蛋白质和氨基酸测定学时资料

1、会计学1蛋白质和氨基酸测定学时资料蛋白质和氨基酸测定学时资料蛋白质含量低大头娃娃蛋白质含量低大头娃娃蛋白质含量蛋白质含量“高高”，肾结石，肾结石为何测定蛋白质为何测定蛋白质1 1、重要的营养物质、重要的营养物质 婴幼儿配方乳粉婴幼儿配方乳粉:蛋白质蛋白质18%18%； （GB10765-1997GB10765-1997） 婴幼儿配方乳粉婴幼儿配方乳粉、 : :蛋白质蛋白质12-18%12-18%； （GB10766-GB10766-19971997） 2椰子汁中蛋白加热沉淀椰子汁中蛋白加热沉淀黄酒贮藏中的沉淀大黄酒贮藏中的沉淀大部分为蛋白质部分为蛋白质2 2、影响食品色、香、味及结构、影响食品

2、色、香、味及结构面筋蛋白：面包粉面筋蛋白：面包粉33%；蛋糕粉；蛋糕粉: 22%馒馒头粉头粉25%-30%（ SB/T-93 ）3第一节第一节 蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定 定量方法：凯氏定氮法及分光光度法。定量方法：凯氏定氮法及分光光度法。一、凯氏定氮法一、凯氏定氮法 奶粉中测得氮含量为奶粉中测得氮含量为2.12%,2.12%,蛋白质含氮为蛋白质含氮为16%16%，奶粉中蛋白质含量，奶粉中蛋白质含量? ? 换算系数通常换算系数通常6.256.25，牛乳及制品为，牛乳及制品为6.386.38，大，大豆及制品为豆及制品为5.715.71等。等。4脱水性：将脱水性：将H H、O O按按2 2：

3、1 1比例脱去，剩下比例脱去，剩下C C、N N氧化性：氧化性： 2H2H2 2SOSO4 4 + C + C 2SO2SO2 2+ 2H+ 2H2 2O + COO + CO2 2 3SO 3SO2 2+2N +3H+2N +3H2 2O=3SOO=3SO3 3 +2NH +2NH3 3H2SO4 酸性：酸性： H H2 2SOSO4 4 +2NH +2NH3 3= (NH= (NH4 4) )2 2SOSO4 4 丹麦化学家丹麦化学家Johan Kjeldahl（1883）发明的，当时只用）发明的，当时只用H2SO4分解试样分解试样，需长时间，后来，需长时间，后来Gunning改进，在消化

4、时加入改进，在消化时加入K2SO4使沸点上升从而加快使沸点上升从而加快分解速度。后来分解速度。后来51 1、原理、原理 样品与硫酸、催化剂加热消化，蛋白质分解样品与硫酸、催化剂加热消化，蛋白质分解，其中的，其中的C C、H H氧化为氧化为COCO2 2和和H H2 2O O蒸汽逸出，而氮转蒸汽逸出，而氮转化为氨，与硫酸结合成硫酸铵，加碱蒸馏，使氨化为氨，与硫酸结合成硫酸铵，加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后以盐酸滴定。蒸出，用硼酸吸收后以盐酸滴定。硫酸钾之目的：提高沸点，加快有机物分解；硫酸钾之目的：提高沸点，加快有机物分解；硫酸铜之目的：催化剂、消化终点的指示剂硫酸铜之目的：催化剂、消化终点的

5、指示剂（CuSOCuSO4 4蓝绿色如果没消化完全，则为蓝绿色如果没消化完全，则为CuCu2 2SOSO4 4）、）、蒸馏前加入碱量合适否的蒸馏前加入碱量合适否的指示剂。指示剂。2CuSO2CuSO4 4+C=+C=Cu2SO4+SO2+CO2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+SO2+2H2O67常量凯氏定氮常量凯氏定氮微量凯氏定氮微量凯氏定氮改良微量凯氏定氮改良微量凯氏定氮8A A、蒸馏完全判断、蒸馏完全判断 经验时间：经验时间：常量凯氏定氮约常量凯氏定氮约30min30min，微量定，微量定氮装置中是指示剂变色后，再蒸馏氮装置中是指示剂变色后，再蒸馏10min10min，提离，提

6、离液面，再蒸馏液面，再蒸馏1min1min； 萘氏试剂遇氨气呈红棕色。萘氏试剂遇氨气呈红棕色。 配制：配制：3.5gKI+1.3gHgCl3.5gKI+1.3gHgCl2 2 溶于溶于70ml70ml水，加水，加4mol/lNaOH 30ml4mol/lNaOH 30ml。B B、吸收、吸收 用用2%2%或或4%4%硼酸作为吸收液，应注意接收管浸硼酸作为吸收液，应注意接收管浸没在吸收液中。没在吸收液中。C C、常量、半微量、微量概念、常量、半微量、微量概念9常量：常量：0.1g0.1g，10mL10mL；半微量：半微量：0.01g-0.1g 0.01g-0.1g ， 1mL-10mL 1mL-

7、10mL ；微量：微量：0.1mg-10mg0.1mg-10mg，0.01mL-1mL0.01mL-1mL。 eg:eg:称样称样0.85g,0.85g,消化后，直接蒸馏，取出消消化后，直接蒸馏，取出消化液，定容至化液，定容至100mL100mL，取其中的，取其中的10mL10mL蒸馏蒸馏常量凯氏定氮常量凯氏定氮改良微量凯氏定氮改良微量凯氏定氮10（3 3）滴定）滴定 (NH(NH4 4) )2 2B B4 4O O7 7+HCl+H+HCl+H2 200NH4Cl+H3BO3 用盐酸标准溶液滴定吸收有氨气的硼酸液。用盐酸标准溶液滴定吸收有氨气的硼酸液。 指示剂：指示剂：0.1%0.1%甲基红

8、甲基红+0.1%+0.1%溴甲酚绿溴甲酚绿终点判定终点判定 2%2%硼酸溶液，蓝绿色硼酸溶液，蓝绿色灰色灰色 4%4%硼酸溶液，蓝绿色硼酸溶液，蓝绿色酒红色酒红色 主要与混合指示剂的变色范围有关：主要与混合指示剂的变色范围有关： pHpH4.04.0红色红色 =5.1=5.1灰色灰色 6.26.2绿色绿色 11n样品中被恶意添加硫酸铵、氯样品中被恶意添加硫酸铵、氯化铵，？化铵，？n样品中被恶意添加硝酸铵，？样品中被恶意添加硝酸铵，？n样品中被恶意添加碳酸铵，？样品中被恶意添加碳酸铵，？n样品中被恶意添加尿素、三聚样品中被恶意添加尿素、三聚氰胺，？氰胺，？N含量含量66.67%12策略一：策略一

9、：甲醛法测定样品消化前铵盐含量甲醛法测定样品消化前铵盐含量 4 4NHNH4 4+ + 6HCHO =(CH+ 6HCHO =(CH2 2）6 6N N4 4 H+ + 3H + 3H+ + + 6H+ 6H2 2O O 六次甲基四胺（弱碱，六次甲基四胺（弱碱，pH8.7pH8.7） (NH4+是极弱的酸，不能直接用是极弱的酸，不能直接用NaOH滴定）滴定）过程过程 ：样品样品+适量蒸馏水适量蒸馏水NaOH中和游离酸（中和游离酸（甲基红指示剂，红色变橙色，甲基红指示剂，红色变橙色，pH为为4.46.2 ）加入甲醛加入甲醛充分摇匀充分摇匀, 静置静置5min用用NaOH标标准溶液进行滴定（酚酞指

10、示剂，准溶液进行滴定（酚酞指示剂，pH为为8.09.6 ）13注意：注意：A、中和游离酸时只能用甲基红指示剂，如果甲、中和游离酸时只能用甲基红指示剂，如果甲醛中有甲酸，宜用醛中有甲酸，宜用NaOH先中和，此时指示剂先中和，此时指示剂用酚酞。用酚酞。B、但要注意，甲醛也能和氨基酸发生反应，且、但要注意，甲醛也能和氨基酸发生反应，且能使酸性相对凸显。能使酸性相对凸显。C、碳酸铵不能碳酸铵不能用这种方法测定，因为生产的碳用这种方法测定，因为生产的碳酸为弱酸，不能用酸为弱酸，不能用NaOH滴定，况且滴定，况且CO2会挥发会挥发。D、硝酸铵中、硝酸铵中NO3-中的中的N不能被直接测出，但可不能被直接测出

11、，但可以通过分子式中的定量关系求出。以通过分子式中的定量关系求出。1415策略三：策略三：非蛋白质有机物物中的非蛋白质有机物物中的N，改用别的方法来测，改用别的方法来测定蛋白质或别的方法测定恶意添加物。定蛋白质或别的方法测定恶意添加物。 三聚氰胺检测（三聚氰胺检测（GB/T22388-2008GB/T22388-2008）HPLCHPLC（高效液相色谱法）、（高效液相色谱法）、HPLC-MCHPLC-MC、GC-MSGC-MSHPLCHPLCA A、提取、提取 超声波及振荡下，三氯乙酸、乙腈混合提取，三氯乙酸沉淀超声波及振荡下，三氯乙酸、乙腈混合提取，三氯乙酸沉淀蛋白，离心除杂。蛋白，离心除杂

12、。B、净化净化 阳离子固相萃取柱，用水、阳离子固相萃取柱，用水、甲醇洗脱除杂，氨化乙醇洗脱，甲醇洗脱除杂，氨化乙醇洗脱，收集洗脱液，备用。收集洗脱液，备用。16C、测定、测定 C8或或C18柱柱 流动相：柠檬酸、辛烷磺酸钠、乙腈组成流动相：柠檬酸、辛烷磺酸钠、乙腈组成 流速流速1mL/min，柱温，柱温40，进样量，进样量20L 波长波长240nm 。17方法方法原理原理紫外吸收法紫外吸收法蛋白质在蛋白质在280nm280nm处有吸收。处有吸收。 考马斯亮蓝比色法考马斯亮蓝比色法考马斯亮蓝使蛋白质染色，在考马斯亮蓝使蛋白质染色，在620nm620nm处有最大吸收（处有最大吸收（标标准物质：牛血

13、清蛋白准物质：牛血清蛋白bovine serum albuminbovine serum albumin）。）。双缩脲法双缩脲法 双缩脲与碱性铜生成紫红色配合物，在双缩脲与碱性铜生成紫红色配合物，在560nm560nm处有最大吸收。（备注处有最大吸收。（备注1 1）lowrylowry法法 蛋白质蛋白质- -铜络合物中的酪氨酸及色氨酸残铜络合物中的酪氨酸及色氨酸残基使磷钼酸基使磷钼酸- -磷钨酸（磷钨酸（FolinFolin phenol phenol reagentreagent）还原成蓝色物质。（备注）还原成蓝色物质。（备注2 2）18备注备注1：19双缩脲法双缩脲法备注备注2：（1）lo

14、wrylowry法的原理法的原理 色泽的变化主要缘于色泽的变化主要缘于钼、钨化学价的降低钼、钨化学价的降低，该物质，该物质的吸收波长在的吸收波长在550-750nm之间，当蛋白质浓度在之间，当蛋白质浓度在1-100g/ml时，用时，用750nm或或660nm，当蛋白质含量更高，当蛋白质含量更高时，用时，用550nm。 没有铜离子时，色泽由蛋白质中的没有铜离子时，色泽由蛋白质中的酪氨酸及色氨酸酪氨酸及色氨酸残基含量决定，其次是半胱氨酸和组氨酸残基含量决定残基含量决定，其次是半胱氨酸和组氨酸残基含量决定，铜离子将肽键聚合在一起，从而，铜离子将肽键聚合在一起，从而加速加速了电子的传递。了电子的传递。

15、 干扰物质较多干扰物质较多：柠檬酸，柠檬酸，tris，甘氨酸，组氨酸，谷氨酸，甘氨酸，组氨酸，谷氨酸，EDTA，葡萄糖，果糖，高浓度的尿素，硫酸铵等都有影响，葡萄糖，果糖，高浓度的尿素，硫酸铵等都有影响。20（2）试剂组成（）试剂组成（/hansen/protocols/lowry.htm）Lowry A: 2% Na2CO3 in 0.1 M NaOH Lowry B: 1% CuSO4 in diH2O Lowry C: 2% sodium potassium tartrate (NaKC4H4O6 4H2O) Lowry stock rea

16、gent 49 ml Lowry A 0.5 ml Lowry B 0.5 ml Lowry C Folins Reagent: Phenol reagent - 2N (Folin - Ciocalteau reagent) 主要成分为：主要成分为：3H2OP2O513WO35MoO310H2O 3H2OxP2O514WO34MoO310H2O（ /wiki/Folin%E2%80%93Ciocalteu_reagent ） Folin phenol试剂还可以测定酚类物质的含量试剂还可以测定酚类物质的含量（郑郑鸿元鸿元 许光辉许光辉 李凤珍等李凤珍

17、等 .土壤微生物分析方法手册土壤微生物分析方法手册. 中国农业出版社，中国农业出版社，1986.）21（3）该法的历史）该法的历史 吴宪博士吴宪博士（18931959年）是国际著名生物化学家、中国近代生物化学事业的开拓者和奠基人于于1922年发现年发现Folin phenol reagent能测定蛋白质能测定蛋白质 (Wu, H. (1922) J. Biol. Chem. 51, 3339) 。 Lowry发现，在此前，先让蛋白质与铜发生发现，在此前，先让蛋白质与铜发生发生络合反应（双缩脲法发生络合反应（双缩脲法 ），能提高反应的灵敏），能提高反应的灵敏度度(Lowry, O. H., Ro

18、sebrough, N. J., Farr, A. L. and Randall, R. J.(1951) J. Biol. Chem. 193, 265275）。）。222324一、甲醛滴定法一、甲醛滴定法1 1、原理、原理 酸性的酸性的-COOH-COOH，碱性的，碱性的-NH-NH2 2，使氨基酸成为中，使氨基酸成为中性的内盐，加入甲醛溶液时，性的内盐，加入甲醛溶液时，-NH-NH2 2与甲醛结合，与甲醛结合，其碱性消失，用碱滴定其碱性消失，用碱滴定-COOH-COOH基，以间接方法测基，以间接方法测定氨基酸的量。定氨基酸的量。2 2、大约过程、大约过程 加碱中和酸（加碱中和酸（pH 8

19、.2）、加入甲醛，加碱滴）、加入甲醛，加碱滴定。当加入甲醛后，溶液的定。当加入甲醛后，溶液的pHpH值还在值还在8.28.2吗？当吗？当样品中存在样品中存在4 4+ +时时, , 则测定结果偏大偏小？如则测定结果偏大偏小？如何排除这种影响？何排除这种影响？254NH4+ 6HCHO =(CH2）6N4 H+ + 3H+ + 6H2O261、茚三酮法、茚三酮法氨基酸与茚三酮生成氨基酸与茚三酮生成蓝紫色蓝紫色化合物二酮茚胺，该物在化合物二酮茚胺，该物在570nm有最大吸收（但脯氨酸和羟脯氨酸由于有最大吸收（但脯氨酸和羟脯氨酸由于氨基被氨基被取代，生成物显黄色取代，生成物显黄色440nm有最大吸收）

20、。有最大吸收）。27 茚三酮反应的适宜茚三酮反应的适宜pH为为5-7 所有所有-氨基酸和蛋白质氨基酸和蛋白质都有此反应，但有此反应都有此反应，但有此反应的不一定都是的不一定都是-氨基酸和蛋白质，比如氨基酸和蛋白质，比如-丙氨酸、氨丙氨酸、氨、许多一级胺与茚三酮都呈阳性、许多一级胺与茚三酮都呈阳性。（。（郑继平，汤华，陈银华郑继平，汤华，陈银华 .现代生物学实验指导现代生物学实验指导. 中国农业出版社，中国农业出版社，2007.）但色泽不一定一样但色泽不一定一样，比如，比如，-氨基酸呈黄色，苯胺橙红色。（氨基酸呈黄色，苯胺橙红色。（杨桂法等杨桂法等. 有机有机化学分析化学分析. 湖南大学出版社，

21、湖南大学出版社，1996. ）28 但课本但课本P140所谈及的及所谈及的及GB/T 8314-2002茶游离氨茶游离氨基酸总量测定时：基酸总量测定时：-氨基酸在氨基酸在pH8.0的条件的条件下与茚三酮下与茚三酮共热，形成紫色络合物，用分光光度法在特定的波长下共热，形成紫色络合物，用分光光度法在特定的波长下测定其含量。测定其含量。 茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化，使用前用活性炭吸附被氧化物而纯化。，使用前用活性炭吸附被氧化物而纯化。292、邻苯二甲醛法（、邻苯二甲醛法（O-Phthalic aldehyde ,OPT)邻苯二甲醛在邻苯二

22、甲醛在2-巯基乙醇存在下，碱性溶液中，与氨巯基乙醇存在下，碱性溶液中，与氨基酸产生荧光物质，激发光波长为基酸产生荧光物质，激发光波长为340nm，发射光波，发射光波长为长为455nm。n灵敏度比茚三酮高，但荧光强度与氨基酸种类有关，灵敏度比茚三酮高，但荧光强度与氨基酸种类有关，对半胱氨酸、胱氨酸和赖氨酸等的荧光值偏低，和对半胱氨酸、胱氨酸和赖氨酸等的荧光值偏低，和脯脯氨酸和羟脯氨酸不反应，尿素、尿酸及氨等不发生类氨酸和羟脯氨酸不反应，尿素、尿酸及氨等不发生类似反应似反应。303、三硝基苯磺酸法（、三硝基苯磺酸法（TriNitroBenzene Sulfonic acid ）31n与茚三酮相比：

23、灵敏度相当，且与茚三酮相比：灵敏度相当，且不受不受NH4+的影响，但的影响，但不能与不能与Pro反应，可以和反应，可以和Cys的的-SH反应，为此，反应，为此，TNBS前，碱性条件下前，碱性条件下30保温数小时，使保温数小时，使-SH都氧化成都氧化成-S-S-后，再测定。后，再测定。n碱性条件下测定的优势是可以用碱性条件下测定的优势是可以用420nm，在可见光范，在可见光范围内，劣势是每种氨基酸的消光系数不同；酸性条件下围内，劣势是每种氨基酸的消光系数不同；酸性条件下的优势是每种氨基酸的消光系数同，但需紫外光。的优势是每种氨基酸的消光系数同，但需紫外光。324、丹磺酰氯法（、丹磺酰氯法（dan

24、syl chloride）丹磺酰氯是丹磺酰氯是5-二甲基氨基萘二甲基氨基萘-1-磺酰氯（磺酰氯（5-dimethylaminonaphthalene-1 -sulfonyl chloride）的）的简称。丹磺酰氯与氨基酸反应生成荧光性质强和稳定的简称。丹磺酰氯与氨基酸反应生成荧光性质强和稳定的磺胺衍生物磺胺衍生物(激发波长激发波长298nm，发射波长，发射波长546nm），也），也常用于多肽链的常用于多肽链的N末端氨基酸的鉴定。末端氨基酸的鉴定。335、 2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB）法）法DNFB也叫做也叫做Sanger试剂，试

25、剂，DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitro phenyl amino acid, DNP氨基酸）氨基酸）34351.0 mL 的的0.2 mol/L NaHCO3,1.0 mL 的的 1% DNFB (1.0mL 溶溶解在解在100mL的的1,4-dioxane) ，1.0 mL 样品液样品液, 黑暗处黑暗处60 ，40min, 加入加入0.5 mL of 1 mol/L HCl终止反应，加入终止反应，加入5mL乙酸乙乙酸乙酯萃取，静置酯萃取，静置10min,420nm测定，

26、氨基酸浓度测定，氨基酸浓度0.021.00 mg/mL有良好的线性关系有良好的线性关系（Lin Chen，et al. A novel colorimetric determination of free amino acids content in tea infusions with 2,4-dinitrofluorobenzene. Journal of Food Composition and Analysis 22 (2009) 137141）。）。方法方法灵敏度灵敏度脯氨酸、羟脯氨酸脯氨酸、羟脯氨酸受氨的影响受氨的影响茚三酮茚三酮能反应能反应有影响有影响邻苯二甲醛邻苯二甲醛比茚三酮

27、高比茚三酮高不反应不反应不影响不影响三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸与茚三酮同与茚三酮同不反应不反应不影响不影响丹磺酰氯丹磺酰氯比茚三酮高比茚三酮高反应反应未知未知2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯比茚三酮高比茚三酮高反应反应未知未知几种比色法的比较几种比色法的比较36第五节第五节 氨基酸分离及测定氨基酸分离及测定一、蛋白质的水解一、蛋白质的水解n酸水解：酸水解：5.7mol/L盐酸，密封的水解管中，盐酸，密封的水解管中，105-115水解水解20h以上。盐酸水解后，以上。盐酸水解后，色氨酸全部被破坏色氨酸全部被破坏。n碱水解：碱水解：5mol/L NaOH，充氮气后填充管，充氮气后填充管，110水解水解2

28、2h，测定时，用测定时，用6mol/L盐酸中和至盐酸中和至pH6-7后测定，碱水解时，多数氨后测定，碱水解时，多数氨基酸破坏，基酸破坏，仅色氨酸稳定，仅色氨酸稳定，因此专用于色氨酸的测定。因此专用于色氨酸的测定。n磺酸水解：磺酸水解：4mol/L甲基磺酸，并加入色氨酸保护剂，水解后甲基磺酸，并加入色氨酸保护剂，水解后，用，用3.5mol/L NaOH中和至中性，可以测定中和至中性，可以测定除半胱氨酸以外的除半胱氨酸以外的所有氨基酸。所有氨基酸。n酶解：酶解：保持所有的氨基酸不被破坏，但水解不全，且酶本身也保持所有的氨基酸不被破坏，但水解不全，且酶本身也是蛋白质，对测定有干扰。是蛋白质，对测定有

29、干扰。（颜真（颜真. 蛋白质研究技术蛋白质研究技术. 西安：第四军医大学出版社，西安：第四军医大学出版社，2007）37二、氨基酸的薄层层析法二、氨基酸的薄层层析法、原理、原理制备样品，点其于薄层板，双向上行法展开制备样品，点其于薄层板，双向上行法展开，组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交，组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，氨基酸得到分离。后用茚三酮显色，换等作用，氨基酸得到分离。后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，通过比移值（与标准氨基酸进行对比，通过比移值（）定）定性，斑点颜色深浅大致定量。性，斑点颜色深浅大致定量。38、过程、过程（）薄层板制备（）薄层板制备吸附层析

30、吸附层析: :如硅胶、氧化铝、聚酰胺等（固定如硅胶、氧化铝、聚酰胺等（固定相：这些物质）；相：这些物质）；分配层析分配层析: :纤维素、硅藻土等（纤维素、硅藻土等（固定相：水）；固定相：水）；离子交换层析离子交换层析: :支持剂是离子交换支持剂是离子交换剂。剂。（）样品液制备（）样品液制备游离氨基酸提取：游离氨基酸提取：水浸液，加乙醇沉淀除去水浸液，加乙醇沉淀除去蛋白质、多糖等杂质，离子交换树脂净化。蛋白质、多糖等杂质，离子交换树脂净化。酸水解法：酸水解法：蛋白质样品，加入盐酸水解。蛋白质样品，加入盐酸水解。（）点样、展开、显色。（）点样、展开、显色。39标准标准1标准标准2标准标准3样液样液

31、abRf=b/a40三、氨基酸自动分析仪三、氨基酸自动分析仪利用各种氨基酸的酸碱性、极性、相对分子利用各种氨基酸的酸碱性、极性、相对分子量不同等性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上量不同等性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。通常先出来的为酸性氨基酸和极性较进行分离。通常先出来的为酸性氨基酸和极性较大的氨基酸，其次是非极性的芳香族氨基酸，最大的氨基酸，其次是非极性的芳香族氨基酸，最后是碱性氨基酸，分子量小的先洗脱下来，洗脱后是碱性氨基酸，分子量小的先洗脱下来，洗脱下的氨基酸通过茚三酮显色，从而定量各种氨基下的氨基酸通过茚三酮显色，从而定量各种氨基酸。酸。 4142第一节第一节 蛋白质的定量

32、测定蛋白质的定量测定 定量方法：凯氏定氮法及分光光度法。定量方法：凯氏定氮法及分光光度法。一、凯氏定氮法一、凯氏定氮法 奶粉中测得氮含量为奶粉中测得氮含量为2.12%,2.12%,蛋白质含氮为蛋白质含氮为16%16%，奶粉中蛋白质含量，奶粉中蛋白质含量? ? 换算系数通常换算系数通常6.256.25，牛乳及制品为，牛乳及制品为6.386.38，大，大豆及制品为豆及制品为5.715.71等。等。43注意：注意：A、中和游离酸时只能用甲基红指示剂，如果甲、中和游离酸时只能用甲基红指示剂，如果甲醛中有甲酸，宜用醛中有甲酸，宜用NaOH先中和，此时指示剂先中和，此时指示剂用酚酞。用酚酞。B、但要注意，

33、甲醛也能和氨基酸发生反应，且、但要注意，甲醛也能和氨基酸发生反应，且能使酸性相对凸显。能使酸性相对凸显。C、碳酸铵不能碳酸铵不能用这种方法测定，因为生产的碳用这种方法测定，因为生产的碳酸为弱酸，不能用酸为弱酸，不能用NaOH滴定，况且滴定，况且CO2会挥发会挥发。D、硝酸铵中、硝酸铵中NO3-中的中的N不能被直接测出，但可不能被直接测出，但可以通过分子式中的定量关系求出。以通过分子式中的定量关系求出。4445C、测定、测定 C8或或C18柱柱 流动相：柠檬酸、辛烷磺酸钠、乙腈组成流动相：柠檬酸、辛烷磺酸钠、乙腈组成 流速流速1mL/min，柱温，柱温40，进样量，进样量20L 波长波长240nm 。46（2）试剂组成（）试剂组成（http:/www.a