一种基于SARS冠状病毒S蛋白的新型靶向输送生物仿真系统的研

1、一种基于一种基于SARS冠状病毒冠状病毒S蛋白的蛋白的新型靶向输送生物仿真系统的研究新型靶向输送生物仿真系统的研究 严重急性呼吸综合症（sever acute respiratory syndrome, SARS）于2002年11月首先在我国广东省出现，此后该症于2003年初在全球传播。 至2003年6月SARS流行被控制为止，全球被确诊的患者达到8098人，死亡人数774人；该病造成了巨大的经济损失。 SARS出现不久，经过全球科学家多中心协作努力，鉴定出导 致 S A R S 的 元 凶 是 一 种 新 型 的 冠 状 病 毒 （ S A R S coronavirus，SARS CoV）

2、。 SARS 冠状病毒(SARS-Cov)，属于巢状病毒目(Order: Nidovirales),冠病毒科(Family: Coronaviridae)，冠状病毒属(Genus: Coronavirus)。根据其基因组结构分类，它属于单链正义RNA 病毒(+)sense, ssRNA Virus。成熟的冠状病毒颗粒直径约为60 至220nm 不等。其形态学上最显著的特征在于，在病毒包膜(envelope)外，有明显的棒状膜外粒子(club-shaped peplomers)。这一酷似中世纪欧洲帝王王冠(crown)的结构，正是其”名字” - Coronavirus 的来源。S蛋白（蛋白（sp

3、ike-protein）即伸出包膜即伸出包膜的棒的棒-球形的糖蛋白，它在病毒与宿球形的糖蛋白，它在病毒与宿主细胞表面受体结合及介导病毒包膜主细胞表面受体结合及介导病毒包膜和细胞膜融合并进入细胞的过程中，和细胞膜融合并进入细胞的过程中，起关键性作用，也是冠状病毒主要的起关键性作用，也是冠状病毒主要的抗原蛋白。抗原蛋白。HE蛋白构成包膜的短突起，其可能蛋白构成包膜的短突起，其可能与冠状病毒早期吸附有关，某些与冠状病毒早期吸附有关，某些CoV的的HE蛋白可引起红细胞凝集及对红蛋白可引起红细胞凝集及对红细胞产生吸附细胞产生吸附M蛋白则是一种跨膜蛋白，在病毒的蛋白则是一种跨膜蛋白，在病毒的包膜形成与出芽

4、包膜形成与出芽(budding)过程中起过程中起重要作用。重要作用。E蛋白是一种相对较小的蛋白质，主蛋白是一种相对较小的蛋白质，主要散在分布于病毒包膜上。要散在分布于病毒包膜上。 N蛋白是一种碱性磷蛋白，其中央区蛋白是一种碱性磷蛋白，其中央区同基因组同基因组RNA结合，形成卷曲的核衣结合，形成卷曲的核衣壳蛋白壳蛋白S1能够与细胞受体特异性结合，能够与细胞受体特异性结合，S2介导病毒与细胞膜发生融合作用介导病毒与细胞膜发生融合作用 DNA测序结果表明SARS-CoV的S 蛋白长度为1256 个氨基酸 ，S2蛋白约600个氨基酸。 S2包括三个螺旋结构（helix）和一个穿膜区（11971218

5、aa） S2的三个螺旋结构是介导病毒包膜与细胞融合（membrane fusion）的关键结构；而穿膜区则将S蛋白固定在病毒包膜上 S1与特异性受体的高亲和力结合并不能直接介导细胞融合，但却可有效地驱动S2介导的细胞融合反应。 如果能找到细胞/组织特异性的高亲和力结合肽，就有可能模仿或替代S1的功能，为S2介导的细胞融合反应提供动力，同时又可避免S1作为病毒抗原介导的免疫病理反应。利用噬菌体展示技术（phage display）筛选细胞/组织特异性的高亲和力结合肽 Fusion proteinPIIIphenotypegenotype 噬菌体展示技术的本质就是在一个单一的噬菌体粒子当中遗传基因

6、表型和蛋白表型的直接的对应关系 。 利用这种对应关系人们可以将各种自然界存在或不存在的DNA整合到噬菌体基因中，以重组蛋白的形式表达在噬菌体表面，从中筛选出人们所需的目的片断。 外源基因融合于噬菌体不同区段外壳蛋白基因的表达模式34轮筛选将噬菌体文库铺在固定的诱饵上洗脱未结合的噬菌体加入宿主菌，扩增和富集洗脱的噬菌体铺富集文库铺盘分离单个克隆验证结合实验3-4轮经典噬菌体展示技术筛选流程图实验流程实验流程基于基于SARS冠状病毒冠状病毒S蛋白介导细胞膜融合机蛋白介导细胞膜融合机制的生物仿真靶向输送系统的设计理念制的生物仿真靶向输送系统的设计理念实验流程实验流程评价蛋白定向输入功能评价蛋白定向输

7、入功能 该靶向输送系统中融合蛋白后接绿色荧光蛋白（green fluoresence protein，GFP），可在荧光显微镜下动态观察细胞内绿色荧光强度的变化，可用于研究这一系统携带外源蛋白特异性靶向进入细胞的能力。融合蛋白后接诱导细胞凋亡的蛋白或多肽，如MKK6(E)，检测A549 细胞的凋亡情况，用于研究这一系统携带凋亡诱导蛋白靶向导入肺癌细胞，从而杀灭肺癌细胞的能力。 近年来我国的肺癌发病率明显上升，在一些大中城市肺癌已占常见恶性肿瘤的首位。 生物靶向治疗已逐渐成为一种新的肿瘤治疗策略。本靶向输送系统，巧妙地利用了SARS-CoV特异性侵袭肺组织的分子进化机制，结合肿瘤靶向多肽和可诱导肺癌细胞凋亡的蛋白或多肽，靶向输送杀灭肿瘤细胞，具有良好的开发应用前景和实践意义。研究意义研究进展T载体中保存的S1，S2片段S1markerS2T-S1T-S2digestion(T-S1)digestion (T-S2)1500bp _ 2000bp _3000bp _4000bp _1000bp _750bp _研究进展pET-14b-S2质粒的构建质粒的构建markerS2pET-14b-S2digestion(pET-14b-S2)pET-14b Vector1500bp _2000b