最全的G418筛选稳定表达细胞系总结33页

1、Feynman_R 汇合度(confluence)也许是我们实验室的翻译，实际上就是指细胞占培养表面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%汇合，也就是汇合度100%。最近的一个实验是：3×106细胞电转后，我把电激杯中的细胞分别接种1/4000和1/1000和1/300到24孔板中，48小时后加g418筛选，这个时候接种了1/300细胞的孔会大约50%汇合，而理论上接种了1/4000细胞的孔会4%左右汇合，今天是筛选后第9天，观察到1/4000孔有两三个小克隆，按道理1/300孔会有20-30个克隆，但实际的情况是它们几乎全部死光了，仅有少数存活细胞！所以我认为汇合度

2、对g418筛选影响很大，这耽误了我将一个多月。jiangql 同意菊花与刀对你的建议。我的感觉G418筛选时间太长，到后来一般会对细胞生长有影响。以下是一些建议，供参考：首先需要扩增细胞，冻存部分中间产物细胞后，再做克隆化比较合适，否则一旦污染就会全军覆没。一般57天后G418就可以减半维持。勤换液，去除死细胞，可以减少对存活细胞的影响。血清浓度可以高到20，质量要好。 进行真核转染的一般程序：克隆目的基因（经测序验证）准备真核表达载体将目的基因插入表达载体中转染筛选鉴定下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。一、    &#

3、160;        试剂准备1、 HBS（Hepes-buffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。2、核酸贮存液，过滤除菌。3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。二、操作步骤（一）克隆目的基因1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5-端分别引入酶切位点BamH和Xho，行RT-PCR。2、回收特异性扩增片段，连入T载体。3、转化DH5，质粒制备。

4、4、酶切初步鉴定，测序证实。（二）      真核重组表达载体的构建：pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。重组质粒与pcDNA3分别用BamH和Xho双酶切回收插入片段和pcDNA3线性片段T4连接酶连接转化DH5质粒制备BamH和Xho双酶切鉴定。（三）重组pcDNA3转染SHG-44细胞： 1、 G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板G418 分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、

5、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。2、 在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。一般要求，6孔培养皿（35mm），每孔1-2ml培养基3×105细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。 典型贴壁细胞平板密度 培养板大小 生长面积（cm2） 大约细胞数 培养基容积（ml） 组织培养皿（60mm） 28 66×105 5-6 6孔培养板（35mm） 9.5 3×105 1-2 12孔培养板22.6

6、mm） 4 13×105 05-1 24孔培养板（8mm） 05 06×105 025-05 3、 SHG-44细胞的转染：(1)   转染当天，加入脂质体/ DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。(2)   准备不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。 溶液A：用HBS稀释DNA（pcDNA3、重组pcDNA3）各1.5g 到总体积50l（30g/ml）。溶液B：用HBS稀释6l脂质体到终容积50l（120g/ml）。混合溶液A和B，轻柔混合（不要振荡），室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。(3)   不要移去培养基，逐滴加入100l 脂质体/DNA混合物（从培养孔一边到另一边），边加边轻摇培养板。(4)   37孵育6hr。(5)   6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。(6)   转染24hr后施