实验六抗体效价的Elisa测定ppt课件

1、实验二 酶联免疫吸附测定BSA抗体效价 1.目的要求(1)学习酶联免疫吸附测定的根本原理。 (2)掌握酶联免疫吸附测定技术，抗体的效价测定及酶联免疫测定仪的运用。 2.2.根本原理根本原理免疫酶技术免疫酶技术: :酶标酶标Ab/Ag,Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反响后，酶结合物的酶在免疫反响后，作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定Ab/AgAb/Ag。免疫反响：一次或数次免疫反响：一次或数次 具具Ag,AbAg,Ab特异的免疫学反响特异的免疫学反响酶促反响：只进展一次酶促反响：只进展一次 显示出生物放大作用，灵敏度显示出生物放大作用

2、，灵敏度ng,pgng,pg 60年代初期，Averameas & Ram等建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶-人血洁白蛋白及酸性磷酸酯酶-抗体，统称为酶标志物或酶结合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay简称为Elisa)-是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的根底上开展起来的一种新型的免疫测定技术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。1974年 Voller等用聚苯乙烯微量反响板作为免

3、疫吸附剂吸附抗体(抗原)，再与相应的酶标志物结合操作更方便，易反复灵敏度可高达ng10-9g至pg(10-12g)，(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)免疫标志技术免疫标志技术运用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进展定性和定量测定标志抗体或抗原荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂镜检察看或进展自动化测定荧光显微镜，射线丈量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等直接在细胞、亚细胞、超微构造及分子程度上,对抗原抗体反响进展定性和定位研讨酶-性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色，便于检测常用的酶:碱性磷酸酯酶

4、、辣根过氧化物酶(horserad peroxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。酶标技术酶标技术戊二醛法， 过碘酸氧化法将酶与Ab交联在一同Ag-Ab-抗Ab-HRPTMB+H2O2产物黄色，OD450)+H2O图一直接型图一直接型Elisa 图二间接型图二间接型Elisa图三图三 双抗体夹心型双抗体夹心型ELISA图四图四 固相抗体竞争型固相抗体竞争型ELISA未知抗原量未知抗原量=A1-A2每次反响后都要反复洗涤？保证反响的定量反响防止重叠反响，引起非特异景象。Partially purified, inactivated HIV antigens antigens pr

5、e-coated onto an ELISA platePatient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate. Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to h

6、uman antibodies. substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.HIV (human immunodeficiency virus) detectionpositivenegativePositive Control Negative Control Patient A Patient B Patient C Assay Control 1.689 0.153 O.055 0.412 1.999 0.123 Protein protein inte

7、raction-ELISA1. Direct elisa different epitopeCoat with prey proteinIncubate with bait protein Pimary Ab anti bait protein -2petitive elisa same epitopeCoat with bait prIncubate with primary antibody anti bait pr and various concentration prey protein4. 4. 操作方法操作方法4.1 4.1 包被特异性抗原包被特异性抗原: :固体抗原固体抗原(

8、(如蛋白质如蛋白质) )用包被液稀释至用包被液稀释至10Og/ml10Og/ml，每凹孔加，每凹孔加100L100L，加盖置，加盖置44过夜过夜(37 2h)(37 2h)【已完成】【已完成】 次日倾去凹孔内液体，用滴管取洗涤液在每孔中加满次日倾去凹孔内液体，用滴管取洗涤液在每孔中加满稀释稀释/ /洗涤液洗涤洗涤液洗涤3 3次，初次洗涤静置次，初次洗涤静置2min2min后倾去，后两次后倾去，后两次静置静置1min1min。将反响板扣放在滤纸上，以除净液体。将反响板扣放在滤纸上，以除净液体。4.2 4.2 封锁封锁: : 每孔中加满封锁液约每孔中加满封锁液约300ul300ul多，加盖或用封多

9、，加盖或用封口膜封板，置口膜封板，置3737恒温箱恒温箱60min60min，倾去孔内液体，按上法洗，倾去孔内液体，按上法洗涤涤3 3次。次。4.3 4.3 加待测血清加待测血清( (内含抗体内含抗体) )、阴性血、阴性血清清( (无抗体无抗体) )及稀释液及稀释液(PBS/Tween):(PBS/Tween):待测血清按倍比法用稀释液稀释待测血清按倍比法用稀释液稀释(1:100(1:100、1:2001:200等等) )，阴性血清也稀释，阴性血清也稀释成成1:1001:100，取不同稀释度的待测血清，取不同稀释度的待测血清，阴性血清及稀释液阴性血清及稀释液(PBS/Tween)(PBS/Tw

10、een)各各1OOL1OOL加至相应的凹孔中，加盖或封加至相应的凹孔中，加盖或封板，置板，置3737恒温箱恒温箱1h1h，使抗体与固相，使抗体与固相抗原进展特异性结合，反复洗涤抗原进展特异性结合，反复洗涤3 3次。次。12345678PBS/Tween1:100阴性血清1:1,0001:5,0001:10,0001:50,0001:100,0001:500,000阳性血清4.4 4.4 加酶标抗体加酶标抗体: :参与参与HRP-HRP-抗体抗体( (抗抗体，本实验中曾经根听阐明书抗抗体，本实验中曾经根听阐明书稀释一千倍稀释一千倍) )，每孔加，每孔加l00Ll00L，封板后置，封板后置3737

11、温育温育lhlh，按上法至，按上法至少洗涤少洗涤5 5次，最后用蒸馏水洗涤次，最后用蒸馏水洗涤2 2次，扣在滤纸上吸干水分。次，扣在滤纸上吸干水分。4.5 4.5 显色显色: : 首先按每首先按每10mLOPD10mLOPD运用液参与运用液参与0.15mLH2O20.15mLH2O2处置。每孔参处置。每孔参与与OPDOPD运用液运用液1OOuL1OOuL、反响板置室温暗处、反响板置室温暗处5 530min30min。当显示明显。当显示明显黄色时应及时终止反响。黄色时应及时终止反响。4.6 4.6 终止反响终止反响: :每孔参与每孔参与10OL 2mol/L H2SO410OL 2mol/L H

12、2SO4。由黄色变为橙色。由黄色变为橙色。稳定稳定3 35min5min即可比色测定。即可比色测定。4.7 4.7 检测检测: : 用酶联免疫测定仪，以用酶联免疫测定仪，以PBS/TweenPBS/Tween孔为对照、测波长为孔为对照、测波长为49Onm49Onm时各孔光吸收时各孔光吸收A A。计算阳性血清与阴性血清计算阳性血清与阴性血清A A值之比值之比(Positive/negative(Positive/negative，P/N)P/N)，当，当P/N2.1P/N2.1时为阳性，时为阳性，P/N2.1P/N2.1而而1.51.5为可疑，为可疑，P/N1.5P/N1.5为阴性。为阴性。用目

13、测法那么以较阴性对照深色的最高稀释度作为抗体效价。用目测法那么以较阴性对照深色的最高稀释度作为抗体效价。用用“表示，超越规定吸收值表示，超越规定吸收值0.20.20.40.4的标本均属阳性。的标本均属阳性。 本卷须知本卷须知 (1) (1)聚苯乙烯微量反响板应选择高质量、非特异性吸附小聚苯乙烯微量反响板应选择高质量、非特异性吸附小的产品。包被物应具有较高的纯度，其浓度普通在的产品。包被物应具有较高的纯度，其浓度普通在1 1100g100g之间，在偏碱条件下易吸附于反响板的凹孔中，之间，在偏碱条件下易吸附于反响板的凹孔中，44放置过夜放置过夜较理想，假设暂时不用，可参与终浓度为较理想，假设暂时不

14、用，可参与终浓度为0.02% NaN30.02% NaN3，44储储存，也可倾去包被液，枯燥后置硅胶枯燥器中，室温存放存，也可倾去包被液，枯燥后置硅胶枯燥器中，室温存放3 3个个月以上不影响测定效果。月以上不影响测定效果。 (2) (2)反响各步均应充分洗涤，以除去残留物，减少非特异反响各步均应充分洗涤，以除去残留物，减少非特异性吸附。为使结果反复应固定洗涤次数及放置时间，切忌相互性吸附。为使结果反复应固定洗涤次数及放置时间，切忌相互污染。污染。 (3) (3)为使显色反响便于比较，显色后置室温暗处的时间应为使显色反响便于比较，显色后置室温暗处的时间应一致，终止反响一致，终止反响3 35min

15、5min后应立刻比色。必要时可设阳性对照，后应立刻比色。必要时可设阳性对照，以固定显色及终止时间。以固定显色及终止时间。 (4) (4)待测抗体或抗原与酶标抗体应具有一样的免疫特异性，待测抗体或抗原与酶标抗体应具有一样的免疫特异性，否那么无法结合。否那么无法结合。自动酶标仪自动酶标仪Elx800UVElx800UV运用程序运用程序1 1 开机，进展开机，进展System self-testSystem self-test2 2 按按“DEFINEDEFINE键，进入键，进入“SELECT ASSAY NUMBERSELECT ASSAY NUMBER， 用用“NUMERICNUMERIC或或“

16、OPTIONOPTION键输入测试号注：键输入测试号注：assay 01 assay 01 为为quick readquick read，最大测试号为，最大测试号为5555；按；按“ENTERENTER键修正测试键修正测试的的“NAMENAME；再按；再按“ENTERENTER键进入以下菜单：键进入以下菜单：按按“METHODMETHOD键选择测试的波长类型键选择测试的波长类型SingleSingle或或DualDual、波长大小波长大小(340(340、405405、450450、490490或或630nm)630nm)、微孔板类型、微孔板类型(96(96孔、孔、4848孔或孔或2424孔孔) )。按按“MAPMAP键选择阅读方式键选择阅读方式(Auto(Auto或或Manual) Manual) 、阅读方向、阅读方向DownDown或或AcrossAcross、反复方向、反复方向DownDown或或AcrossAcross、阅读起、阅读起始位置输入编号、空白始位置输入编号、空白MapMapAirAir、FullFull、ConstConst、ColumnColumn、P-DownP-Down、P-AcrossP-Acr