微生物遗传育种,基因重组与育种ppt课件

1、引言引言 基因重组基因重组Gene recombination：凡把两个不同性：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一同，经过遗传分子间的重新状个体内的遗传基因转移到一同，经过遗传分子间的重新组合，构成新遗传个体的方式，称遗传重组组合，构成新遗传个体的方式，称遗传重组Genetic recombination。 重组与突变的不同点：重组与突变的不同点： 突变是指一个细胞的同一个基因组中某一突变是指一个细胞的同一个基因组中某一点或某一点或某一DNA片段发生的变异；而重组是来自片段发生的变异；而重组是来自两个细胞的不同基因组间遗传物质交换的结果，两个细胞的不同基因组间遗传物质交换的结果，重组可在

2、微生物细胞不发生突变的情况下构成重组可在微生物细胞不发生突变的情况下构成新的基因型与表型。新的基因型与表型。 杂交杂交Hybridization:是指不同基因型的亲本个体或是指不同基因型的亲本个体或细胞指单细胞生物交配而产生子代的过程。细胞指单细胞生物交配而产生子代的过程。重组是分子程度上的概念，而杂交是细胞程度上的概念。重组是分子程度上的概念，而杂交是细胞程度上的概念。杂交中必然含有重组，但重组那么不限于杂交这一种方式。杂交中必然含有重组，但重组那么不限于杂交这一种方式。一接合景象的发现一接合景象的发现 1946年，年，J. Lederberg和和E. L. Tatum未未来自来自E.col

3、i K12的两种营的两种营养缺陷型菌株养缺陷型菌株混合培育，其混合培育，其遗传标志如图。遗传标志如图。结果在单独培结果在单独培育的平板上无育的平板上无菌落，而在混菌落，而在混合培育的平板合培育的平板上长出了原养上长出了原养型菌落。型菌落。对接合景象的解释：对接合景象的解释：1能够是细菌接合后发生基因重组的结果；能够是细菌接合后发生基因重组的结果；2细菌并没有接合，而是交换了细菌并没有接合，而是交换了DNA转化；转化；3细菌细胞并没有接合，而是经过培育基交换细菌细胞并没有接合，而是经过培育基交换了养料，即互养；了养料，即互养；4细菌细胞并没有接合，而是亲本细菌发生了细菌细胞并没有接合，而是亲本细

4、菌发生了回复突变的结果；回复突变的结果；5虽经接合而未发生基因重组，只是构成异核虽经接合而未发生基因重组，只是构成异核体或杂合二倍体。体或杂合二倍体。二接协作用的证明二接协作用的证明1、转化作用的排除、转化作用的排除 由于在报道由于在报道接合实验结果接合实验结果之前转化实验之前转化实验曾经是众所周曾经是众所周知，因此有人知，因此有人疑心该结果是疑心该结果是由转化所导致由转化所导致的。的。1950年，年，B.D.Davis设计设计了了U形管实验否形管实验否认了这一推测认了这一推测见右图见右图2、互养的排除、互养的排除 营养缺陷型细菌经过培育基交换养料而产生营养缺陷型细菌经过培育基交换养料而产生的

5、景象称为互养。的景象称为互养。 Lederberg 和和 Tatum将培育过一种营养缺陷型将培育过一种营养缺陷型细菌的培育基经过灭菌、过滤，然后参与到另一细菌的培育基经过灭菌、过滤，然后参与到另一营养缺陷型菌培育物中。即使前一种菌在培育、营养缺陷型菌培育物中。即使前一种菌在培育、灭菌、过滤之前曾发生过裂解，也不能是后一种灭菌、过滤之前曾发生过裂解，也不能是后一种菌产生原养型。菌产生原养型。3、回复突变的排除、回复突变的排除 假设要发生两种突变的回复突变，其几率为假设要发生两种突变的回复突变，其几率为1012，这是不能够的。这是不能够的。4、异核体和杂合二倍体的排除、异核体和杂合二倍体的排除AB

6、ABABABAB异核体异核体杂合二倍体杂合二倍体单倍重组体单倍重组体 异核体和杂合二倍体的遗传性状不稳定，在传异核体和杂合二倍体的遗传性状不稳定，在传代过程中会发生性状分别，但现实恰恰相反，原代过程中会发生性状分别，但现实恰恰相反，原养型菌落的基因型是稳定的，证明是单倍重组体。养型菌落的基因型是稳定的，证明是单倍重组体。三接合的机制三接合的机制1、接协作用中两菌株性别的存在、接协作用中两菌株性别的存在 Lederberg 和和Tatum以为在两个细菌的亲本细胞以为在两个细菌的亲本细胞在接合过程中起同等作用在接合过程中起同等作用即即E.coli 的性系统被以的性系统被以为是同宗配合。为是同宗配合

7、。 1952年，年，W. Hayes利用利用Lederberg 和和Tatum所做的所做的杂交实验，对杂交实验，对AMetBioSms或或SmrBThrLeuB1 Smr或或Sms进展研讨。进展研讨。结果阐明，在杂交期间，两品系所起的作用是不同结果阐明，在杂交期间，两品系所起的作用是不同的，是一种单向异宗配合过程，两品系在获得的同的，是一种单向异宗配合过程，两品系在获得的同时发生了性别的变化。其中，供体品系相当于雄性，时发生了性别的变化。其中，供体品系相当于雄性，而受体品系相当于雌性。而受体品系相当于雌性。2、F因子的存在因子的存在1E.coli 的某些种如品系的某些种如品系A记为记为F，带有

8、一，带有一个性因子，或致育因子个性因子，或致育因子Ffertility factor，而另，而另一个不育型品系记作一个不育型品系记作F，记不带有性因子；，记不带有性因子；2杂交杂交F F是可育的，杂交是可育的，杂交F F是不是不育的；育的；3F因子可以传送，从因子可以传送，从F到到F细菌，但必需经细菌，但必需经过细胞接触；过细胞接触；4F因子可以自发丧失，一旦丧失就不再恢复，因子可以自发丧失，一旦丧失就不再恢复，除非经过另一个除非经过另一个F细胞在传送过来。细胞在传送过来。 F细胞经低细胞经低浓度的吖啶橙处置后丧失浓度的吖啶橙处置后丧失F因子，也会偶尔自发地因子，也会偶尔自发地或经紫外线处置丧

9、失。或经紫外线处置丧失。3、F因子及因子及F细胞的特性细胞的特性 F是一种可遗传性状，可以自我复制，类似于染色是一种可遗传性状，可以自我复制，类似于染色体基因，但不是染色体基因，其转移的频率可高达体基因，但不是染色体基因，其转移的频率可高达70以上。以上。 F因子是独立于染色体外的小型环状因子是独立于染色体外的小型环状DNA分子，具有分子，具有自体复制及转移到其他细胞中去的才干。大小约是细菌自体复制及转移到其他细胞中去的才干。大小约是细菌基因组基因组DNA的的2，分子量为，分子量为6.3 106d、94.5kb。整个。整个基因组编码基因组编码94个蛋白质，其中个蛋白质，其中13的基因与接协作用

10、有的基因与接协作用有关。关。 F因子基因组有三个主要的基因丛，分别担任插入、因子基因组有三个主要的基因丛，分别担任插入、复制和转移的功能。复制和转移的功能。A. 转移区转移区Transfer-region：是一个支配子，由：是一个支配子，由22个基因组成，个基因组成，33kb，位于，位于F因子构造图的因子构造图的6093kb之之间。其中，间。其中，tra J、A、L、E、N、B、W、V、C、U、F、H这些基因与性菌毛的合成与装配有关；这些基因与性菌毛的合成与装配有关；tra Y、Z、M、I、G、D等基因产物与等基因产物与DNA的转移有关；的转移有关；traG和和traN的基因产物与细菌结合有关

11、；的基因产物与细菌结合有关；traS和和traT的基因的基因产物与外表排斥有关。产物与外表排斥有关。B. 复制区复制区replication-region：位于：位于F因子构因子构造图谱的造图谱的4049kb，包含一个特异的复制蛋白基，包含一个特异的复制蛋白基因因frpF replication proteins、决议不相容性、决议不相容性基因基因incincompatibility和一个复制起始点和一个复制起始点oriVvegetative origin of replication。C. 插入区插入区insertion region：位于：位于F因子构造图因子构造图谱的谱的9317.6kb

12、，包含四个插入序列，包含四个插入序列，IS3有直接有直接反复的两个，另外两个是反复的两个，另外两个是IS2和和 ，它们主要与，它们主要与F因子的整合、切除、易位有关。因子的整合、切除、易位有关。 F因子的主要表现型是细胞外表有性菌毛，即因子的主要表现型是细胞外表有性菌毛，即F细胞外表都有性菌毛。细胞外表都有性菌毛。F性菌毛分布在大肠杆性菌毛分布在大肠杆菌的外表，数目与菌的外表，数目与F因子相当，长度为因子相当，长度为120um。 性菌毛的功能：性菌毛的功能：A. 是两性细胞接合时转移是两性细胞接合时转移DNA的通道，又叫性纤毛桥的通道，又叫性纤毛桥sex pili bridge；B. 又是特异

13、又是特异phage吸附的部位。吸附的部位。4、接合时、接合时DNA转移的机制转移的机制 接合时接合时DNA转移的机制目前不详，但可以确定转移的机制目前不详，但可以确定的是：在接合时，性菌毛的存在是必需的。的是：在接合时，性菌毛的存在是必需的。四四F因子的三种存在方式因子的三种存在方式1、 F：F因子在细胞中以游离形状存在。因子在细胞中以游离形状存在。2、Hfrhigh frequency of recombination: F因因子在细胞中以整合形状存在。子在细胞中以整合形状存在。Hfr与与F的异同：的异同： 1 F与与Hfr均能与均能与F菌株杂交；菌株杂交； 2 F与与Hfr均能合成细胞外表

14、附属物均能合成细胞外表附属物性菌毛；性菌毛； 3Hfr菌株总是从菌株总是从F菌株中得到，而菌株中得到，而F却从未在却从未在Hfr菌株菌株中得到过；中得到过； 4Hfr经吖啶橙处置后性质不变，而经吖啶橙处置后性质不变，而F经吖啶橙处置后失经吖啶橙处置后失去去F因子；因子； 5Hfr与与F杂交后，杂交后， F性质普通不会变；而性质普通不会变；而F与与F杂杂交后，交后， F变为变为F。3、F ：携带有部分核染色体基因的：携带有部分核染色体基因的F 因子，含因子，含有有F 因子的菌株称为因子的菌株称为F 菌株。菌株。五三种五三种“雄性菌株与雄性菌株与F接合后的结果接合后的结果1、F F 2F 由性菌毛

15、将不同接合型的的细菌连在一同，由性菌毛将不同接合型的的细菌连在一同，并且在细胞间构成胞质桥也称接合管。在并且在细胞间构成胞质桥也称接合管。在构成接合对以后，构成接合对以后，F菌的菌的F因子进展因子进展DNA滚环滚环复制。单链转入复制。单链转入F菌，并合成新的互补链。菌，并合成新的互补链。2、Hfr F HfrF Hfr的染色体双链中的一条链在的染色体双链中的一条链在F因子处发生因子处发生断裂，由环状变为线状，断裂，由环状变为线状，F因子那么位于线状单因子那么位于线状单链链DNA的末端，整段线状染色体单链也以的末端，整段线状染色体单链也以5 末端引导，等速地转移至末端引导，等速地转移至F细胞。细

16、胞。 经过接合而获得新性状的受体细胞称为接合子。经过接合而获得新性状的受体细胞称为接合子。conjugant3、F F 2F Hfr菌株的菌株的F因子的反常切除所构成的因子的反常切除所构成的F因子有两种类型：因子有两种类型： I 型：包含了染色体一个区域和不完全的型：包含了染色体一个区域和不完全的F 因子。因子。II型：带有完好的型：带有完好的F因子因子DNA和位于和位于F因子插入两端因子插入两端的染色体基因。的染色体基因。F 菌的共同特征菌的共同特征1I 型型F 普通携带的基因是普通携带的基因是Hfr上的末端，这部分上的末端，这部分基因在基因在Hfr F时是低频转移的，而在时是低频转移的，而

17、在F F时却时却是高频转移的。是高频转移的。2II型型F 菌使本来转移频率差别悬殊的两部分基因菌使本来转移频率差别悬殊的两部分基因具有一样的频率。具有一样的频率。3F 菌的最大特点是能构建稳定的部分二倍体。菌的最大特点是能构建稳定的部分二倍体。F因子转导：经过因子转导：经过F 因子的转移而使受体菌改动因子的转移而使受体菌改动 它的遗传性状的景象称为它的遗传性状的景象称为F因子转导或因子转导或 或性因子转导或简称性导或性因子转导或简称性导F duction 或或 sex duction拟表型菌：指表型上属于拟表型菌：指表型上属于F 而遗传性上仍是而遗传性上仍是F 的菌，也就是说外表没有性菌毛，的

18、菌，也就是说外表没有性菌毛，因此因此 丧失了外表排斥性。丧失了外表排斥性。原理：原理： 假设人为地中断正在基因转移的杂交对，然后测假设人为地中断正在基因转移的杂交对，然后测定受体菌里遗传标志重组频率，就能知道基因连锁定受体菌里遗传标志重组频率，就能知道基因连锁情况。情况。1957年，年，E.L.Wollman和和F.Jocob设计了中断杂交实验。设计了中断杂交实验。供体菌供体菌Hfr，受体菌，受体菌F thr leu lac gal azir tonr strr，将大约，将大约10倍的倍的F菌和菌和Hfr对数期菌混对数期菌混合，悄然振荡培育，在不同时间间隔取样，在组织搅合，悄然振荡培育，在不同

19、时间间隔取样，在组织搅拌器中猛烈振荡后，将培育物经适当稀释后，涂布在拌器中猛烈振荡后，将培育物经适当稀释后，涂布在含链霉素且以葡萄糖作为碳源的根本培育基上进展选含链霉素且以葡萄糖作为碳源的根本培育基上进展选择。择。中断杂交实验中断杂交实验中断杂交实验的结果：中断杂交实验的结果： 基因是以基因是以ori、thr、leu、azi、ton、lac、gal的的顺序延续转移的。在这个实验中，对顺序延续转移的。在这个实验中，对Hfr菌的条件菌的条件是，是，str基因在整个待测顺序的后端，假设基因在整个待测顺序的后端，假设strs基基因率先进入受体，获得的重组体将在第一次选择因率先进入受体，获得的重组体将在

20、第一次选择性培育基上被性培育基上被str杀死。另外，杀死。另外，thr、leu选择性标选择性标志应位于前端，如位于后端那么无法测序。志应位于前端，如位于后端那么无法测序。一放线菌基因重组的发现一放线菌基因重组的发现1955年，年，Sermonti夫妇在天兰色链霉菌夫妇在天兰色链霉菌streptomyces coelicolerISS株中初次发现经过遗传性交换而产生的株中初次发现经过遗传性交换而产生的重组，接着，重组，接着，Hopwood也用也用S.coelicoler A 3(2)发现了同发现了同样的重组。样的重组。二放线菌的性别二放线菌的性别1、三种性别、三种性别原始致育型原始致育型IF，i

21、nitial fertility：相当于：相当于E.coli的的F正常致育型正常致育型NF，normal fertility：相当于：相当于E.coli的的Hfr超致育型超致育型UF，ultra fertility：相当于：相当于E.coli的的F2、以为、以为IF相当于相当于E.coli的的F、UF相当于相当于E.coli的的F的理由的理由1IF以以0.3的频率转变为的频率转变为UF，在经，在经uv处置的处置的IF群群体中曾经得到作为受体高度可育的体中曾经得到作为受体高度可育的UF菌株，这种情况菌株，这种情况类似于从类似于从F菌株中得到菌株中得到F菌株；菌株；2IFUF杂交中，杂交中，UF受

22、体菌株全部转变为受体菌株全部转变为IF，而染，而染色体基因重组频率大约为色体基因重组频率大约为104，两者相差万倍。这种，两者相差万倍。这种情况与情况与F F类似。类似。3、以为、以为NF相当于相当于Hfr的理由的理由1IF和和NF都产生对于都产生对于UF菌株具有抑制造用的次甲菌株具有抑制造用的次甲霉素，而霉素，而UF菌株那么不产生这一抗菌素；菌株那么不产生这一抗菌素；2IF UF杂交子代全部都是杂交子代全部都是IF，这种转变和染色，这种转变和染色体基因转移无关，但是体基因转移无关，但是NF UF杂交那么不同，杂交那么不同，UF转转变为变为NF都伴随着染色体重组；都伴随着染色体重组；3NF菌株

23、来自菌株来自IF或是或是IF的杂交子代，与的杂交子代，与E.coli中的中的一样。一样。三放线菌的致育因子三放线菌的致育因子 经研讨发如今经研讨发如今S.coelicoler中存在着一种称为中存在着一种称为Scp1的致育因子。的致育因子。 Scp1和和F因子一样也是一种质粒，具因子一样也是一种质粒，具有转移性，在本身转移的同时还可以带动染色体进有转移性，在本身转移的同时还可以带动染色体进展转移。此外展转移。此外Scp1还带有与产生次甲霉素有关的基还带有与产生次甲霉素有关的基因，因， Scp1属于附加体质粒。属于附加体质粒。四天兰色链霉菌三种致育类型与大肠杆菌的四天兰色链霉菌三种致育类型与大肠杆

24、菌的三种致育类型之间的区别三种致育类型之间的区别1、大肠杆菌中、大肠杆菌中F F是不育的，但在天兰色链霉是不育的，但在天兰色链霉菌中菌中UF UF是可育的，只是频率较低，阐明还有另是可育的，只是频率较低，阐明还有另外一种致育因子的存在；外一种致育因子的存在；2、大肠杆菌中、大肠杆菌中F F或或Hfr Hfr杂交的可育性很杂交的可育性很低，除非使其中一个成为低，除非使其中一个成为 F的拟表型，但在天兰色的拟表型，但在天兰色链霉菌中链霉菌中NF NF和和IF IF杂交中一部分是高度可育的；杂交中一部分是高度可育的；3、大肠杆菌中、大肠杆菌中F F的子代都是的子代都是F 而而Hfr F的子代都是的子

25、代都是F ，但在天兰色链霉菌中，但在天兰色链霉菌中IF UF的子代的子代是是IF，NF UF的子代也是的子代也是NF。 Hfr细菌和细菌和F细菌接触带来两个细菌细胞的接合细菌接触带来两个细菌细胞的接合和染色体从和染色体从Hfr细菌向细菌向F细菌转移。因此，接合杂交细菌转移。因此，接合杂交是确定特定基因的粗略位置的有效方法，也是育种的是确定特定基因的粗略位置的有效方法，也是育种的一种手段。一种手段。 普通采用液体接合培育法，在接合时留意通气和选普通采用液体接合培育法，在接合时留意通气和选择标志。选择性标志可以用抗性标志，也可以用营养择标志。选择性标志可以用抗性标志，也可以用营养缺陷型。缺陷型。

26、转化转化transformation：受体细胞直接吸收：受体细胞直接吸收来自供体细胞的离体来自供体细胞的离体DNA片段，并经过交换把片段，并经过交换把它整合到本人的基因组中，从而获得了供体细它整合到本人的基因组中，从而获得了供体细胞的某些遗传性状的景象。获得新性状的受体胞的某些遗传性状的景象。获得新性状的受体称为转化子称为转化子transformant。 转化不是两个细胞的直接接触，而是供体细胞的转化不是两个细胞的直接接触，而是供体细胞的离体离体DNA与受体细胞直接接触而转移遗传物质。与受体细胞直接接触而转移遗传物质。转化包括两个根本过程转化包括两个根本过程1从供体菌中提取遗传物质从供体菌中提

27、取遗传物质DNA并转移到受体中；并转移到受体中；2供体的遗传物质在受体中的作用。供体的遗传物质在受体中的作用。一转化一转化DNA的特点的特点1、转化子的数目与、转化子的数目与DNA浓度的关系浓度的关系在一定条件下转化子的数目与转化在一定条件下转化子的数目与转化DNA的浓度成正比。的浓度成正比。细菌生长量细菌生长量每毫升中转化子数每毫升中转化子数10410510310210220 40 60 80 100 12010100培育时间培育时间每毫升中转化子数每毫升中转化子数103102101DNA转化的饱和浓度转化的饱和浓度2、DNA片段的大小与转化子数目的关系片段的大小与转化子数目的关系 对于转化

28、作用来说，转化对于转化作用来说，转化DNA片段必需具有一定片段必需具有一定的大小。普通以为，转化的大小。普通以为，转化DNA片段的大小没有上限，片段的大小没有上限，但是在制备转化子过程中，往往人工打断供体但是在制备转化子过程中，往往人工打断供体DNA分子，获得的片段约分子，获得的片段约107dal大约大约10个基因左右。个基因左右。在受体细胞摄取在受体细胞摄取DNA时，能够还会进一步断裂，所时，能够还会进一步断裂，所以仅仅有大约以仅仅有大约0.5的供体基因组可以进入受体细胞。的供体基因组可以进入受体细胞。能发生转化作用的核苷酸链至少不低于能发生转化作用的核苷酸链至少不低于450bp。3、单双链

29、、单双链DNA与转化活性的关系与转化活性的关系 单链单链DNA的转化活性低，而双链的转化活性低，而双链DNA的转化活的转化活性高。因此，性高。因此，DNA完好的双链构造对于转化活性完好的双链构造对于转化活性来说是必要的。来说是必要的。4、转化、转化DNA的命运的命运 大量的实验证明，在转化作用中遗传重组是由大量的实验证明，在转化作用中遗传重组是由供体的单链序列取代了受体供体的单链序列取代了受体DNA的单链序列，使的单链序列，使受体的受体的DNA标志变成了供体的遗传标志，并恒定标志变成了供体的遗传标志，并恒定表达，遗传给它的后代。表达，遗传给它的后代。二受体细胞的特点二受体细胞的特点1、受体细胞

30、的感受态、受体细胞的感受态1概念概念 只需在某一特定条件下培育的部分细胞才有吸收只需在某一特定条件下培育的部分细胞才有吸收DNA的才干，这种细胞称为感受态细胞。这种感受态的才干，这种细胞称为感受态细胞。这种感受态细胞所处的形状称为感受态细胞所处的形状称为感受态competence。2感受态的特点和影响要素感受态的特点和影响要素 特点：感受态不是一种透性特征，而是在适当的特点：感受态不是一种透性特征，而是在适当的生长条件下获得的一种生理特征生长条件下获得的一种生理特征 影响要素：影响要素：受菌龄的影响：普通以为感受态出如今细菌生长对数受菌龄的影响：普通以为感受态出如今细菌生长对数期的后期；期的后

31、期；受遗传要素的影响；受遗传要素的影响；受环境条件的影响。受环境条件的影响。2、感受态的比例、感受态的比例 不同的细菌的感受态的比例是不同的，普通为不同的细菌的感受态的比例是不同的，普通为1020。3、感受态可在细胞间转移、感受态可在细胞间转移4、感受态因子、感受态因子CF 1963年，年，R.Pakula 和和 W.Walczak 初次从链球菌中初次从链球菌中分别得到；分别得到；1972年，年，Leonard 和和 Cale 纯化的一种蛋白纯化的一种蛋白质，称为质，称为CF。该蛋白质在感受态转移中起作用。该蛋白质在感受态转移中起作用。 在感受态细胞外表存在着一种特定的抗原，而非感在感受态细胞

32、外表存在着一种特定的抗原，而非感受态细胞那么没有这种抗原。细菌细胞在特定的时期产受态细胞那么没有这种抗原。细菌细胞在特定的时期产生一种感受态因子生一种感受态因子CF，CF与膜上的受体结合，刺与膜上的受体结合，刺激核内激核内DNA产生另一个蛋白产生另一个蛋白自溶素自溶素Autolysin，自溶素转运至细胞膜和细胞壁之间的周质内作用于细胞自溶素转运至细胞膜和细胞壁之间的周质内作用于细胞膜，并改动膜的成分，使细胞膜便于膜，并改动膜的成分，使细胞膜便于DNA的吸收。的吸收。一转化技术用于基因定位一转化技术用于基因定位 在转化过程中，两个连锁的基因可以同时转化，在转化过程中，两个连锁的基因可以同时转化，

33、但可以同时转化的基因却不一定是连锁的，由于包但可以同时转化的基因却不一定是连锁的，由于包含这两个基因的含这两个基因的DNA片段可以同时被受体细菌所吸片段可以同时被受体细菌所吸收。收。 假设假设a+和和b+是连锁的，那么当是连锁的，那么当DNA浓度下降时，浓度下降时， a+ b+转化频率的下降与转化频率的下降与a+或或b+的转化频率下降一样；的转化频率下降一样；相反，假设相反，假设a+ 和和b+并不连锁，那么并不连锁，那么a+ b+转化频率下转化频率下降将远远超越降将远远超越a+ 或或b+的转化频率。这是由于在的转化频率。这是由于在DNA低浓度范围内，转化子的产生与低浓度范围内，转化子的产生与D

34、NA的浓度成正比。的浓度成正比。当当a+ 、 b+两个基因位于同一两个基因位于同一DNA片段上是，片段上是， a+ b+转化子与转化子与DNA浓度成正比的添加；当浓度成正比的添加；当a+ b+基因分别基因分别位于不同的位于不同的DNA片段上是，在一定的片段上是，在一定的DNA浓度内，浓度内， a+ b+转化子与转化子与DNA浓度的平方成正比。经过这样的浓度的平方成正比。经过这样的实验检测转化基因的连锁情况可以方便的绘制出遗传实验检测转化基因的连锁情况可以方便的绘制出遗传图谱。图谱。以以trp+和和tyr+ DNA作为供体作为供体q trp+ tyr trp tyr +trp+ tyr trp+

35、 tyr +trp tyr +共转指数：共转指数： 如将如将DNA参与到受体菌中，会产生、和三种参与到受体菌中，会产生、和三种转化子，将型转化子在其中所占的比例称为共转化子，将型转化子在其中所占的比例称为共转指数转指数cotransfer index共转指数共转指数 a+ b+ a+ b+a b+a+ b二转化育种二转化育种 利用在转化过程中供体菌可将遗传性状传送给利用在转化过程中供体菌可将遗传性状传送给受体菌的这种特性，育种任务者可以采用转化的方受体菌的这种特性，育种任务者可以采用转化的方法到达育种的目的。法到达育种的目的。 经过完全缺陷或部分缺陷的噬菌体为媒介，把经过完全缺陷或部分缺陷的噬

36、菌体为媒介，把供体细胞的供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，经过交换片段携带到受体细胞中，经过交换和整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的景象，和整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的景象，称为转导称为转导transduction。获得新性状的受体细。获得新性状的受体细胞就称为转导子胞就称为转导子transductant。 转导有两种类型，即普遍转导和局限转导。转导有两种类型，即普遍转导和局限转导。 1952年，年，N.Zinder 和和 Lederberg 在研讨鼠伤寒沙门在研讨鼠伤寒沙门氏菌遗传重组时，采用两种营养缺陷型菌：氏菌遗传重组时，采用两种营养缺陷型菌：LA2: phe+ trp

37、+ met hisLA22: phe trp met+ his+ 在将两者混合培育后获得了原养型。同时，再将两在将两者混合培育后获得了原养型。同时，再将两者放入者放入Davis管中培育时仍出现重组体，这就证明在两管中培育时仍出现重组体，这就证明在两株菌之间有一种过滤性因子起作用。株菌之间有一种过滤性因子起作用。过滤性因子是噬菌体过滤性因子是噬菌体phage的证明：的证明：过滤性因子不会因过滤性因子不会因 DNase 处置而失去活性，阐明它处置而失去活性，阐明它不是裸露在溶液中的不是裸露在溶液中的DNA，故可以排除转化作用，故可以排除转化作用，另外由于两个菌是隔离培育的因此也可以排除接协另外由于

38、两个菌是隔离培育的因此也可以排除接协作用；作用；过滤性因子与从溶源性菌分别到的噬菌体过滤性因子与从溶源性菌分别到的噬菌体P22具有具有一样大小的质量；一样大小的质量；用抗用抗P22的血清或加热处置，使的血清或加热处置，使P22的感染性和过滤的感染性和过滤性因子的功能失活的速率一样；性因子的功能失活的速率一样；抗抗P22的沙门氏菌菌株同时也对过滤性因子表现为的沙门氏菌菌株同时也对过滤性因子表现为抗性。抗性。因此可以证明：过滤性因子就是温暖型噬菌体因此可以证明：过滤性因子就是温暖型噬菌体P22。 经过完全缺陷的经过完全缺陷的phage 对供体菌任何对供体菌任何DNA小片段小片段的的“误包，而实现其

39、遗传性状传送至受体菌的转导误包，而实现其遗传性状传送至受体菌的转导景象，称为普遍性转导。景象，称为普遍性转导。一完全普遍转导一完全普遍转导 噬菌体在进展包装时，有极少数噬菌体在进展包装时，有极少数phage106108的衣壳将与头部的衣壳将与头部DNA相仿的一小段供体相仿的一小段供体DNA片段误包在内，构成完全不含片段误包在内，构成完全不含phage 本身本身DNA的假噬菌体，这种假噬菌体称为完全缺陷噬菌体。的假噬菌体，这种假噬菌体称为完全缺陷噬菌体。 由完全缺陷噬菌体介导的普遍性转导称为完全普由完全缺陷噬菌体介导的普遍性转导称为完全普遍转导。遍转导。二流产普遍转导二流产普遍转导 简称流产转导

40、简称流产转导abortive transduction。经转。经转导而获得了供体菌导而获得了供体菌DNA片段的受体菌，假设其外源片段的受体菌，假设其外源DNA在体内既不进展交换、整合、复制，也不迅速在体内既不进展交换、整合、复制，也不迅速消逝，而进展转录、转译及性状表达，这种景象称消逝，而进展转录、转译及性状表达，这种景象称为流产转导。为流产转导。 流产转导的受体菌可以在选择性培育基上构成微流产转导的受体菌可以在选择性培育基上构成微小的菌落。小的菌落。 指经过部分缺陷的温暖噬菌体把供体菌指经过部分缺陷的温暖噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表的少数特定基因携带到受体菌中，并获得

41、表达的转导景象。达的转导景象。特点：特点：1、只能是个别特定基因；、只能是个别特定基因； 2、该特定基来由部分缺陷噬菌体携带；、该特定基来由部分缺陷噬菌体携带； 3、缺陷噬菌体是由于在其构成过程中所发生、缺陷噬菌体是由于在其构成过程中所发生 的低频率的低频率“误切或由于双重溶源菌的裂解而误切或由于双重溶源菌的裂解而形形 成。成。 局限转导局限转导一低频转导一低频转导LFT，low frequency transduction 由于宿主染色体上进展不正常的切离的频率极由于宿主染色体上进展不正常的切离的频率极低，因此在裂解物中所含的部分缺陷低，因此在裂解物中所含的部分缺陷phage的比例的比例也极

42、低。这种裂解物称为也极低。这种裂解物称为LFT裂解物。裂解物。LFT裂解物裂解物在低在低m . o . i .情况下感染宿主，可获得极少量的局情况下感染宿主，可获得极少量的局限转导，这就是低频转导。限转导，这就是低频转导。 m . o . i . ： 称作感染复数，是指每一个敏感细胞所能吸附的称作感染复数，是指每一个敏感细胞所能吸附的相应相应phage的数量。的数量。二高频转导二高频转导HFT，high frequency transduction双重溶源菌：双重溶源菌： 在高在高m . o . i .情况下，受体菌会同时吸附缺陷情况下，受体菌会同时吸附缺陷型型phage和完好和完好phage

43、，并且可以同时整合在受体，并且可以同时整合在受体菌的核染色体组上，这时的受体菌称为双重溶源菌的核染色体组上，这时的受体菌称为双重溶源菌。此时，正常的菌。此时，正常的phage称为助体称为助体phage。由双重。由双重溶源菌构成的裂解物称为溶源菌构成的裂解物称为HFT裂解物。裂解物。高频转导：高频转导： 用低用低m . o . i .的的HFT裂解物去感染受体细胞，裂解物去感染受体细胞，那么可高频率的发生局限转导，这就是高频转导。那么可高频率的发生局限转导，这就是高频转导。普遍性转导噬菌体通常可以用于绘制供体菌遗传图谱。普遍性转导噬菌体通常可以用于绘制供体菌遗传图谱。运用于基因定位的共转导景象：

44、运用于基因定位的共转导景象： P1噬菌体的基因组约为染色体长度的噬菌体的基因组约为染色体长度的2.4，P1噬菌体感噬菌体感染染E.coli后可以随意包裹寄主后可以随意包裹寄主DNA片段，只需这个片段包含的片段，只需这个片段包含的基因座位不超越基因座位不超越E.coli遗传图谱的两分钟间隔，均可一同被转遗传图谱的两分钟间隔，均可一同被转导，这是普通用接合和转化作用来进展基因定位所难以实现的，导，这是普通用接合和转化作用来进展基因定位所难以实现的，对细菌染色体小片段的精细构造非常有用。对细菌染色体小片段的精细构造非常有用。 两个临近的基因一同被转导的景象称为共转导两个临近的基因一同被转导的景象称为

45、共转导cotransduction)。 当转导的当转导的DNA片段进入受体后，与受体同源分子进展重片段进入受体后，与受体同源分子进展重组，当另一个基因的标志被选择时，那么另一个临近基因的发组，当另一个基因的标志被选择时，那么另一个临近基因的发现频率随着它们二者之间间隔的减少而增大，这个频率称为共现频率随着它们二者之间间隔的减少而增大，这个频率称为共转导频率转导频率cotransduction frequency。 用下式表示：用下式表示： F1dL3 d为两个基因之间的间隔，为两个基因之间的间隔，L是是P1基因组或转导片段长度基因组或转导片段长度在遗传图谱上用分钟表示。在遗传图谱上用分钟表示。

46、 比如：有两个基因的共转导频率是比如：有两个基因的共转导频率是65，L为为2分钟约分钟约76kb。 这两个基因之间的间隔为这两个基因之间的间隔为0.26分钟约分钟约10kb。利用转导法选育目的菌，首要的义务是要获得转导噬菌体。利用转导法选育目的菌，首要的义务是要获得转导噬菌体。 转导噬菌体的获得：转导噬菌体的获得： 噬菌体侵染供体菌后，在感染末期，少数噬菌领会将供体菌噬菌体侵染供体菌后，在感染末期，少数噬菌领会将供体菌的的DNA误以为是它们本人的误以为是它们本人的DNA，并以其外壳蛋白将细菌，并以其外壳蛋白将细菌DNA包围起来，从而构成转导噬菌体。包围起来，从而构成转导噬菌体。 由于细菌由于细

47、菌DNA的任何部分都可以被包装，因此，要获得目的任何部分都可以被包装，因此，要获得目的转导子必需求经过那些选择性标志。的转导子必需求经过那些选择性标志。转导育种的过程转导育种的过程操作过程如下：操作过程如下： 先将供体菌培育至对数生长期，然后向其中参与噬菌先将供体菌培育至对数生长期，然后向其中参与噬菌体，继续培育是一部分供体菌发生裂解反响而释放出转导体，继续培育是一部分供体菌发生裂解反响而释放出转导噬菌体。参与氯仿以杀死仍活着的供体菌，待完全溶菌后噬菌体。参与氯仿以杀死仍活着的供体菌，待完全溶菌后低速离心以除去菌体残渣，上清液经低速离心以除去菌体残渣，上清液经Dnase处置和微孔滤处置和微孔滤

48、膜除菌后，即制成供体菌裂解液。膜除菌后，即制成供体菌裂解液。 将受体菌培育至对数生长期，向其中参与供体菌裂解将受体菌培育至对数生长期，向其中参与供体菌裂解液，待转导噬菌体吸附后，低速离心搜集菌体。将该菌体液，待转导噬菌体吸附后，低速离心搜集菌体。将该菌体转移到选择培育基平板上，培育即可从中获得目的转导子。转移到选择培育基平板上，培育即可从中获得目的转导子。 首先要进展噬菌体效价的测定。所谓噬菌体效价就是首先要进展噬菌体效价的测定。所谓噬菌体效价就是1ml培育液中含有活噬菌体的数目。培育液中含有活噬菌体的数目。 所谓原生质体交融，就是将双亲株的微生物细胞分别经所谓原生质体交融，就是将双亲株的微生

49、物细胞分别经过酶解脱壁，使之成为原生质体。然后在高渗的条件下混合，过酶解脱壁，使之成为原生质体。然后在高渗的条件下混合，并参与物理的、化学的、生物的助融条件，使双亲株的原生并参与物理的、化学的、生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集。经过细胞质交融、核交融，而后发生质体间发生相互凝集。经过细胞质交融、核交融，而后发生基因组间的交换、重组，进而可以在适宜的条件下再生出微基因组间的交换、重组，进而可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来，从而获得重组子的过程。生物的细胞壁来，从而获得重组子的过程。 狭义的原生质体狭义的原生质体protoplast即细胞壁被彻底酶解完全即细胞壁被彻底酶解完

50、全 脱壁后构成的脱壁后构成的 1、原生质体、原生质体 广义的原生质体既包括狭义的原生质体也包括不完全脱广义的原生质体既包括狭义的原生质体也包括不完全脱 壁后构成的圆球体壁后构成的圆球体spheroplast 物理的物理的 ：瞬时高压的交变电场或激光等：瞬时高压的交变电场或激光等 2、助融条件、助融条件 化学的：聚乙二醇、二甲亚砜、伴刀豆球蛋白化学的：聚乙二醇、二甲亚砜、伴刀豆球蛋白A、磷、磷 脂酰丝氨酸、溶血卵磷脂等脂酰丝氨酸、溶血卵磷脂等 生物的：仙台病毒、鸡新城疫病毒、等生物的：仙台病毒、鸡新城疫病毒、等关于原生质体概念的解释：关于原生质体概念的解释： 生物工程生物工程biotechnol

51、ogy细胞工程细胞工程基因工程基因工程酶工程酶工程发酵工程发酵工程固定化细胞固定化细胞基因体外重组基因体外重组染色体移植或引入染色体移植或引入细胞器移植细胞器移植核移植核移植固定化酶固定化酶酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰发酵自动化发酵自动化产品后处置产品后处置泛指遗传工程泛指遗传工程组织培育组织培育原生质体交融原生质体交融1、原生质体交融是一种更为广泛，更为随机的基因重组方式；、原生质体交融是一种更为广泛，更为随机的基因重组方式；2、原生质体交融方式，可以突破微生物的种属界限，实现远缘菌、原生质体交融方式，可以突破微生物的种属界限，实现远缘菌株间的基因重组；株间的基因重组；3、原生质体交

52、融可以使遗传物质传送更为完全，可以获得更多基、原生质体交融可以使遗传物质传送更为完全，可以获得更多基因重组的时机，有利于提高育种速度；因重组的时机，有利于提高育种速度；4、借助交融剂可同时将几个亲本的原生质体随即交融在一同，从、借助交融剂可同时将几个亲本的原生质体随即交融在一同，从而获得综合几个亲本性状的重组体，加速育种进程；而获得综合几个亲本性状的重组体，加速育种进程；5、原生质体交融可以和其它育种方法相结合，把从其它方法得到、原生质体交融可以和其它育种方法相结合，把从其它方法得到的优良性状经过原生质体交融在组合到一个单株中，提高菌株的优良性状经过原生质体交融在组合到一个单株中，提高菌株产量

53、的几率增大；产量的几率增大；6、原生质体交融可以大大提高遗传重组的频率；、原生质体交融可以大大提高遗传重组的频率；7、在消费菌种的选育中，可以应器具有较高产量性状的菌株作为、在消费菌种的选育中，可以应器具有较高产量性状的菌株作为交融时出发菌株，以期到达理想育种的目的；交融时出发菌株，以期到达理想育种的目的；8、可以运用灭活的原生质体进展交融，从而提高挑选效率，省去、可以运用灭活的原生质体进展交融，从而提高挑选效率，省去育种过程中对亲株的遗传标志，省去人力、物力和时间，也可育种过程中对亲株的遗传标志，省去人力、物力和时间，也可防止因添加标志而降低出发菌株的产量；防止因添加标志而降低出发菌株的产量

54、；9、原生质体技术有助于建立工业微生物的转化体系，开辟新的育、原生质体技术有助于建立工业微生物的转化体系，开辟新的育种途径；种途径；10、对微生物制备原生质体后直接再生育种、原生质体诱变后再、对微生物制备原生质体后直接再生育种、原生质体诱变后再生育种、原生质体转化育种、原生质体转导育种、原生质体固生育种、原生质体转化育种、原生质体转导育种、原生质体固定化等原生质体技术在微生物育种与工业消费中近年来已日趋定化等原生质体技术在微生物育种与工业消费中近年来已日趋广泛开展；广泛开展；11、在实际上，微生物的原生质体交融可用于研讨噬菌体与寄主、在实际上，微生物的原生质体交融可用于研讨噬菌体与寄主间的关系

55、，深化了解溶源机理及免疫因子和存在部位；研讨原间的关系，深化了解溶源机理及免疫因子和存在部位；研讨原噬菌体的噬菌体的DNA在寄主染色体上的结合位点；在寄主染色体上的结合位点；12、在细胞学研讨方面，经过原生质体交融，有助于研讨核质关、在细胞学研讨方面，经过原生质体交融，有助于研讨核质关系及细胞质遗传问题；系及细胞质遗传问题；13、微生物原生质体交融，可用于遗传性分析等实际研讨。、微生物原生质体交融，可用于遗传性分析等实际研讨。1标志菌株的挑选；标志菌株的挑选；2原生质体的制备；原生质体的制备；3原生质体的再生；原生质体的再生；4原生质体的交融；原生质体的交融；5交融子的选择；交融子的选择；6适

56、用型菌株的挑选。适用型菌株的挑选。原生质体交融普通包括如下步骤：原生质体交融普通包括如下步骤：BAABa+b-a-b+菌株标志菌株标志细胞壁细胞壁溶菌酶溶菌酶AB细胞膜细胞膜加加PEG混合混合交交融融的的原原生生质质体体转再生平皿转再生平皿2BA134挑选交融子挑选交融子温浴温浴稳定高产重组子稳定高产重组子 标志的标志的营养体细胞营养体细胞 原生质体原生质体1a+b-2a+b+3a-b-4a-b+原生质体的构成原生质体的构成交融交融CW再生再生 稳定稳定正变株的挑选正变株的挑选细胞原生质体交融程序表示图细胞原生质体交融程序表示图一标志菌株的挑选一标志菌株的挑选 在原生质体交融过程中，为了便于挑

57、选，通常在原生质体交融过程中，为了便于挑选，通常对于所用的亲株都要进展一定的遗传标志。对于所用的亲株都要进展一定的遗传标志。 普通可以采用营养缺陷标志和抗药性标志。普通可以采用营养缺陷标志和抗药性标志。二原生质体的制备二原生质体的制备 在细菌和放线菌中主要采用溶菌酶；在细菌和放线菌中主要采用溶菌酶； 在酵母菌和霉菌中普通可用蜗牛酶和纤维在酵母菌和霉菌中普通可用蜗牛酶和纤维素酶。素酶。影响原生质体制备的要素影响原生质体制备的要素1、菌体的预处置、菌体的预处置 为了使酶的作用效果更好一些，可对菌为了使酶的作用效果更好一些，可对菌体进展预处置，包括菌体培育阶段的预处体进展预处置，包括菌体培育阶段的预

58、处置和酶解前的预处置。置和酶解前的预处置。 对于细菌可参与甘氨酸、青霉素和对于细菌可参与甘氨酸、青霉素和D环丝氨酸等，对于放线菌可以运用甘氨酸环丝氨酸等，对于放线菌可以运用甘氨酸14等，在酵母菌中参与等，在酵母菌中参与EDTA和巯和巯基乙醇等。基乙醇等。 2、菌体的培育时间、菌体的培育时间 为了使菌体易于原生质体化，普通选择对数为了使菌体易于原生质体化，普通选择对数生长期的菌体。生长期的菌体。 普通对于细菌采用对数生长期后期为好，普通对于细菌采用对数生长期后期为好，对于放线菌采用对数生长期与稳定期之间的转对于放线菌采用对数生长期与稳定期之间的转换期最为适宜。换期最为适宜。3、酶浓度、酶浓度 普

59、通来讲，酶浓度添加，原生质体构成率普通来讲，酶浓度添加，原生质体构成率添加，但是超越一定范围，那么原生质体构成添加，但是超越一定范围，那么原生质体构成率添加的效果不明显；酶浓度过低，那么导致率添加的效果不明显；酶浓度过低，那么导致原生质体再生率下降。原生质体再生率下降。 通常，采用当原生质体构成率和再生率之通常，采用当原生质体构成率和再生率之积到达最大时的酶浓度作为最正确酶浓度。积到达最大时的酶浓度作为最正确酶浓度。4、酶解温度、酶解温度 温度对酶解作用有双重影响。一方面，随着温温度对酶解作用有双重影响。一方面，随着温度的提高，酶解反响速度加快；另一方面，随着温度的提高，酶解反响速度加快；另一

60、方面，随着温度的添加，酶蛋白逐渐变性而失活。因此，最适温度的添加，酶蛋白逐渐变性而失活。因此，最适温度是这两方面的共同结果。度是这两方面的共同结果。 普通在选择最正确温度时，除了思索酶的最适普通在选择最正确温度时，除了思索酶的最适温度外，还要以原生质体再生率加以校正。温度外，还要以原生质体再生率加以校正。5、酶解时间、酶解时间 原生质体的制备质量与酶解时间有亲密的关系。原生质体的制备质量与酶解时间有亲密的关系。酶解时间过短，原生质体构成不完全，结果会影响酶解时间过短，原生质体构成不完全，结果会影响到交融；酶解时间过长，原生质体脱壁太完全，原到交融；酶解时间过长，原生质体脱壁太完全，原生质体的质