生物技术---免疫学技术

1、o基本概念基本概念抗原（抗原（antigen）：）： 进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答，从进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质 分完全抗原和半抗原分完全抗原和半抗原抗体抗体(antibody)： 抗原刺激动物免疫系统，由免疫系统产生分泌的能和相抗原刺激动物免疫系统，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白第三章第三章o基本概念基本概念抗原的制备：颗粒抗原、半抗

2、原、人工抗原抗原的制备：颗粒抗原、半抗原、人工抗原抗体的制备：多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体抗体的制备：多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体第三章第三章抗原抗体反应抗原抗体反应o可对抗原或抗体进可对抗原或抗体进行定性、定量、定行定性、定量、定位的检测位的检测o抗体抗原以非共价抗体抗原以非共价键结合键结合o不可见反应：几秒不可见反应：几秒-几分钟几分钟 可见反应：数分钟可见反应：数分钟（小时、日）（小时、日）o影响因素影响因素 电解质电解质 温度温度 酸碱度酸碱度第三章第三章o酶联免疫法酶联免疫法o放射免疫法放射免疫法o荧光免疫法荧光免疫法o其他其他第三章第三章酶联免疫法（酶联免疫法（en

3、zyme immunoassay)o以酶标记抗体或抗原进行的抗体抗原反应以酶标记抗体或抗原进行的抗体抗原反应o酶结合物应具有双功能：酶结合物应具有双功能： 高度特异的免疫反应、生物催化放大作用高度特异的免疫反应、生物催化放大作用o基本方法基本方法 间接法间接法 双抗体夹心法双抗体夹心法 竞争法竞争法o生物素生物素-亲和素系统（亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）o某些新进展某些新进展酶联免疫吸附酶联免疫吸附（enzyme linked enzyme linked immunosorbentimmunosorbent assay assay）o间接法间接法1、将已知可溶

4、性抗原吸附于载体、将已知可溶性抗原吸附于载体2、温育后清洗、温育后清洗3、加入可能含特异性抗体的待检液、加入可能含特异性抗体的待检液4、温育后清洗、温育后清洗5、加入酶标记的二抗、加入酶标记的二抗6、温育后清洗、温育后清洗7、加入酶作用底物、加入酶作用底物8、测定反应颜色深浅、测定反应颜色深浅o双抗体夹心法双抗体夹心法1、将已知抗体吸附于载体上、将已知抗体吸附于载体上2、温育后清洗、温育后清洗3、加入可能含特异性抗原的待检液、加入可能含特异性抗原的待检液4、温育后清洗、温育后清洗5、加入酶标记特异性抗体、加入酶标记特异性抗体6、温育后清洗、温育后清洗7、加入酶作用底物、加入酶作用底物8、测定颜

5、色反应深浅、测定颜色反应深浅酶联免疫吸附酶联免疫吸附（enzyme linked enzyme linked immunosorbentimmunosorbent assay assay）o竞争法竞争法1、将已知抗体吸附于载体上、将已知抗体吸附于载体上2、温育后清洗、温育后清洗3、加入可能含特异性抗原的待检液、加入可能含特异性抗原的待检液和酶标记的已知抗原液和酶标记的已知抗原液4、温育后清洗、温育后清洗5、加入酶作用底物、加入酶作用底物6、测定颜色反应深浅、测定颜色反应深浅酶联免疫吸附酶联免疫吸附（enzyme linked enzyme linked immunosorbentimmunos

6、orbent assay assay）o生物素生物素-亲和素系统（亲和素系统（biotin-avidin system）o基本概念基本概念 生物素：是一种维生素生物素：是一种维生素H，经活化后，可与抗体、抗原、酶以多，经活化后，可与抗体、抗原、酶以多 配一的方式共价结合，且不影响它们的活性配一的方式共价结合，且不影响它们的活性 亲和素：从卵蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，可与酶偶合，以亲和素：从卵蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，可与酶偶合，以1配多的方式对生物素有很强的亲和力配多的方式对生物素有很强的亲和力oBAS用于检测的基本方法：用于检测的基本方法： BAB法或法或BRAB法法 BA法法 ABC法

7、法酶联免疫吸附酶联免疫吸附（enzyme linked enzyme linked immunosorbentimmunosorbent assay assay）酶联免疫吸附酶联免疫吸附（enzyme linked enzyme linked immunosorbentimmunosorbent assay assay）o均相酶免疫测定法均相酶免疫测定法 无需无需“固定在载体固定在载体上上”；无需；无需“温育后温育后清洗清洗”o斑点免疫结合试验斑点免疫结合试验 以微孔薄膜为载体，以微孔薄膜为载体，酶免疫反应阳性结果酶免疫反应阳性结果在膜上出现色斑点在膜上出现色斑点 胶体金标记较酶标记胶体金标记

8、较酶标记更为简便更为简便酶联免疫吸附酶联免疫吸附（enzyme linked enzyme linked immunosorbentimmunosorbent assay assay）猪肉和尿液盐酸克伦特罗的猪肉和尿液盐酸克伦特罗的免疫胶体金法快速检测免疫胶体金法快速检测瘦肉精中毒事件瘦肉精中毒事件l20002000年以来，内地相继发生年以来，内地相继发生1818起瘦肉精中毒事件，中毒人数达起瘦肉精中毒事件，中毒人数达17001700多人，死亡多人，死亡1 1人（不包括上海人（不包括上海20062006年集体中毒事件）年集体中毒事件）l瘦肉精残留及危害不容忽视，瘦肉精替代品暗潮涌动瘦肉精残留及

9、危害不容忽视，瘦肉精替代品暗潮涌动l上海上海9.139.13瘦肉精食物中毒事件（瘦肉精食物中毒事件（20062006年）年）l “ “瘦肉精瘦肉精”学名为盐酸克伦特罗，医学上又称克喘素，常用于治疗哮学名为盐酸克伦特罗，医学上又称克喘素，常用于治疗哮喘。喘。l 由于盐酸克伦特罗添加于饲料饲喂动物后可明显促进动物生长由于盐酸克伦特罗添加于饲料饲喂动物后可明显促进动物生长, ,提高提高 瘦肉率瘦肉率, , 所以养殖户称其为所以养殖户称其为“瘦肉精瘦肉精”，曾在国内外广泛用于动物饲，曾在国内外广泛用于动物饲养养l 生猪食用瘦肉精后皮毛光亮，呼吸急促，个别会出现腿抽搐，站不生猪食用瘦肉精后皮毛光亮，呼吸

10、急促，个别会出现腿抽搐，站不 稳，爬坡困难；宰后猪的肌肉特别鲜红，后臀肌肉饱满，肥肉非常薄稳，爬坡困难；宰后猪的肌肉特别鲜红，后臀肌肉饱满，肥肉非常薄瘦肉精介绍瘦肉精介绍瘦肉精介绍瘦肉精介绍l “瘦肉精瘦肉精”化学性质特别稳定，加热到化学性质特别稳定，加热到170时才能被分解，故一时才能被分解，故一般家庭厨房加热不能将其分解破坏般家庭厨房加热不能将其分解破坏l 食用后在胃肠道吸收快，作用维持时间持久。中毒后主要症状表食用后在胃肠道吸收快，作用维持时间持久。中毒后主要症状表现为头疼、头晕、心悸、心慌、面色潮红、四肢发抖等症状现为头疼、头晕、心悸、心慌、面色潮红、四肢发抖等症状l 违法者使用该物质

11、以提高猪的瘦肉率和颜色鲜艳程度，不知情的违法者使用该物质以提高猪的瘦肉率和颜色鲜艳程度，不知情的市民市民 错误地认为这样的肉才是错误地认为这样的肉才是“好肉好肉”而特别喜欢选购而特别喜欢选购l 食品卫生法食品卫生法l食品添加剂卫生管理办法食品添加剂卫生管理办法（GB2760）l动物性食品中兽药残留最高限量动物性食品中兽药残留最高限量（农业部公告第（农业部公告第235号，号， 2002年年12月月24日）规定：禁用药物，动物性食品中不得检出：日）规定：禁用药物，动物性食品中不得检出： 瘦肉精、沙丁胺醇、西马特罗等瘦肉精、沙丁胺醇、西马特罗等31种种l 违法者的法律责任：民事赔偿、行政处罚、刑事处

12、罚违法者的法律责任：民事赔偿、行政处罚、刑事处罚法律规定法律规定盐酸克伦特罗残留检测方法盐酸克伦特罗残留检测方法 l 动物性食品中克伦特罗残留量的测定动物性食品中克伦特罗残留量的测定 （GB5009.192-2003） 第一法：气相色谱第一法：气相色谱质谱法，检出限：质谱法，检出限：0.5ppb 第二法：高效液相色谱法，检出限：第二法：高效液相色谱法，检出限：0.5ppb 第三法：酶联免疫法（第三法：酶联免疫法（ELISA筛选法）筛选法） ，检出限：，检出限：0.5ppb l 动物组织中盐酸克伦特罗的测定动物组织中盐酸克伦特罗的测定气相色谱气相色谱/质谱法质谱法 （NY/T 4682006），

13、检出限：），检出限：2.0ppbl 动物尿液中盐酸克伦特罗的测定动物尿液中盐酸克伦特罗的测定气相色谱气相色谱/质谱法质谱法 （NY/XQ 4212003），检出限：），检出限：1.0ppbl 尿液中盐酸克仑特罗的测定胶体金免疫层析法尿液中盐酸克仑特罗的测定胶体金免疫层析法 （NY/T933-2005），检出限：），检出限：3.0ppb 猪肉全程监控中瘦肉精检测方法的选择猪肉全程监控中瘦肉精检测方法的选择生猪饲养生猪饲养屠宰场屠宰场大型批发市场大型批发市场零售市场零售市场饲料检测饲料检测猪尿检测猪尿检测猪尿检测猪尿检测猪肉检测猪肉检测猪肉猪肉检测检测猪肉猪肉检测检测酶联免疫法酶联免疫法免疫胶体金

14、免疫胶体金免疫胶体金免疫胶体金酶联免疫法酶联免疫法免疫胶体金免疫胶体金筛检阳性筛检阳性GC-MSGC-MS确认确认大型仪器确认大型仪器确认政府部门政府部门监督抽检监督抽检GC-MS餐饮业餐饮业猪肉猪肉检测检测免疫胶体金免疫胶体金销毁和溯源销毁和溯源阳性阳性GC-MSGC-MS确认确认大型仪器确认大型仪器确认阳性阳性免疫胶体金快速检测板的外观图免疫胶体金快速检测板的外观图 免疫胶体金快速检测板免疫胶体金快速检测板(试剂试剂)的结构图的结构图检测原理检测原理l盐酸克伦特罗快速检测试剂板的中央膜面上固定有两条隐形线，克盐酸克伦特罗快速检测试剂板的中央膜面上固定有两条隐形线，克伦特罗抗原固定在测试区作

15、为检测线（伦特罗抗原固定在测试区作为检测线（T T线），二抗固定在质控区线），二抗固定在质控区作为对照线（作为对照线（C C线）。线）。l当待检样品溶液滴入试剂板加样孔后，样品溶液因层析作用往上扩当待检样品溶液滴入试剂板加样孔后，样品溶液因层析作用往上扩散。如果样品溶液含有相应药物的残留，药物将和胶体金颗粒上的散。如果样品溶液含有相应药物的残留，药物将和胶体金颗粒上的抗体先行反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至抗体先行反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至T T线时，胶体线时，胶体金颗粒上抗体活性位点将因被样品溶液中的药物占据而无法与金颗粒上抗体活性位点将因被样品溶液中的药物占据而无法与T

16、T线线上药物抗原结合；所以当样品中盐酸克伦特罗含量上药物抗原结合；所以当样品中盐酸克伦特罗含量1ppb(1ppb(检测限检测限) )以以上时，试剂板上的上时，试剂板上的T T线将较线将较C C线显色淡或甚至无显色，判定为阳性。线显色淡或甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中盐酸克伦特罗含量在反之，当样品中盐酸克伦特罗含量在1ppb1ppb以下或无残留时，试剂板以下或无残留时，试剂板上的上的T T线显色与线显色与C C线相近或偏深，判定为阴性线相近或偏深，判定为阴性l灵敏度灵敏度 肉样或组织样：肉样或组织样：1ppb(1ppb(标准前处理标准前处理) )或或5ppb5ppb（简单前处理）（简单前

17、处理） 尿样：尿样： 1ppb(1ppb(标准前处理标准前处理) )l特异性：与沙丁胺醇等苯乙胺类药物没有交叉反应；特异性：与沙丁胺醇等苯乙胺类药物没有交叉反应；l准确性：与瘦肉精准确性：与瘦肉精ELISAELISA试剂盒的检测结果试剂盒的检测结果符合率符合率9090l有效期：半年（冷藏闭光保存）有效期：半年（冷藏闭光保存）胶体金免疫层析法检测瘦肉精的技术指标胶体金免疫层析法检测瘦肉精的技术指标操作步骤操作步骤 于于5ml5ml离心管中加入离心管中加入5g5g左右剪碎或是高速匀左右剪碎或是高速匀浆过的猪肉组织样，盖紧管盖浆过的猪肉组织样，盖紧管盖 1 将将装有样品的离心管在装有样品的离心管在90以上水浴锅中以上水浴锅中加热加热10 分钟分钟 加热完成后取出冷却至室温；可以明显看加热完成后取出冷却至室温；可以明显看到底部有溶液渗出到底部有