第六章酶工程制药

1、固定化技术固定化技术载体结合法交联法包埋法热处理（细胞）物理吸附法共价结合法网格型微囊型离子结合法NCH(CH2)3CHNNCH(CH2)3CHN含酶的10%血红蛋白溶液己甲叉二胺水溶液+混合液1含1%Span85的氯仿-环己烷+混合液2溶于有机相的癸二酰氯+Tween20去乳化，转移至水相微囊4.1 什么是酶反应器酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的反应容酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催化反应的速度。器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催化反应的速度。用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。用于酶进行催

2、化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化反酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化反应提供应提供合适的场所和最佳的反应条件合适的场所和最佳的反应条件，以便在酶的催化下，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地转化成产物。它处于酶催化应使底物（原料）最大限度地转化成产物。它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。酶催化反应过程示意图酶催化反应过程示意图过程调控过程调控生物反应器生物反应器 消消毒毒原料原料预处理预处理 产物分产物分离提纯离提纯 产产品品生物催化生物催化剂制备剂制备空气空气除

3、菌除菌能量能量热量热量 对于游离酶和固定化酶的选择，应考虑：对于游离酶和固定化酶的选择，应考虑：1）酶应用的性质）酶应用的性质和范围；和范围；2）酶的保存稳定性和操作稳定性；）酶的保存稳定性和操作稳定性；3）成本等。）成本等。4.2 理想的酶反应器的要求n生物反应器设计的主要目标：生物反应器设计的主要目标：使产品的质量最高，生产成本最低使产品的质量最高，生产成本最低。n评价生物反应器的主要标准：评价生物反应器的主要标准：反应器生产能力的大小和产品质量的高低反应器生产能力的大小和产品质量的高低。(4) (4) 应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应器的生产应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染

4、使反应器的生产能力下降。能力下降。(1) 所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度（或细胞浓度），所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度（或细胞浓度），才能得到较大的产品转化率。才能得到较大的产品转化率。(2) (2) 能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件。能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件。(3) (3) 应具有良好的传质和混合性能。传质是指底物和产物在反应具有良好的传质和混合性能。传质是指底物和产物在反应介质中的传递。传质阻力是反应器速度限制的主要因素。应介质中的传递。传质阻力是反应器速度限制的主要因素。反应器类型反应器类型适用的操作方式适用的操作方式适用的酶适用的酶特

5、点特点搅拌罐式反应器搅拌罐式反应器分批式分批式,流加分批式流加分批式连续式连续式,游离酶游离酶固定化酶固定化酶反应比较完全，反应反应比较完全，反应条件容易调节控制。条件容易调节控制。填充床式反应器填充床式反应器连续式连续式固定化酶固定化酶密度大，可以提高酶密度大，可以提高酶催化反应的速度。在催化反应的速度。在工业生产中普遍使用。工业生产中普遍使用。流化床反应器流化床反应器分批式分批式流加分批式流加分批式连续式连续式固定化酶固定化酶流化床反应器具有混流化床反应器具有混合均匀，传质和传热合均匀，传质和传热效果好，温度和效果好，温度和pH值值的调节控制比较容易，的调节控制比较容易，不易堵塞，对粘度较

6、不易堵塞，对粘度较大反应液也可进行催大反应液也可进行催化反应。化反应。反应器类型反应器类型适用的操作适用的操作方式方式适用的酶适用的酶 特点特点鼓泡式反应鼓泡式反应器器分批式分批式流加分批式流加分批式连续式连续式游离酶游离酶固定化酶固定化酶鼓泡式反应器的结构简鼓泡式反应器的结构简单，操作容易，剪切力单，操作容易，剪切力小，混合效果好，传质、小，混合效果好，传质、传热效率高传热效率高,适合于有适合于有气体参与的反应。气体参与的反应。膜反应器膜反应器连续式连续式游离酶游离酶固定化酶固定化酶清洗比较困难清洗比较困难 喷射式反应喷射式反应器器连续式连续式游离酶游离酶通入高压喷射蒸汽，实通入高压喷射蒸汽

7、，实现酶与底物的混合，进现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应，行高温短时催化反应，适用于某些耐高温酶的适用于某些耐高温酶的反应反应(1)间歇式酶反应器n又称为批量反应器（又称为批量反应器（Batch Reactor BSTR）、间歇式搅拌罐、）、间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐。其特点是：底物与酶一次性投入反应器内，产搅拌式反应罐。其特点是：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或物一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。超滤法回收，再转入下一批反应。 n优点是：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅优点

8、是：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速达到稳态。速达到稳态。n缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。于游离酶。(2) 连续式酶反应器n又称为连续搅拌釜式反应器（又称为连续搅拌釜式反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）、连续式搅拌罐。向反应器投入固定化酶和底物溶液，）、连续式搅拌罐。向反应器投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒

9、定的流速连续流入底物溶不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液（含产物）。液，同时，以相同流速输出反应液（含产物）。n优点是：在理想状况下，混合良好，各部分组成相同，并与输出优点是：在理想状况下，混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。成分一致。n缺点是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒。缺点是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒。底物溶液进口 反应液出口 (3) 填充床反应器n填充床反应器（填充床反应器（Packed Reactor,PBR）,又称固又称固定床反应器。将固定化酶填充于反应器内，制定床反应器。将固定化酶填充于反应器内，

10、制成稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定成稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液（含产物）。收集输出的转化液（含产物）。n优点是：高效率、易操作、结构简单等，因而，优点是：高效率、易操作、结构简单等，因而，PBR是目前工业生产及研究中应用最为普遍的是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含反应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。抑制的转化反应。n缺点是：传质系数和传

11、热系数相对较低。当底缺点是：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用物溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR。(4) 流化床反应器n流化床反应器（流化床反应器（Fluidized Bed Reactor, FBR）。）。n特点是：底物溶液以足够大的特点是：底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。化酶颗粒始终处于流化状态。其流动方式使反应液的混合程其流动方式使反应液的混合程度介于度介于CSTR的全混型和的全混型和PBR的的平推流型之间。平推流型之间。FBR

12、可用于处可用于处理黏度较大和含有固体颗粒的理黏度较大和含有固体颗粒的底物溶度，同时，亦可用于需底物溶度，同时，亦可用于需要供气体或排放气体的酶反应要供气体或排放气体的酶反应（即固、液、气三相反应）。（即固、液、气三相反应）。但因但因FBR混合均匀，故不适用混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反应。于有产物抑制的酶反应。(5) 鼓泡式反应器(6) 膜反应器MR连续搅拌罐连续搅拌罐超滤膜反应器超滤膜反应器 简称简称CSTR-UFR。在。在CSTR（连续式搅拌罐）出口处设置一个超滤（连续式搅拌罐）出口处设置一个超滤器。可以将小分子产物与大分子酶和底物分开，有利于产物回收。该器。可以将小分子产物与大分子

13、酶和底物分开，有利于产物回收。该反应器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与反应器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。大分子底物。游离酶在膜反应器中进行催化反应时，底物溶液连续地进入反应器，酶在反应容游离酶在膜反应器中进行催化反应时，底物溶液连续地进入反应器，酶在反应容器的溶液中与底物反应，反应后，酶与反应产物一起，进入膜分离器进行分离，器的溶液中与底物反应，反应后，酶与反应产物一起，进入膜分离器进行分离，小分子的产物透过超滤膜而排出，大分子的酶分子被截留，可以再循环使用。小分子的产物透过超滤膜而排出，大分子的酶分子被截留，可以再循环使用。4.3

14、酶反应器的选择和使用n影响酶反应器选择的因素很多，但一般可以从以影响酶反应器选择的因素很多，但一般可以从以下几个方面考虑：下几个方面考虑： 酶的形式酶的形式(游离游离/固定化固定化.) 固定化酶的形状固定化酶的形状 底物的物理性质底物的物理性质 酶反应动力学性质酶反应动力学性质 酶的稳定性酶的稳定性 操作要求操作要求 反应器制造、控制成本反应器制造、控制成本通常颗粒状、片状、膜状或纤维状固定化酶通常颗粒状、片状、膜状或纤维状固定化酶均可采用填充床反应器均可采用填充床反应器（PBR），而颗粒状、粉末状及片状固定化酶均可使用于连续式搅），而颗粒状、粉末状及片状固定化酶均可使用于连续式搅拌罐（拌罐（

15、CSTR），膜状固定化酶要用螺旋卷膜式反应器。），膜状固定化酶要用螺旋卷膜式反应器。在应用在应用游离酶游离酶进行催化反应时，酶与底物均溶解在反应溶液中，通过进行催化反应时，酶与底物均溶解在反应溶液中，通过互相作用，进行催化反应。可以选用搅拌罐式反应器、膜反应器、鼓互相作用，进行催化反应。可以选用搅拌罐式反应器、膜反应器、鼓泡式反应器、喷射式反应器等。泡式反应器、喷射式反应器等。可溶性底物可溶性底物适用于所有的反应器。难溶底物或者底物溶液呈胶体状者，适用于所有的反应器。难溶底物或者底物溶液呈胶体状者，易堵塞柱床，可选用易堵塞柱床，可选用FBR。颗粒状底物溶液可适用于。颗粒状底物溶液可适用于CST

16、R。当反应。当反应过程需要控制温度、调节过程需要控制温度、调节pH时，选用时，选用CSTR更为方便。更为方便。在反应器操作过程中，由于搅拌或液流的剪切作用，常会使酶从载体在反应器操作过程中，由于搅拌或液流的剪切作用，常会使酶从载体上脱落下来，或者由于磨损而使粒度变细，从而影响了上脱落下来，或者由于磨损而使粒度变细，从而影响了固定化酶的操固定化酶的操作稳定性。作稳定性。n可以选用搅拌罐式反应器、膜反应器、鼓泡式反应器、喷射式反应器等。n游离酶催化反应最常用的反应器是搅拌罐式反应器。搅拌罐式具有设备简单，操作简便，酶与底物的混合较好，物质与热量的传递均匀，反应条件容易控制等优点，但是反应后酶与反应

17、产物混合在一起，酶难于回收利用。n对于有气体参与的酶催化反应，通常采用鼓泡式反应器。鼓泡式反应器结构简单，操作容易, 混合均匀，物质与热量的传递效率高，是有气体参与的酶催化反应中常用的一种反应器。n对于某些价格较高的酶，由于游离酶与反应产物混在一起，为了使酶能够回收，可以采用游离酶膜反应器。n对于某些耐高温的酶，如高温淀粉酶等，可以采用喷射式反应器，进行连续式的高温短时反应。喷射式反应器混合效果好，催化效率高，只适用于耐高温的酶。n反应底物或产物的分子质量较大时，由于底物或产物难于透过超滤膜的膜孔，所以一般不采用膜反应器。n反应底物或者产物的溶解度较低、粘度较高时，应当选择搅拌罐式反应器或者流

18、化床式反应器，而不采用填充床式反应器和膜反应器，以免造成阻塞现象。n反应底物为气体时，通常选择鼓泡式反应器。n有些需要小分子物质作为辅酶（辅酶可以看作是一种底物）的酶催化反应，通常不采用膜反应器，以免辅酶的流失而影响催化反应的进行。4.4 酶反应器的设计n进行热量衡算进行热量衡算n进行物料衡算进行物料衡算 酶反应动力学参数酶反应动力学参数/底物用量底物用量/酶量酶量/反应体积反应体积/反应器数量反应器数量4.5 酶反应器的操作条件确定及调控酶反应器使用中应注意的问题n酶的稳定性对酶反应器的功效是很重要的酶的稳定性对酶反应器的功效是很重要的。在操作过程中，有时需要。在操作过程中，有时需要用酸或碱

19、来调节反应液用酸或碱来调节反应液PH。如果局部的。如果局部的pH过高或过低，就会引起酶过高或过低，就会引起酶的失活，或者使底物和产物发生水解反应。这时，可用加快搅拌已促的失活，或者使底物和产物发生水解反应。这时，可用加快搅拌已促使混合均匀。使混合均匀。n如果底物和产物在反应器中不够稳定的话，可以采用高浓度的酶，以如果底物和产物在反应器中不够稳定的话，可以采用高浓度的酶，以减少底物和产物在反应器中的停留时间，从而减少损失。减少底物和产物在反应器中的停留时间，从而减少损失。n防止防止微生物污染微生物污染n酶反应器操作中，生产能力逐渐降低，主要原因是酶反应器操作中，生产能力逐渐降低，主要原因是固定化

20、酶活性降低固定化酶活性降低或损失或损失。造成固定化酶活性损失的原因：。造成固定化酶活性损失的原因： 酶本身的失活；酶本身的失活； 酶从载体上脱落；酶从载体上脱落； 载体的破碎或溶解。载体的破碎或溶解。“绿色健康，绿色健康，“酶酶”力无限力无限医药、洗涤剂、纺织、淀粉制糖、发酵、酒精、食品（包括果蔬汁、啤酒酿造、谷物食品、蛋白水解、和功能食品以及食用油脂）、饲料、皮革、造纸和化工等工业领域 1、通过酶活力变化进行疾病诊断、通过酶活力变化进行疾病诊断2、用酶测定物质的量的变化进行疾病诊断、用酶测定物质的量的变化进行疾病诊断PKU苯丙酮尿症脑发育受阻，严重脑力呆滞，智商 050苯丙氨酸代谢途径关系到

21、三种遗传病苯丙氨酸代谢途径关系到三种遗传病体检表中有关酶的选项体检表中有关酶的选项3、酶在疾病治疗方面的应用、酶在疾病治疗方面的应用溶菌酶溶菌酶栓溶酶类与心血管疾病栓溶酶类与心血管疾病凝血酶凝血酶消化酶类消化酶类SOD 美国医学家WF安德森等人对腺苷脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。谢德尔，谢德尔，19994、酶在药物制造方面的应用、酶在药物制造方面的应用青霉素酰化酶与抗生素改造青霉素酰化酶与抗生素改造Iressa 艾若萨 (ZD1839)阿斯利康公司苯胺喹啉化合物（anilinoquinazoline）强效EGFR（表皮生长因子受体）酪氨酸激酶抑制剂。

22、对癌细胞的增殖、生长、存活的信号转导通路起阻断作用。增加PPD、Taxel、Doxtaxel、ADM治疗NSCLC有效率920不良反应：皮疹、恶心、呕吐、腹泻。增生增生X 凋亡凋亡血管生成血管生成转移转移 细胞膜细胞膜 癌细胞癌细胞ZD1839EGFTGFa a XXX细胞核细胞核激酶激酶XZD1839: 作用机制淀粉酶类与淀粉糖业淀粉酶类与淀粉糖业淀粉液化液淀粉酶糖化酶糖化液喷雾干燥氢化还原结晶异构酶粉状葡萄糖山梨醇结晶葡萄糖果葡糖浆果糖42%葡萄糖55%低聚糖分离混合高果糖浆果糖浆果糖80-90%果糖55%葡萄糖39%低聚糖果汁生产与果胶酶乳制品与凝乳酶果菜清洗果菜清洗拣果机拣果机Cech

23、和和Altman因为这一开创性的工作获得因为这一开创性的工作获得1989年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖小分子仿酶体系主要以环糊精、冠醚、方向烃和铁卟啉等大环化合物为骨建立起来的酶模型，使模拟酶技术获得显著成绩水是酶促反应最常用的反应介质。水是酶促反应最常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物许多有机化合物(底物底物)在水介质中难溶或不溶。在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。应的发生。是否存

24、在非水介质能保证酶催化？是否存在非水介质能保证酶催化？1984年，克利巴诺夫（年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应中进行催化反应。有机介质中的酶催化有机介质中的酶催化 有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水

25、性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。气相介质中的酶催化气相介质中的酶催化 酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。 由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。超临界介质中的酶催化超临界介质中的酶催化 酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。 离子液介质中的酶催化离子液介质中的酶催化 酶在离子液中进行的催化作用。离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的

26、在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。 不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。 相适应。 酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性 酶在有机介质中由于水分子的减少，相对来说酶分子的构象表现出比水溶液中更具有“刚性”特点。因而使通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些特性成为可能。例如在有机溶剂中，可以利用酶与配体的相互作用性质，诱导改变酶分子的构象，调控酶的底物专一性、立体选择性和手性选择性等。 由于引起酶变性的许多因素都与水的存在有关由于引起酶变性的许多因素都与水的存在有关, 因此在有机介质因此在有机介质中酶的稳定性得到显著提高。中酶的稳定性得到显著提