第三篇食品中各类微生物检验

1、食品微生物学实验是为生物工程、生物技术等专业选修课程食品微生物学开设的实验，包括两部分内容：一是微生物发酵食品加工，如甜酒酿的酿制，酸乳的制作、豆腐乳的制作、面包的制作等；二是食品中微生物的检验，包括常规检验如菌落总数、大肠菌群的检验和致病性微生物的检验等。第一篇 微生物食品加工实验一 甜酒酿的制作一、目的1、通过甜酒酿的制作了解酿酒的基本原理。2、掌握甜酒酿的制作技术。二、原理以糯米（或大米）经甜酒药发酵制成的甜酒酿，是我国的传统发酵食品。我国酿酒工业中的小曲酒和黄酒生产中的淋饭酒在某种程度上就是由甜酒酿发展而来的。甜酒酿是将糯米经过蒸煮糊化，利用酒药中的根霉和米曲霉等微生物将原料中糊化后的

2、的淀粉糖化，将蛋白质水解成氨基酸，然后酒药中的酵母菌利用糖化产物生长繁殖，并通过酵解途径将糖转化成酒精，从而赋予甜酒酿特有的香气、风味和丰富的营养。随着发酵时间延长，甜酒酿中的糖分逐渐转化成酒精，因而糖度下降，酒度提高，故适时结束发酵是保持甜酒酿口味的关键。三、材料1、材料：糯米、酒药2、仪器和器具：手提高压灭菌锅，不锈钢丝碗，滤布，烧杯，不锈钢锅。四、流程原料选择洗米蒸饭淋水降温落缸搭窝接种保温发酵后熟质量评估五、方法1、洗米蒸饭将糯米淘洗干净，用水浸泡4h，捞起放于置有滤布的钢丝碗中，于高压锅内蒸熟（约0.1Mpa，9min），使饭“熟而不糊”。2、淋水降温用清洁冷水淋洗蒸熟的糯米饭，使其

3、降温至35左右，同时使饭粒松散。3、落缸搭窝将酒药均匀拌入饭内，并在洗干净的烧杯内洒少许酒药，然后将饭松散放入烧杯内，搭成凹形圆窝，面上洒少许酒药粉。盖上培养皿盖。4、保温发酵于30进行发酵，待发酵2天后，当窝内甜液达饭堆2/3高度时，进行搅拌，再发酵1天左右即可。六、结果1、发酵期间每天观察、记录发酵现象。2、对产品进行感官评定，写出品尝体会。七、思考1、制作甜酒酿的关键操作是什么？2、发酵期间为什么要进行搅拌？实验二 酸乳的制作一、目的1、掌握酸乳制作原理2、学会酸乳的制作方法二、概述酸奶因具有清新爽口的味觉而倍受欢迎 , 又由于酸乳中会有乳酸菌的菌体及代谢产物,它对肠道内的致病菌有一定的

4、丑掣作用,故对人体的肠道消化道疾病有良好的治疗效果。三、原理酸乳是以牛乳为主要原料，接入一定量的乳酸菌，经发酵后而制成的一种乳制品饮料,当乳酸菌在牛乳中生长繁殖和产酸至一定程度时,pH下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集，这种凝乳状酸奶称为凝固型酸奶。四、器材鲜牛奶、奶粉、蔗糖、菌种(或市售酸乳)、天平、烧杯、玻璃棒、牛奶瓶、恒温水浴锅、恒温培养箱、冰箱、不锈钢锅。五、方法（一）凝固型酸奶制作在添加生产发酵剂后立即进行包装,并在包装容器中发酵而成,成品呈凝乳状。1、工艺流程蔗糖、脱脂奶粉 原料鲜奶一净化一脂肪含量标准化一配料一过滤一预热一均质一杀菌-冷却-接种一分装一发酵一冷却一后熟。2、操

5、作步骤（1）牛奶瓶消毒：将牛奶瓶在不锈钢锅里用沸水煮15分钟。（2）牛乳的净化：利用特别设计的离心机,除去牛乳中的白血球和其他肉眼口见的异物。（3）脂肪含量标准化：鲜奶中脂肪含量比较高,为了避免酸奶中有脂肪析出,因此需要对鲜奶的脂肪含量进行调整使其达到所要求的标准。可以在脂肪含量高的牛乳中,加入一定体积的脱脂乳,或通过分离机,从牛乳中分离出稀奶油,然后在得到的脱脂乳中再掺入一定量稀奶油,使调制乳的脂肪含量达到要求。（4）配料a.奶粉的添加:经脂肪含量标准化处理的调制乳(或按1：7的比例加水把奶粉配制成复原牛奶)，为了使其非脂干物质含量达到要求,一般往调制乳中添加脱脂奶粉,经如此处理的酸奶有一定

6、的硬度,脱脂奶粉的添加量一般为1%-3%。b.蔗糖的添加：为了缓和酸奶的酸味,改善酸奶的口味,一般在调制乳中加入4%-8%的蔗糖,如果蔗糖量加入过多,会因调制乳渗透压的增加而阻碍乳酸菌主长一般是先将原料乳加热到60左右,然后加入蔗糖,待糖溶解后,过滤除杂,经过滤的奶液再进行均质处理。（5）均质：用于制作酸奶的原料乳一般都要进行均质处理,经过均质处理,乳脂肪被充分分散酸奶不会发生脂肪上浮现象,酸奶的硬度和粘度都有所提高,而且酸奶口感细腻,更易被消化吸收,将加热和均质两种方法适当结合起来,处理的效果会更好,一般是先将原料乳地垫至60左右,然后在均质机中,于8-1OMpa压力对乳进行均质处理。（6）

7、灭菌：均质后的原料乳的灭菌方法大致有两种:将乳加热至90,保温5min,或置于80恒温水浴锅中灭菌15分钟,也可用超高温瞬时灭菌法（在135下保温2-3s）。灭菌目的有以下几点：杀灭原料乳中的微生物,特别是致病菌。形成乳酸菌生长促进物质,破坏乳中存在的阻碍乳酸菌生长的物质。除去原料乳中的氧及由于乳清蛋白的变性而增加的-SH,从而使氧化还原电位下降,助长乳酸菌的生长。使乳清蛋白变性膨润,从而改善酸奶的硬度和粘度,并阻止水分从变性酷蛋白凝聚成的网状结构中分离出来。灭菌后,使乳中原本存在的酶失活,使发酵过程成为单一乳酸菌的作用过程,易于控制生产。经灭菌处理后的原科乳迅速冷却到43-45待接种。（7）

8、接种：向43-45灭过菌的原料乳中加入工作交酵剂,接种量为2-3%，通常是嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的混合菌，两种菌的比例为1:1或2：1。球菌的接种量稍多些,可弥补由于杆菌生长产酸而阻碍球菌生长所造成的球菌数量不足的缺点。经实验证明，当接种量超过3%时,发酵所需时间并不因种量加大而缩短,而酸奶的风味由于发酵前期酸度上升太快反而变差,所以,任意加大接种量是无益的,反之,若接种量过小,发酵所需时间延长,酸奶的酸味会显得不够。（8）分装：酸奶受到振动,凝乳状态易被破坏,因此,不能在发酵罐中先发酵然后再进行。分装,必须是将会有乳酸菌的牛乳培养基先分装到销售用的玻璃瓶或塑料小容器中,加盖后送入恒温室培

9、养,在容器中发酵制成酸奶,为了避免杂菌的侵入,分装操作应在无菌室中进行。牛乳分装后,容器上部留出的空隙要尽可能小,这样容器中的内容晃动幅度小,酸奶的形态易保持完整,另外,减少空气也有利于乳酸菌的生长。整个分装操作的时间要短,使乳液温度下降少,这样乳液温度与所设定的发酵温度接近,整个发酵时间就不会被延长。（9）发酵:将装有含乳酸菌的牛乳的容器置于恒温箱中进行发酵,恒温箱的温度保持在40-43,时间为3-4小时,或30培养18-20小时,发酵终点的确定有两种方法:a.发酵奶的酸度已达到65-70oT,用0.1moL/L NaOH 标准溶液滴定10ml样品,每消耗掉 1mLNaOH溶液称为1滴定酸度

10、(oT)或PH=4-5；b.发酵奶的流动性变差,基本凝固。(10)冷却:发酵结束,在将酸奶移放进冷藏室进行贮存和后熟处理之前,应将酸奶从发酵室中取出,用冷风迅速将其冷却到10以下使酸奶中的乳酸菌停止生长,防止酸奶酸度过高而影响口感。(11)后熟:酸奶在形成凝块后应在4-7下保持24小时以上,以获得酸奶特有风味和较好口感。(12)冷藏:经冷却处理的酸奶贮藏在2-5,最好是-1-0的冷藏室保存,低温保存有以下优点:保存期间,酸奶的酸度上升极少；牛乳凝固时会产生收缩力,导致乳清折出,在低温时这种收缩力比较弱,所以乳清不易从酸奶中分离出来；低温下酸奶逐渐形成白玉般的组织状态,结构非常细腻；低温保存过程

11、中,香味物质逐渐形成,使酸奶具有较浓香味。(13)品味：酸奶应有凝块,质地细腻,酸甜适中,清新爽口,若有不良异味,则很可能是酸奶污染了杂菌。（二）搅拌型酸奶的制作 在发酵罐中接种生产发酵剂,凝固后,再经搅拌入杯成其它容器中,产品凝乳粒子直径保持在0.01-0.04mm大小。呈半流动状态的粥糊状,易使用吸管吸食。1、工艺流程原料鲜奶配料预热均质杀菌冷却接种搅拌发酵冷却搅拌混合装瓶冷却后发酵 辅料2、操作步骤(略)(三)饮料型酸奶将凝固型酸奶均质处理后,使凝乳充分分散,凝乳粒子直径在0.01mm以下的酸奶,这种酸奶的特点是与牛乳相似,呈液体状。1、工艺流程凝固型酸奶混合均质分装冷却冷藏 稳定剂溶液

12、2、操作步骤(1)凝固型酸奶的制备(略)(2)混合:为了防止饮料型酸奶产生分层现象,一般在疑固型酸奶中加入稳定剂,然后再用均质机破乳,由于增加了稳定剂,即使在冷藏期间也不会发生酸奶分层现象。根据来源,可将稳定剂分成两类:人工合成稳定剂,如海藻酸丙二醇酶(PGA)等；天然稳定剂,如明胶、琼脂、海藻酸纳和果胶等。稳定剂的种类、添加量和添加方式,对于制备凝固塑酸到十分重要。目前在酸奶中使用得较多的是低甲氧基果胶(LM果胶)。一般加入量为0.3%,使用时，先将LM果胶用水溶解,经灭菌后冷却到接近酸奶的温度(20-15),然后加入酸奶中搅匀。(3)均质:在1OMPa压力下,将上述酸奶进行均质处理。(4)

13、分装:均质后的酸乳液,灌装到销售用的小容器中后,迅速冷却到10以下。(5)冷藏:饮料型酸奶会有活乳酸菌,因此应置于O-5冷藏。(四)果汁酸奶果汁酸奶是在凝固型酸奶中添加果汁和稳定剂后，再经均质处理制成的。1、工艺流程低酸味凝固型酸奶混合均质分装冷却冷藏 果汁、稳定剂2、操作步骤(1)低酸味凝固型酸奶的制备:果汁(露)的添加会增加酸奶的酸味,因此在接种时,将嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌两者的比例改变成10:1,目的是减少保加利亚乳杆菌产生的乳酸,这样可避免产生酸味过强,制备低酸味凝固型酸奶的其它操作步骤,与一般凝固型酸奶的制法相同。(2)混合:将酸奶和灭菌后冷却到15-20的果汁(露)按4:1混合

14、,同时加入适量灭过菌的稳定剂水溶液,搅拌均匀。(3)均质:在1OMpa压力下,将上述酸奶进行均质处理。(4)分装:将经均质处理过的果汁酸奶乳液灌装到销售用的小容器中,迅速将其冷却到10以下。(5)冷藏:冷却后的酸奶,置于O-5的冷藏室中冷藏。(五)杀菌型酸奶由牛乳制成酸奶后,用加热方法将酸奶中所有微生物杀灭的一种酸奶,此种酸奶特点是:不存在乳酸菌和其它微生物,保存期中酸奶酸度不会改变,且保存期延长,但凝乳经加热后,十分容易折出乳清,需在发酵前加稳定剂,灭菌后酸奶的营养价值也有所降低。1、工艺流程糖、奶粉、稳定剂 -搅拌型酸奶- 发酵-杀菌- -无菌分类脂肪含量标准化牛乳配料过滤均质分装 -饮料

15、型酸奶- -发酵-杀菌-凝固型酸奶2、操作步骤杀菌型酸奶除多了一步杀菌工序外,其它操作步骤与凝固型酸奶基本相同。杀菌:微生物在酸性环境中对温度十分敏感,当PH为4.O-4.5时,65加热5min就能够把酸奶中的微生物杀死制作杀菌型酸奶常使用这种方法。其它步骤(略)。(六)冷冻酸奶在酸奶中添加糖和香料,按照冰淇淋生产工艺加工成保健饮料。按冷冻酸奶是否含有活菌,可将其划分为活菌型冷冻酸奶和杀菌型冷冻酸奶两种类型活菌型冷冻酸奶在-25贮藏一年活乳酸菌残存50%-80%，杀菌型冷冻酸奶是将酸奶中活乳酸菌杀死因此成品性能稳定。1、工艺流程糖液杀菌冷却 酸奶混合均质搅拌、分装搅拌型冷冻酸奶冷藏 香料 快速

16、冷冻(-35)凝固型冷冻酸奶冷藏2、操作步骤(1)牛乳的净化、脂肪含量标准化和配料的操作方法与制作凝固型酸奶相同。(2)将原料加热至75,然后用均质机进行二段均质(均质压力为13.538Mpa,3.434Mpa)(3)均质后的乳加热到85,保温10min,接着将此灭菌奶冷却到44。(4)接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌液(1：1),接种量为2%-3%。(5)在43左右发酵6-7h,终止时酸奶的pH值为4.7-5.0。(6)在上述酸奶中添加经杀菌冷却的糖液和香料,充分混合后,在143Mpa 压力60 下均质,接着,将均质奶冷却到45,成熟数小时后分装。最后送入-35冷库,快速冷冻硬化,得到

17、凝固型冷冻酸奶,也可以将成熟后的酸奶不经过冷冻硬化,在分装后直接冷藏保存制成搅拌型冷冻酸奶。六、注意事项(1)选择优质、新鲜的牛奶和酸奶(作为菌种)。(2)严格无菌操作,尽量避免杂菌污染。(3)酸乳制好后,应在O-5下保藏,保质期为5天。附一:原料奶质量要求a.来源于健康牛所产的乳,色泽呈乳白色或微黄色,气味芳香、无异味初乳、末乳、细菌污染乳均不得使用。b.乳牛注射抗生素后所产出乳,四天内不得使用。生产前应做小样。c.总乳固体不低于11.5%,非脂乳固体大于8.5%。d.原料中不得含碱及菌剂等杂质。e.奶温不高于10,70度酒精试验无絮状物沉淀。附二:酸牛奶卫生标准1、感官指标呈乳白色或和稍带

18、淡黄色,具有清香纯净的乳酸味,凝块稠密结实均匀，无气泡,允许少量乳清折出。2、理化指标项目指标脂肪含量/%3.0酸度（以乳酸计）/%0.63-0.99汞含量（以Hg计）mg/kg-10.013.细菌指标项目指标大肠菌群/个（100mL）-190致病菌（系指肠道致病菌及致病性球菌）不得检出实验三 面包的制作一、目的1、掌握面包制作的原理、工艺。2、学会面包的制作方法。二、概述面包是产小麦国家的主食，几乎世界各国都有生产。它是以面粉为主要原料，以酵母菌、糖、油脂和鸡蛋为辅料生产的发酵食品，其营养丰富，组织蓬松，易于消化吸收，食用方便，深受消费者喜爱。三、原理酵母加入面粉和水的混和合物中后,在28左

19、右的温度下,利用面粉中含有少量单糖与蔗糖开始生长繁殖,在生长繁殖的同时,面粉中的-淀粉酶能将面粉中的淀粉转化为麦芽糖。 -淀粉酶2(C6H1005)+2nH20n(C12H22011)淀粉 麦芽糖麦芽糖的增加,为酵母菌进一步生长发酵提供了可利用的营养物质。酵母菌菌体本身能够分泌麦芽糖酶和蔗糖酶,将麦芽糖和蔗糖分解成单糖,供酵母菌利用。 麦芽糖酶(C12H22011)+H202C6H1206麦芽糖 葡萄糖 蔗糖转化酶(C12H22011)+H20C6H1206+ C6H1206蔗糖 葡萄糖 果糖酵母菌利用这些糖类及其它营养物质先后进行有氧呼吸和无氧呼吸,产生二氧化碳、醇、醛和一些有机酸等产物。有

20、氧呼吸C6H1206+6O26CO2+6H20+674千卡无氧呼吸C6H1206C2H5OH+2CO2+24千卡生成的二氧化碳由于被面团中的面筋包围,不易跑出,留在面团内,从而使面团逐渐胖大。发酵后的面团,经揉搓成型醒发后,放入200左右的烤炉中烘烤。由于面团内的二氧化碳受热膨胀,逸散,从而使面包充满多孔,形成海绵状。在发酵中形成的其它物质如乙醇、乳酸、醋酸、醛酮类等有机化合物,在烘烤中形成了面包特有的香味。四、原料与器材面粉、白糖、油脂、酵母、改良剂、不锈钢锅、托盘天平、量筒、调羹、恒温箱、不锈钢刀、瓷盘、远红外电热烤箱。五、操作步骤1、原辅料配方:面粉100%；水45-55%；干酵母0.8

21、-1.5%；改良剂1%；白糖20%；油脂8%-10%。2、面团第一次发酵:将面粉的50%全部酵母、改良剂、白糖及适量的水调制成面团,让面团在28-30下发酵2-4小时。3、面团第二次发酵:将剩余的原辅料拌入经过第一次发酵的面团中搅拌均匀后在28-30下发酵1.5-2小时。4、成型:将发酵好的面团,按要求切成小块加工成各种形状,注意应搓得均匀飞紧密，不要使表面有裂纹。5、醒发:将面包坏放入烤盘,表面刷上一层清水,在40下醒发约30min(烤盘底部涂一些油)。6、烘烤:将面包坯放入烤箱中,在约200温度下烘烤8-10分钟。7冷却:面包出炉后,温度很高,须经冷却后才能包装和贮藏。六、面包质量要求色:

22、面包的表面应为金黄色或棕黄色,色泽均匀一致,富有光泽,无烤焦或发自现象,内部颜色洁白。形:面包表面应光滑,无撒粉粒、气泡、裂纹、粘边现象,外形应符合各种形状面包要求,内部组织气孔细密均匀,富有弹性。香:香味纯正,有面包特有香味。七、注意事项1、注意料的适度,尤其是面粉与水的配比。2、严格控制面团发酵,醒发和面包烘烤的温度与时间,尤其是烘烤时,要防止烤焦。3、在面包制作过程中,自始至终都要注意卫生。实验四 酸乳中乳酸菌的测定一、目的1、解酸乳中乳酸菌分离原理2、学习并掌握酸乳中乳酸菌菌数的检测方法。二、原理活性酸奶需要控制各种乳酸菌的比例，有些国家将乳酸菌的活菌数含量作为区分产品品种和质量的依据

23、。由于乳酸菌对营养有复杂的要求，生长需要碳水化合物、氨基酸、肽类、脂肪酸、酯类、核酸衍生物、维生素和矿物质等，一般的肉汤培养基难以满足其要求。测定乳酸菌时必须尽量将试样中所有活的乳酸菌检测出来。要提高检出率，关键是选用特定良好的培养基。采用稀释平板菌落计数法，检测酸奶中的各种乳酸菌可获得满意的结果。三、材料1、培养基MRS培养基，改良CHALMERS培养基，M17培养基。2、仪器和器具无菌移液管（25ml,1ml），无菌水（225ml带玻璃珠三角瓶，9ml试管），无菌培养皿，旋涡均匀器。恒温培养箱。四、流程酸奶稀释制平板培养检查计数五、方法1、样品稀释先将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品

24、25ml加入盛有225ml无菌水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇，务必使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液，然后根据对样品含菌量的估计，将样品稀释至适当的稀释度。2、制平板选用23个适合的稀释度，培养皿贴上相应的标签，分别吸取不同稀释度的稀释液1ml置于平皿内，每个稀释度作2个重复。然后用溶化冷却至46左右的MRS或改良CHALMERS培养基倒平皿，迅速转动平皿使之混合均匀，冷却成平板。3、培养和计数将平皿倒置于40恒温箱内培养2448h，观察长出的细小菌落，计菌落数目，按常规方法选择30300个菌落平皿进行计算。六、结果1、指示剂显色反应乳酸菌的菌落很小，13mm，园形隆起，表面光滑或

25、稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。由于产酸菌落周围能使CaCO3产生溶解圈，酸碱指示剂呈酸性显色反应。2、镜检形态必要时，可挑取不同形态菌落制片镜检确定是乳杆菌或乳链球菌。保加利亚乳杆菌呈杆状，成单杆、或双杆菌或长丝状。嗜热链球菌，呈球状，成对、或短链、或长链状。3、参照比较据介绍，改良CHALMERS培养基的检出率较MRS培养基高，M17培养基较适合于乳球菌的培养，在检测时可同时使用多个培养基作比较。七、思考1、为什么乳酸菌的检测关键是选用特定良好的培养基？2、培养基中为什么要加CaCO3？第二篇 食品中各类微生物检验 本篇主要包括食品中菌落总数、大肠菌群、各种致病菌、霉菌和寄生虫的检验。本

26、篇包括食品中菌落总数和大肠菌群的测定，这两个项目是每一种出厂食品都必须检测的项目。实验五 食品中菌落总数的测定 食品中菌落总数的测定，目的在于了解食品在生产中，从原料加工到成品包装受外界污染的情况；也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，确定食品的保存期，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 食品有可能被多种类群的微生物所污染，每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及其生理条件(如温度、培养时间、PH值、需氧性质等)去满足其要求，才能分别将各种细菌培养出来。但在实际工作中，一般都只用一种常用的方法去作菌落总数的测定，所得结果，只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧

27、菌的菌落数。国家标准所规定的菌落总数(Berobie bacterial count)就是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或lmL检样中所合细菌菌落的总数。食品中菌落总数的多少，直接反映着食品的卫生质量。如果食品中菌落总数多于10万个，就足以引起绍菌性食物中毒；如果人的感官能察觉食品因细菌的繁殖而发生变质时，细菌数大约已达到106一107个g(mL或cm2)。详见表51。表5-1食品种类菌落总数/个1g或1mL1cm2鸡肉108106108.5（极少）牛肉(生)108106.3108.5腊肠106108.5鱼106.5106.6蟹肉108贝107牡蛎104105.7鲜蛋奶107

28、冰蛋106.7豆腐105106鲜牛乳106107米饭107108 从表中可以看出食品的变质反映与菌落总数的增多有一定联系，但有时食品中细菌含量很高，即使已达到相当于同种食品已变质时的细菌数，而食品并未有任何变质现象，这种情况也是经常会遇到的。有时食品遭受污染的程度特别严重，食品中虽含有大量的细菌，由于时间短暂或细菌繁殖条件不具备，就见不到变质现象。例如：细菌难以生长的一些干制食品和冰冻食品，它们含有细菌的多少，就可以表明这些食品在生产、运输、贮藏等过程中卫生管理的状况。 从食品卫生观点来看，食品中菌落总数越多，说明食品质量越差，也就应考虑到病原菌污染的可能性愈大；当菌落总数仅少量存在时，则病原

29、菌污染的可能性就会降低，或者几乎不存在。但也有少数情况并不完全如此，有人曾报道，从市售的一批冰蛋制品中，在所检出菌落总数在5000个g；以下的样品中，和其中仅含菌落总数380个g的样品中，均可分离出沙门氏菌，并且都有大肠菌群存在。再如，在一些菌落总数低的食品中(如罐头食品)，曾有细菌繁殖并已产生了毒素，但是由于环境条件的限制使细菌不能延续生长繁殖，而毒素因性状稳定不受环境的影响而仍在食品中保留。保这种情况，就不能单凭菌落总数一项指标来评定食品卫生质量的优劣。 还有一些食品，如酸泡菜、发酵乳等发酵制品，也不能单凭测定菌落总数来确定卫生质量，因为发酵制品本身就是通过微生物的作用而制成的。 根据以上

30、事实，食品中菌落总数的测定对评定食品的新鲜度和卫生质量起着一定的卫生指标作用，但还必须配合大肠菌群的检验和病原菌项目的检验，才能作出比较全面准确评定。一、目的1、学习并掌握细菌的分离和活菌计数的基本方法和原理2、了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义二、原理菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。三、

31、材料 1、食品检样2、培养基和试剂：75乙醇、无菌生理盐水、15氢氧化钠溶液、营养琼脂培养基3、其它设备和材料电热恒温培养箱、冰箱（0-4）、恒温水浴钨(46士1)、托盘天平、电炉（可调式）、吸管（1mL和10mL）、广口瓶（500mL）、三角瓶（500mL）、玻璃珠（直径为5mm）、平皿（皿底直径为9cm）、试管、试管架、酒精灯、均质器或乳钵、灭菌刀或剪刀、灭菌镊子、75酒精棉球、玻璃蜡笔、登记薄四、实验步骤(一)检验程序菌落总数检验程序见图51(二)检样稀释及培养 以无菌操作，将检样25g(或25mL)剪碎以后，放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预先置适当数量的

32、玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000rmin10000rmln的速度处理1min做成1：10的均匀稀释液。 用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管劈徐徐注入台有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同)，振摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。 另取1mL的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1

33、mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。 稀释液移入平皿后，应及时将凉至46营养琼脂培养基可放置在(45土1)水浴锅内保温注入平皿15mI一20mL，并转动平皿位混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置(36土1)恒温箱内培养(48土2)h取出板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得Ig(1mL)样品所含菌落总数。检样做成几个适当倍数的稀释液选择23个适宜稀释度各以1mL之量分别加入灭菌平皿内每皿内加入46适量营养琼脂菌落计数报告图5-1(三)菌落计算方法 (1)平板菌落数的选择 选取菌落数在30一300之间的平板作为菌落总

34、数测定标准。一个稀释度使用两个平板，选取两个平扳平均数其中一个平板有较大片状菌落生长时则不宜采用，而应以无片菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌落数。若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布2fB均匀，可计算半个平板后乘2U代表整个平皿菌落数。 (2)稀释度的选择 应选择平均菌落数在30一300之间的稀释度，乘以稀释倍效，报告之(见表5-2例1)。若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30一300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小应报告其平均数：若比值大于2，则报告其中较小的数字(见表5-2例2、例3)。若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之

35、(见表5-2例4)。若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌范数乘以稀释倍数报告之(见表5-2例5)。若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之见表5-2例6。若所有稀释度的平均菌落数均不在30一300之间，其中一部分大于300或小于30时，近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表5-2例7)。(3)菌落数的报告菌落数在100以刚t1按其实有数报告；大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字后面的数字，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数来表示，见表5-2“报告方式”一栏。表5-2 稀释度的选择及菌落数据报告方式稀释液及

36、菌落数两稀释液之比菌落总数（个/g，个/mL）报告方式（菌落总数）10-110-210-31多不可计164201640016000或1.6×1042多不可计295461.63775038000或3.8×1043多不可计271602.22710027000或2.7×1044多不可计多不可计31331300310000或3.1×105527115270270或2.7×1026000<10<107多不可计305123050031000或3.1×104(四)小结 平板培养计数法，只能检出生长的活菌，不能捡出样品中全部的细菌数，总是

37、比实际生存在食品中的细菌数要少，这是因为食品中存在多种细菌，它们的生活特性各异，不可能在统一培养条件下全部生长出来。但是，仍能借此评定整个食品被细菌污染的程度，所以目前一般食品的卫生检验中都普遍采用这种方法。 平板菌落计数测定食品中的菌落总数，一般均采用中温培养，特别是已属于直接供食用的制成食品，因为这些食品卫生的要求，是严格防止消化道传染病病原菌和食物中毒病原菌污染，这些病原菌都属于嗜温性菌，因而测定细菌数时，采用中温培养是比较合理的。四、其他菌落总数的测定方法上节标准平板培养汁数法虽是国家制定的菌落总数测定方法，在一定程度上能反映食品的卫生质量，但是对一些食品却不能做出准确的评价，这是因为

38、细菌的适应生长的温度有高温、中温和低温之分，所需的pH值和营养条件也不尽相同，并且和培养时间也有关系。例如，引起新鲜鱼类、贝类食品的新鲜度降低以至于腐败变质，起主要作用的细菌类群是低温细菌，为了调查这类食品新鲜度的状况，就必须采取低温培养72h。又如，冰冻鲜鱼、贝类作为食品原料，也常以测定嗜冷细菌的多少，来有效地反映出它们的新鲜度；再如，罐装食品，就必须以测定嗜热菌的多少来判定它们的卫生情况，等等。对于这类细菌的培养，所用的时间应相对延长，通常以平板上生长出可见菌落来决定。因为菌落的形成需要一定的时间，如果食品中混杂有多种细菌、菌种之间生长的速度就必然存在着差异，这样，就希望尽可能使多种细菌都

39、能在平板上产生菌落，从而才能比较正确地反映出食品的卫生质量。培养的时间与培养的温度有关，在不同的培养温度范围内，一般常采用的时间，如表53所示。表5-3 菌落总数测定所采用的时间和温度培养的细菌培养温度/培养时间/d嗜温菌3037（48±3）h嗜冷菌2025575101014嗜热菌455523五、思考题1、菌落总数的概念。2、测定食品中的菌落总数有什么重要意义?3、详细论述食品中菌落总数的测定方法。4、怎样用不同的方法测定活菌制剂中的双歧扦菌？5、活菌计效法测定食品中的菌落数有何优缺点?实验六 食品中大肠菌群的测定一、概述(一)大肠菌群的定义及范围根据国家1994年颁布的食品卫生检验

40、方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。表5-4 大肠菌群生化特性分类表靛基质甲基红V-P拘橼酸H2S明胶动力44.5乳糖大肠艾希氏菌+/-+大肠艾希氏菌+/-大肠艾希氏菌+/-费劳地拘橼酸杆菌+/-+/-费劳地拘橼酸杆菌+/-+/-产气克雷伯氏菌+产气克雷伯氏菌+阴沟肠杆菌+/-注：+，表示阳性；，表示阴性；+/-，表示多数阳性，少数阴性。 由上表可以看出

41、，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。(二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯密斯(TheoboldSmith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发

42、现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个g一109个g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。 2粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确的指标作用。 存在于肠道内持有的细菌，才能显示出指标的特异性。 在肠道内占有极高的数量，即

43、使被高度稀释后，也能被检出。在肠道以外的环境中，其抵抗力大于肠道致病菌或相似，进入水中不再繁殖。检验方法简便，易于检出和计数。在食品卫生微生物检验中，可作为粪便污染指标菌依据的上述条件，粪便中数量最多的是大肠菌群，而且大肠菌群随粪便排出体外后，其存活时间与肠道主要致病菌大致相似，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行。因此，我国选用大肠菌群作为粪便污染指标菌是比较适宜的。另外，作为粪便污染的指标细菌还有：分叉杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、乳酸菌、肠杆菌科中的梭状芽胞和底群链球菌等，据报道，拟杆菌是人体肠道内第二个较大的菌群；厌气性乳酸菌占人体肠

44、道内细菌组分的50以上，一般粪便中该菌量为109个g1010个g。肠道内属于肠杆菌科的细菌，除上述的细菌外，还有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌和副大肠杆菌等，也可以充当粪便污染指标菌。很多研究者认为，在冷踪食品或冷冻状态照射处理过的食品中，大肠杆菌可比其他多种病原菌容易死亡，因此，像这类食品，用大肠菌群作为指标菌就不够理想，而底群链球菌对低温抵抗力强，作为这类食品的粪便污染指标菌就比较适宜。上述的这些肠道内的其他细菌，虽与粪便有关，因均比不上大肠菌群所具备的指标特异性，所以目前还没有列入作为公认的粪便污染的指标细菌。当然，大肠菌群作为粪便污染指标菌也有一些不足之处：饮用水中含有

45、较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引起肠道传染病的流行。大肠菌群在一定条件下能在水中生长繁殖。在外界环境中，有的沙门氏菌比大肠菌群更有耐受力。3大肠菌群作为粪便污染指标菌的意义粪便污染的食品，往往是肠道传染病发生的主要原因，因此检查食品中有无肠道菌，这对控制肠道传染病的发生和流行，具有十分重要的意义。许多研究者的调查证明，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。在腹泻患者所排粪便中，非典型大肠杆菌常有增多趋势，这可能与机体肠道发生紊乱，大肠菌群在型别组成的比例上因而发生改变所致；随粪便排至外环境中的典型大肠杆菌，也可因条件的改变。使生化性状发生变异，因而转变为非典型大肠杆菌。

46、由此看来，大肠菌群无论；庄粪便内还是在外环境中，都是作为一个整体而存在的，它的菌型组成往往是多种的，只是在比例上，因条件不同而有差异。因此，大肠菌群的检出，不仅反映校样被粪便污染总的情况，而且在一定程度上也反映了食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况，所以具有广泛的卫生学意义。由于大肠菌群作为粪便污染指标菌而被列入食品卫生微生物学常规检验项目，如果食品中大肠菌群超过规定的限量，则表示该食品有被粪便污染的可能，而粪便如果是来自肠道致病菌者或者腹泻患者，该食品即有可能污染肠道致病菌。所以，凡是大肠菌群数超过规定限量的食品，即可确定其卫生学上是不合格的，该食品食用是不安全的。二、实验目的1、了

47、解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。2、学习并掌握大肠菌群的检验方法。三、原理大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number 简称MPN）表示。三、材料1、样品乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 2、菌种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）产气肠杆菌（Entero

48、bacteria aerogenes）3、培养基及试剂单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基质试剂、麦康凯(MA)4、其它设备和材料 温箱(36土1)、水浴锅(44土0.5)、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针。四、实验步骤(一)检验程序大肠菌群检验程序见图52(二)操作步骤1采样及稀释以无菌操作将校样25g(或25mL)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器

49、，以800rmjn1000rmin的速度处理1min，做成1：10的稀释液。用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支lmL灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液。根据食品卫生要求或对检验样品污染情况的估计按种3管。也可直接用样品接种。2乳糖初发酵试验即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。将待校样品接种子乳糖服盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管1mL及1mL以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置(36土1)培养箱内，培养(24土2)h，的

50、所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，勿有产生者，则按下列程序进行。如有产生者，则按下列程序进行。3分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼脂平板上，置(36土1)温箱内，培养18h一24h，：然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。4乳糖复发酵试验即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酪管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产生气体。在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置(36士l)的温箱内培养(24土2)h，观察产气情况。检样稀释乳糖胆盐发酵管36±1，24±2h产气不产气伊红美蓝琼脂平板36±1，18-24h大肠杆菌阴性报告乳糖发酵管36&#