端，不仅易于衔接，而且又不能互补，所以可以得到较好的重组结果。互补，所以可以得到较好的重组结果。平端衔接法：平端衔接法：待插入片段的平末端主要由两方面来源，即由待插入片段的平末端主要由两方面来源，即由酶切后产生的平端和补平后产生的平端。普通酶切后产生的平端和补平后产生的平端。普通由酶切产生的平端较

13、易衔接。但在实验过程中，由酶切产生的平端较易衔接。但在实验过程中，往往会遇到插入片段和载体之间没有互补的末往往会遇到插入片段和载体之间没有互补的末端，这时，就需求将末端进展端，这时，就需求将末端进展“补平或去除补平或去除3突出端，然后再用突出端，然后再用T4噬菌体噬菌体DNA衔接酶衔衔接酶衔接两个平端。不过，平端衔接的效率是比较低接两个平端。不过，平端衔接的效率是比较低的，普统统过提高的，普统统过提高DNA的浓度或添加衔接酶的的浓度或添加衔接酶的用量可提高平端的衔接效率，有时也可采取在用量可提高平端的衔接效率，有时也可采取在平端加上合成的接头的方法，产生粘性末端，平端加上合成的接头的方法，产生

14、粘性末端，也可以提高衔接的效率也可以提高衔接的效率 。适当的插入片段与载体分子比率能适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的构成，普通减少多拷贝插入片段的构成，普通采用载体：插入片段摩尔数为采用载体：插入片段摩尔数为1：2-3的比例。的比例。载体及插入片段的量载体及插入片段的量实验资料与仪器：实验资料与仪器：PCR产物产物(0.8kb，带有，带有BamHI、 HindIII酶酶切位点切位点)pBluescript KS 质粒质粒(3.0kb)NEB 1kb 规范分子量片段规范分子量片段BamHI、 HindIII限制酶及限制酶及 10K buffer琼脂糖琼脂糖T4 DNA liga

15、se 及其缓冲液及其缓冲液(Takara)TBE缓冲液缓冲液(10)溴化乙啶染色液溴化乙啶染色液(10mg/ml)上样液上样液(3)电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等成像仪，一次性塑料手套等实验方法和步骤实验方法和步骤 PCRPCR产物的纯化产物的纯化-PCR-PCR产物以及空载体产物以及空载体的酶切的酶切-乙醇沉淀乙醇沉淀-电泳检测电泳检测-衔衔接接-160C-160C过夜过夜A 从从 P C R 产 物 中 直 接 回 收 纯 化产 物 中 直 接 回 收 纯 化 D N A (Promega 公司公司) 直接加直接加100l纯化缓冲液

16、于纯化缓冲液于1.5ml离心管，再离心管，再参与参与30300l PCR反响物，反响物，Vortex混合；混合；参与参与1ml树脂悄然树脂悄然Vortex 3次，每次间隔次，每次间隔1分分钟；钟；进入进入C步骤。步骤。DNA回收纯化步骤：回收纯化步骤：回收回收PCR产物常采用两中方法，即直接回产物常采用两中方法，即直接回收和从凝胶中回收，目前有许多公司出卖收和从凝胶中回收，目前有许多公司出卖相关的试剂盒。相关的试剂盒。B 从琼脂糖凝胶回收纯化从琼脂糖凝胶回收纯化DNA用琼脂糖凝胶分别用琼脂糖凝胶分别PCR片段，用片段，用UV察察看看EB染色条带；染色条带；用干净的刀片切出所需用干净的刀片切出所

17、需DNA条带，留意条带，留意要在长波长要在长波长300nmUV灯下操作，灯下操作，并快速操作，以免损伤并快速操作，以免损伤DNA。应尽可。应尽可以多地去除琼脂糖凝胶，一次操作可以多地去除琼脂糖凝胶，一次操作可切取多至切取多至300mg的条带；的条带；将将300l (300mg) 琼脂糖条片转移至琼脂糖条片转移至1.5ml离心管。直接在离心管。直接在70温育直至温育直至凝胶全部溶化普通可按公司提供凝胶全部溶化普通可按公司提供的阐明书进展；的阐明书进展；加加1ml树脂，彻底混合树脂，彻底混合20秒，但不秒，但不用用Vortex；下接下接C步骤。步骤。C 纯化步骤纯化步骤 将取出拉杆的注射器筒将取出

18、拉杆的注射器筒3ml装在纯装在纯化柱上，参与上述化柱上，参与上述DNA与树脂混合液，与树脂混合液，然后装上拉杆，渐渐将混合液推进纯然后装上拉杆，渐渐将混合液推进纯化柱内；化柱内；卸下注射器筒，拔出拉杆，再将注射器卸下注射器筒，拔出拉杆，再将注射器筒 装 上 纯 化 柱 ， 加筒 装 上 纯 化 柱 ， 加 2 m l 8 0 % 的的Isopropanol, 然后装上拉杆，渐渐推然后装上拉杆，渐渐推出液体以清洗柱子；出液体以清洗柱子；再次卸下注射器筒，将纯化柱装在再次卸下注射器筒，将纯化柱装在1.5ml离心管上，离心管上，10000g离心离心2 min，以枯燥树，以枯燥树脂；脂；再将纯化柱装在

19、一个新的再将纯化柱装在一个新的1.5ml离心管上，离心管上，加加50l水或水或TE缓冲液，缓冲液，1分钟后，分钟后，10000g离心离心20秒，溶出秒，溶出DNA片段；片段；移去纯化柱，将纯化出的移去纯化柱，将纯化出的DNA溶液在溶液在-20下保管备用。下保管备用。D 阐明阐明假设向假设向1ml树脂中参与树脂中参与500bp PCR产物产物50ng至至16g，其回收率可在，其回收率可在95以上。以上。同样同样500bp，假设从低溶点琼脂糖凝胶中，假设从低溶点琼脂糖凝胶中回收其回收率在回收其回收率在7090之间。之间。学生学生PCR实验结果实验结果(4l)PCR 产物纯化后产物纯化后(相当于相当

20、于0.8 l原原PCR产物产物pBluescript 酶切后酶切后PCR 纯化并酶切后纯化并酶切后(2l)DNA重组重组本实验是将具有本实验是将具有BamHIBamHI和和HindIIIHindIII粘性末端的粘性末端的基因片段以及载体经过基因片段以及载体经过DNADNA衔接酶衔接起来。衔接酶衔接起来。 方法方法1酶切后乙醇沉淀，适于酶切后乙醇沉淀，适于PCR产物的重产物的重组：组：在 灭 菌 的在 灭 菌 的 E p p e n d o r f 管 中 参 与 制 备管 中 参 与 制 备pBluescript KS空载体空载体0.2-1g(针对本实验，针对本实验，取取4l约约800ng)，

21、2 l 10酶切缓冲液，酶切缓冲液， BamHI & HindIII酶各酶各1l各各5单位，用单位，用无菌双蒸水加至无菌双蒸水加至20l 反响体系，于反响体系，于37保保温温1-3h；在另一管中参与待插入的在另一管中参与待插入的DNA片段纯化的片段纯化的PCR产物产物0.2-1g(本实验约为本实验约为4-10l)，2l 10酶切缓冲液，酶切缓冲液，HindIII 和和 BamHI酶酶各各1l各各5单位，用无菌双蒸水加至单位，用无菌双蒸水加至20l 反响体系，于反响体系，于3 7保温保温 1-3 h ；操作步骤操作步骤(根据实验情况而定，终了后各取根据实验情况而定，终了后各取3l酶解酶解液做电泳分析，察看酶解能否完全将酶液做电泳分析，察看酶解能否完全将酶解液参与解液参与2倍体积的倍体积的100乙醇以及乙醇以及1/10体体积的积的3M NaAC(pH=5.2)，置，置-20冰箱冰箱 30min。4oC，12,000rmin离心离心 10 min，弃上清，参与弃上清，参与100l 70乙醇乙醇(洗涤沉淀物洗涤沉淀物)，离心去上清，室温枯燥离心去上清，室温枯燥DNA 沉淀沉淀15分钟左分钟左右，参与右，参与 10 l 水或水或