蛋白质结构与功能徐伟

1、会计学1蛋白质结构与功能徐伟蛋白质结构与功能徐伟噬菌体2012-1感染细胞宿主染色体退化，短PhuZ微管丝出现最终从细胞的两极延伸到噬菌体类核中心PhuZ的纺锤体定位细胞中心的噬菌体DNA，以允许2012-1的基因组高效地复制和/或包装到衣壳噬菌体组装、细胞溶解排出成熟的噬菌体狭义细胞质骨架微丝微管中间纤维是指生物真核细胞中的蛋白纤维网架体系细胞骨架Cytoskeleton广义核骨架核纤层细胞外机制主要特征主要特征微管微管微丝微丝中间纤丝中间纤丝直径直径25nm25nm6-7nm6-7nm10nm10nm基本结构分子基本结构分子/-微管蛋白微管蛋白肌动蛋白肌动蛋白杆状蛋白杆状蛋白结合核苷酸结合

2、核苷酸GTPGTPATPATP无无结构分子大小结构分子大小50 kDa50 kDa43 kDa43 kDa40-200 kDa40-200 kDa结构结构13根原纤维围成根原纤维围成的中空管的中空管双链螺旋双链螺旋8个个4聚体或聚体或4个个8聚聚体组成的空心管状体组成的空心管状纤维纤维装配方式装配方式二聚体到中空管二聚体到中空管踏车运动式踏车运动式逐级装配，极性逐级装配，极性聚合聚合特异性药物特异性药物秋水仙素等秋水仙素等细胞松弛素等细胞松弛素等无无运动相关的运动相关的结合蛋白结合蛋白动力蛋白动力蛋白驱动蛋白驱动蛋白肌球蛋白肌球蛋白无无主要功能主要功能细胞运动、支持细胞运动、支持作用、胞内运输

3、作用、胞内运输形状维持、变性形状维持、变性运动、胞质环流、运动、胞质环流、细胞连接细胞连接骨架作用、细胞骨架作用、细胞连接、信息传递连接、信息传递三种细胞骨架主要特征比较确定一个由噬菌体编码的微管蛋白家族PhuZPhuZ形成一个纺锤状的中心噬菌体DNA的结构，优化噬菌体生成PhuZ晶体结构揭示了一个扩展的C末端和缺乏保守的螺旋6PhuZ C-终端交互是体内和体外的聚合所需的提供更广泛的洞察病毒、原核生物的微管骨架的功能和机制能否有望成为研发新广谱抗菌药物的一个有潜力的靶点PhuZ蛋白的具体功能未阐明PhuZ基因是否会随噬菌体DNA整合到细菌的染色体上，从而影响细菌的细胞骨架的形成图1、PhuZ

4、和其他亲缘关系较远的微管蛋白的系统发生关系和守恒的序列(A) 系统发生树显示了假单胞菌噬菌体编码的不同的微管蛋白(PhuZ)，(B) 对齐的L1和G盒图案为PhuZ ,TubZ, / -微管蛋白，具有代表性的细菌FtsZ的序列。保守氨基酸残基为红色。(C) 调整PhuZ的最后13个酸性氨基酸( GP59 )，组成噬菌体KZ(GP39 )和EL(GP16)编码酸性PhuZ链接相关的蛋白质。保守的酸性残留物为红色。1、鉴定噬菌体编码的微管蛋白家族PhuZ证明PhuZ是微管蛋白作者是怎样发现PhuZ微管蛋白？2006-2010年有科学家发现并研究了细菌肌动蛋白细胞骨架的序列和功能特征，然而的微管蛋白

5、家族方面的研究较少。微管蛋白家族PhuZ2、PhuZ在体内和体外装配动态微管丝野生型突变型D190(A)不同浓度阿拉伯糖诱导突变型D187(A)野生、突变型比较结论：野生型的PhuZ随着阿拉伯糖的浓度升高，能装配动态微管丝。而突变型，在浓度升高到一定时基本保持不变。Movie S1. Dynamics of Short GFP-PhuZ Filaments in Uninfected Cells, Related to Figure 2. Fluorescence micrograph of P. chlororaphis cells, grown on a 1.2% agarose pad,

6、 expressing GFP-PhuZ from the arabinose promoter, induced with 0.4% arabinose. Note the multiple short dynamic filaments per cell. Total time lapsed is 1 min 33.32 s. Scale bar equals 5 microns.当表达恰好高于零界诱导浓度(0.4%)时，细胞含有多个微管丝，并迅速地在整个细胞中移动Movie S2. Dynamics of Catalytic Mutant GFP-PhuZD190A in Uninfec

7、ted Cells, Related to Figure 2. Time-lapse fluorescence micrograph of P. chlororaphis cells, grown on a 1.2% agarose pad, expressing GFP-PhuZD190A from the arabinose promoter, induced with 1.0% arabinose. In contrast to wild type filaments, these filaments appear static and often chain cells togethe

8、r. Total time elapsed is 33.263 s. Scale bar equals 5 microns.a.PhuZ动态微管丝的性质（体内）凝胶显示PhuZ结构的纯度直角散射光研究其在体外聚合物生长动力和结构PhuZ微管丝电子显微图b.PhuZ动态微管丝的性质（体外）PhuZ微管丝电子显微图PhuZ聚合依赖GTP，GDP存在未观察到聚合PhuZ野生型与突变型对照3、PhuZ-GDP单体结构为了更好地理解PhuZ和其他微管蛋白的相似性和差异性PhuZ中结构与核苷酸的结合 (A) 图表示PhuZ N-端结构域显示橙色、黄色，C-端结构域深蓝灰色，H11螺旋显示粉红色，和C末端青

9、色。GDP区域显示成球形。(B) 核苷酸自上而下的结合位点。2FO-FC在Mg-GDP中增加是为了在网状模型中显示2已被证实H6 -微管蛋白超嗜热菌FtsZTubZ PhuZ物体表面静电作用结论虽然PhuZ的三级结构与其他微管蛋白家族成员的结构是高度一致的，但还是有许多显著的差异。作为微管蛋白，PhuZ缺乏存在于FtsZ的TubZ的N-末端延伸。H6的纵向联系是形成微管蛋白和FtsZ原纤维的关键，PhuZ缺乏它。H6离开存在它的酸性表面缺口。由于更小的循环和螺旋，PhuZ的C端结构域在尺寸上是小于其他微管蛋白家族成员，尤其是H10。像TubZ，PhuZ在保守的C端结构域后包含一个长螺旋，H11

10、PhuZ讨论1：这个H6的缺口是否是核酸的结合口袋核苷酸结合位点是保守的，包含聚合物动力所需的关键催化残基微管蛋白的GGGTGT / SG的共有序列，或G盒为确认这些天冬氨酸分配功能，它们分别突变为丙氨酸，结果突变蛋白形成了长的静态聚合物绿色荧光蛋白和绿色荧光蛋白+PhuZ的比较GFPGFP+PhuZPhuZ在晶体中纵向间距装配微管丝1、纵向间距比其他微管蛋白长2、单体间高度溶剂化形成一新的机制，单体间直接接触，没有水连接单体（因为结构中有GDP、单体与GTP结合）PhuZ的C末端的广泛相互作用需要聚合物的形成去掉了C末端最后的13个氨基酸残基和定点突变，发现表达水平完全取消微管丝的形成对突变

11、体形成的微管丝进行定量分析，发现几乎无微管丝形成4、在噬菌体裂解增长PhuZ组装动态纺锤状阵列(A)绿针假单胞菌被噬菌体20121感染，采用逆转录PCR检测的phuZ mRNA的存在。 PCR产物在0.7琼脂糖凝胶上进行电泳。泳道2：感染前的样品(感染前加入噬菌体)，泳道3：时间0(感染后立即加入噬菌体)，泳道4：感染后30分钟，泳道5：感染后1小时，泳道6：感染后2小时，泳道7：感染后6小时，泳道8：阳性对照组（噬菌体裂解），泳道9：空白。检测的PhuZ mRNA的表达在两个2小时(泳道6)和6小时(泳道7)感染后。(B)绿针假单胞菌的荧光显微照片，在0.25%阿拉伯糖诱导，无噬菌体感染，生

12、长并固定在使用相同的环境。膜被染成红色FM4-64，DNA用DAPI被染成蓝色。细胞杆状由大染色体凝集。从RNA分子水平证明PhuZ微管蛋白与噬菌体的裂解有关从蛋白质分子水平证明PhuZ微管蛋白与噬菌体的裂解有关(A)在0.15%的阿拉伯糖，微管丝首次出现在56分钟后噬菌体的加入，175分钟后细胞裂解。用DAPI表示噬菌体释放。 (B)细胞在0.25 %的阿拉伯生长，微管丝首次出现在39分钟后噬菌体加入，聚合物进行组装和去组装周期直到细胞裂解在140分钟后。(C)(D)GFP - PhuZ的微管丝位于DAPI染色的类核细胞中心的的任一侧。绿色：PhuZ蛋白，红色：细胞膜，蓝色：DNA对照野生型

13、突变型红色：野生型蓝色：突变型拟核在细胞中的长度占的比例DNA在细胞中的位置类核在细胞的数量PhuZ聚合物在细胞中心定位噬菌体的裂解再生DNAaseI处理这些噬菌体包被的DNA，形成一个玫瑰花状结构Movie S4. Dynamics of GFP-PhuZ Filaments in an Infected P. chlororaphis Cell, Related to Figure 6. Time-lapse fluorescence micrograph of a P. chlororaphis cell infected with 201?2-1, grown on a 1.2% ag

14、arose pad, expressing GFP-PhuZ from the arabinose promoter, induced with 0.25% arabinose. Red: FM4-64 membrane stain, Green: GFP-PhuZ. Total time lapsed: 1 hr, 12 min, 41.453 s. Scale bar equals 5 microns.Movie S5. Rotation about the x Axis of an Infection Nucleoid, Related to Figure 6. 3D rotation

15、about the x axis of a late stage (120 min post-phage addition) infection nucleoid in P. chlororaphis. Cells were fixed using 16% paraformaldehyde as described, washed, and then subsequently treated with DNaseI for 1 hr at 37C. Sample was then stained with DAPI. Unprotected DNA has been digested away

16、 and capsid-protected DNA remains intact, appearing as bright foci arrayed about the edge of the nucleoid. Scale bar equals 1.7 microns.这些噬菌体包被的DNA分子的类核的边缘发生在玫瑰花状结构主要特征主要特征微管微管微丝微丝中间纤丝中间纤丝直径直径25nm25nm6-7nm6-7nm10nm10nm基本结构分子基本结构分子/-微管蛋白微管蛋白肌动蛋白肌动蛋白杆状蛋白杆状蛋白结合核苷酸结合核苷酸GTPGTPATPATP无无结构分子大小结构分子大小50 kDa50

17、 kDa43 kDa43 kDa40-200 kDa40-200 kDa结构结构13根原纤维围成根原纤维围成的中空管的中空管双链螺旋双链螺旋8个个4聚体或聚体或4个个8聚聚体组成的空心管状体组成的空心管状纤维纤维装配方式装配方式二聚体到中空管二聚体到中空管踏车运动式踏车运动式逐级装配，极性逐级装配，极性聚合聚合特异性药物特异性药物秋水仙素等秋水仙素等细胞松弛素等细胞松弛素等无无运动相关的运动相关的结合蛋白结合蛋白动力蛋白动力蛋白驱动蛋白驱动蛋白肌球蛋白肌球蛋白无无主要功能主要功能细胞运动、支持细胞运动、支持作用、胞内运输作用、胞内运输形状维持、变性形状维持、变性运动、胞质环流、运动、胞质环流、

18、细胞连接细胞连接骨架作用、细胞骨架作用、细胞连接、信息传递连接、信息传递三种细胞骨架主要特征比较图1、PhuZ和其他亲缘关系较远的微管蛋白的系统发生关系和守恒的序列(A) 系统发生树显示了假单胞菌噬菌体编码的不同的微管蛋白(PhuZ)，(B) 对齐的L1和G盒图案为PhuZ ,TubZ, / -微管蛋白，具有代表性的细菌FtsZ的序列。保守氨基酸残基为红色。(C) 调整PhuZ的最后13个酸性氨基酸( GP59 )，组成噬菌体KZ(GP39 )和EL(GP16)编码酸性PhuZ链接相关的蛋白质。保守的酸性残留物为红色。1、鉴定噬菌体编码的微管蛋白家族PhuZ证明PhuZ是微管蛋白 -微管蛋白超嗜热菌FtsZTubZ PhuZ物体表面静电作用结论虽然PhuZ的三级结构与其他微管蛋白家族成员的结构是高度一致的，但还是有许多显著的差异。作为微管蛋白，PhuZ缺乏存在于FtsZ的TubZ的N-末端延伸。H6的纵向联系是形成微管蛋白和FtsZ原纤维的关键，PhuZ缺乏它。H6离开存在它的酸性表面缺