实验九动物肝脏DNA提取和鉴定学习教案

1、会计学1实验九动物肝脏实验九动物肝脏(gnzng)DNA提取和鉴定提取和鉴定第一页，共31页。第1页/共30页第二页，共31页。设法除去设法除去RNARNA的污染；的污染；防止防止DNADNA酶的降解作用；酶的降解作用；（一）动物（一）动物(dngw)肝脏肝脏DNA制备原理制备原理第2页/共30页第三页，共31页。第3页/共30页第四页，共31页。细胞破碎细胞破碎(p su)方法方法机械物机械物理法：理法：第4页/共30页第五页，共31页。细胞破碎细胞破碎(p su)方法方法机械物理机械物理法法第5页/共30页第六页，共31页。第6页/共30页第七页，共31页。第7页/共30页第八页，共31页

2、。第8页/共30页第九页，共31页。第9页/共30页第十页，共31页。（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸(h sun)的原的原理：理：l琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离(fnl)方法，是一种简便、快速分离方法，是一种简便、快速分离(fnl)鉴定核酸的方法，已成鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。l琼脂糖英文名琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和L- 半乳糖相互结合的

3、链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含溶液下可形成多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗作用降低，因而分离硫酸根比琼脂少，电渗作用降低，因而分离(fnl)效果明显提高效果明显提高。第10页/共30页第十一页，共31页。lDNADNA分子在分子在pHpH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动（电荷效应）向正极移动（电荷效应） 。lDNADNA分子泳动速率的大小除与分子泳动速率的大小除与DNADNA分子的带电量有

4、关外，分子的带电量有关外，还与还与DNADNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶的分子分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶的分子筛效应）。筛效应）。l电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴化乙啶电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴化乙啶 （ethidium bromideethidium bromide，EBEB） 指示指示DNADNA样品在凝胶中的确切位样品在凝胶中的确切位置。置。l溴化乙啶是一种荧光染料，可插入溴化乙啶是一种荧光染料，可插入DNADNA双螺旋结构的两个双螺旋结构的两个碱基对之间，与碱基对之间，与DNADNA分子形成络合物，在紫外光的激发分子形成络合物，在紫外光的激发(jf)(j

5、f)下发出橙黄色的荧光。下发出橙黄色的荧光。第11页/共30页第十二页，共31页。第12页/共30页第十三页，共31页。琼脂糖凝胶电泳分离核酸琼脂糖凝胶电泳分离核酸(h sun)的影响因素的影响因素第13页/共30页第十四页，共31页。琼脂糖凝胶电泳具有以下琼脂糖凝胶电泳具有以下(yxi)优点：优点：（1 1）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度(sd)(sd)快、分离快、分离DNADNA片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。泳。（2 2）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率

6、高，重）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。复性好。（3 3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光检测）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光检测及定量测定。及定量测定。（4 4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。可长期保存。因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究中常用因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一，实验方法之一， DNA DNA样本的分离、纯化、鉴定以及相对分子质量测定样本的分离、纯化、鉴定以及相对分子质

7、量测定常用琼脂糖凝胶电泳。常用琼脂糖凝胶电泳。第14页/共30页第十五页，共31页。 荧光荧光(ynggung)染料染料EB染色后，在紫外灯染色后，在紫外灯(305nm)下观察到的电下观察到的电泳结果：泳结果：第15页/共30页第十六页，共31页。 * * 荧光染料荧光染料EBEB染色的原理和优点是什么？染色的原理和优点是什么？ 1 1、原理：、原理： EB EB：即：即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲锭溴盐苯基菲锭溴盐(Ethidium (Ethidium Bromide)Bromide)。 EB EB是一种扁平分子是一种扁平分子(fnz)(fnz)，它可以嵌入

8、核酸，它可以嵌入核酸的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。 激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸收激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸收260nm260nm的紫外线后将能量传递给的紫外线后将能量传递给EBEB，二是，二是EBEB本身吸收本身吸收302nm302nm和和360nm360nm的紫外线的能量。这两方面的能量最终激发的紫外线的能量。这两方面的能量最终激发EBEB发射发射波长为波长为590nm590nm的可见光（红橙区）。的可见光（红橙区）。第16页/共30页第十七页，共31页。 2 2、优点：、优点：（1 1）染色比较简便、

9、快捷，一般在）染色比较简便、快捷，一般在101015min15min就就可反应。可反应。（2 2）EBEB对核酸分子无破坏对核酸分子无破坏(phui)(phui)作用，这是作用，这是其它染料所不能做其它染料所不能做 到的。到的。（3 3）EBEB灵敏度高，可检测出灵敏度高，可检测出10ng10ng或更少的或更少的DNADNA含含量。量。（4 4）既可用于）既可用于DNADNA也可用于也可用于RNARNA的检测。的检测。（5 5）EBEB可加到样品中，也可加到凝胶中，可随可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外时用紫外 灯检测电泳的进程和效果。灯检测电泳的进程和效果。（6 6）EB-DNAEB

10、-DNA复合物中的复合物中的EBEB发出的荧光比游离的发出的荧光比游离的EBEB强强1010倍，倍， 因此不需洗净凝胶中游离的因此不需洗净凝胶中游离的EBEB也可检测出也可检测出DNADNA的条带。的条带。第17页/共30页第十八页，共31页。3 3、缺点：、缺点： 溴化乙啶是一种强的致突变剂，在操作和配溴化乙啶是一种强的致突变剂，在操作和配制试剂制试剂(shj)(shj)时应戴手套。含溴化乙啶的溶液时应戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，应进行处理。不能直接倒入下水道，应进行处理。（1 1）每）每100ml100ml溶液中加入溶液中加入100mg100mg粉状活性炭；粉状活性炭；（2

11、 2）室温下放置）室温下放置1 1小时，不时的摇动；小时，不时的摇动；（3 3）用新华一号滤纸过滤，弃滤液；）用新华一号滤纸过滤，弃滤液；（4 4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。处理。* *溴化乙啶在溴化乙啶在260260分解，在标准条件下进行焚化后分解，在标准条件下进行焚化后不会有危险性。不会有危险性。第18页/共30页第十九页，共31页。第19页/共30页第二十页，共31页。第20页/共30页第二十一页，共31页。自动取液器的构造自动取液器的使用吸入液体吸入液体 排出液体排出液体使用注意事项：不超量程使用；不倒置；使用完毕使用注意事项：

12、不超量程使用；不倒置；使用完毕(wnb)调至最大刻度上。调至最大刻度上。第21页/共30页第二十二页，共31页。第22页/共30页第二十三页，共31页。第23页/共30页第二十四页，共31页。第24页/共30页第二十五页，共31页。第25页/共30页第二十六页，共31页。8.8.凝胶板的制备：凝胶板的制备：（1 1）取琼脂糖）取琼脂糖0.7 g0.7 g，加，加1 1TBETBE缓冲溶液缓冲溶液100ml100ml，于沸水浴中至熔化，制成，于沸水浴中至熔化，制成0.7%0.7%的琼脂糖胶液的琼脂糖胶液。（2 2）胶床两头贴上防水胶带，形成）胶床两头贴上防水胶带，形成8mm8mm高的挡高的挡墙，

13、压紧胶带，置水平台面上。墙，压紧胶带，置水平台面上。（3 3）插入梳子）插入梳子(sh zi)(sh zi)，梳齿下端离板底，梳齿下端离板底0.50.51mm1mm。（4 4）g/mLg/mL的的EBEB溶液。溶液。（5 5）将）将6060凝胶不间断倒入胶床，高凝胶不间断倒入胶床，高3 34mm4mm，避免气泡，摇匀，室温下凝固。避免气泡，摇匀，室温下凝固。（6 6）完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，）完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶面加入电泳缓冲液，高于胶面1 12mm2mm，从一头轻，从一头轻轻斜拉出梳子轻斜拉出梳子(sh zi)(sh zi)，除去产生的气泡。

14、，除去产生的气泡。第26页/共30页第二十七页，共31页。9.9.加样：加样： 将样品将样品DNADNA溶液与加样缓冲液以溶液与加样缓冲液以5 5 ：1 1的体积的体积比混合，用微量移液器加样，每加完一个样品，冲比混合，用微量移液器加样，每加完一个样品，冲洗三次。加样量洗三次。加样量151520 20 l l （加样时应防止碰坏（加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透样品孔周围的凝胶面以及穿透(chun tu)(chun tu)凝胶凝胶底部）。底部）。10.10.电泳：电泳： 为了获得电泳分离为了获得电泳分离DNADNA片段的最大分辨率，片段的最大分辨率，电场强度不应高于电场强度不应高于5

15、V/cm5V/cm（两电极间的距离）开始（两电极间的距离）开始时用较高电压时用较高电压(80V)(80V)，样品一进入胶内则将电压调，样品一进入胶内则将电压调至至5V/cm 5V/cm 。当染料前沿移至底边。当染料前沿移至底边1-2mm1-2mm时，电泳毕时，电泳毕。11. 11. 观察观察 关闭电源，取出胶床，在紫外检测仪下观察关闭电源，取出胶床，在紫外检测仪下观察凝胶中的凝胶中的DNADNA（红橙色荧光）。（红橙色荧光）。第27页/共30页第二十八页，共31页。五、思考题：五、思考题： 1 1、用荧光、用荧光(ynggung)(ynggung)染料染料EBEB染色的染色的原理和优缺点是什么？原理和优缺点是什么？