分子生物学常用实验技术及方法

1、第二章常用实验技术及方法一、聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）反应总体积为50讥其中含有：模板DNA0.5 kPCR缓冲液（不含MgCl2）5止10XMgCl2 溶液5止dNTP (2.5 mmol/L)0.5 1卩引物 1 (50 umol/L)0.5 k引物 2 (50 umol/L)0.5 kTaq DNA 聚合酶0.5 l无菌去离子水加至50 kl上层用25（l液体石蜡油覆盖。循环参数为94 C 变性 10 min94 C 变性 1 min56 C退火 1 min72 C延伸 2 min共30个循取环，PCR结束后，取2止PCR扩增产物，经1

2、%琼脂糖凝胶电泳, 在紫外检测仪上观察并拍照。二、基于PCR技术的定点突变1. 根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下 游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变 后的碱基（红点）的互补序列（如下图所示）；P1.严P3P42. 用基因5'端的Primer 1和Primer 2 PCR扩增DNA片段1，用基因3'端的Primer4 和Primer 3 一起PCR扩增DNA片段2，PCR反应条件基本如上（七、聚合酶链反 应），可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA片段1和DNA片段2；3. 以片段1

3、和片段2为模板，进行第二次PCR反应，反应体系为50止:片段11d片段21d10XPCR缓冲液(不含MgCl2)5d1O0lgCl2溶液5ddNTP (2.5 mmol/L)5dlTaq 酶1dl力加ddH2O至50 d在该反应体系中先不加入引物， 按上述反应条件进行 10个循环，然后再加入Primer 1和Primer 4各1 ul，按上述反应条件再扩增30个循环；4. PCR 产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定定点突 变的正确性。TM三、Total RNA 的提取 (Catrimox-14RNA Isolation Kit Ver. 2.11)TM1. 吸弃培养细胞中的

4、旧培养基，用PBS洗涤1-2次后，加入1 ml的 Catrimox-14溶液，然后充分混匀；2. 收集细胞裂解液，按以下条件进行离心:5细胞数 <5X10 :9500 rpm (约5 000 Xg) 5 min57细胞数 5X10 - 1 X0 : 3000 rpm (约450Xg) 5 min7细胞数 >1X10 :1500 rpm (约 112.5 Xg) 5 min3. 除去上层溶液，加入1 ml的DEPC处理的H2O,上下颠倒混合数次后，12000rpm 离心、2 min ；4. 吸弃上层溶液，激烈振荡使沉淀松动；5. 向Microtube中加入1 ml的2 M LiCI溶

5、液；6. 激烈振荡后，室温下12000 rpm离心5 min，除去溶液；7. 沉淀用 70 % 冷乙醇清洗一次；8. 沉淀经过简单的真空干燥后，溶于适当的缓冲液中。四、RT-PCR (TaKaRa One Step RNA PCR Kit)1. 按Takara Kit中所提供的标准步骤配制PCR体系；2. 按以下条件进行 RT-PCR 反应 50 C 30 min(2) 94 °C 2 min(3) 94 C 1 min(4) 56 C 1 min(5) 72 C 2 min3. 重复步骤(3)-(4)-(5) ，共30个循环；4. 反应结束后，取3-5 k进行琼脂糖凝胶电泳检测，并

6、将PCR产物冷冻保存。五、DNA样品的琼脂糖凝胶电泳50XTAE: 242 g Tris 碱57.1 ml 冰乙酸100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)1. 称取0.5 g agarose，置于250 ml锥形瓶中，加入50 ml 1河AE (含EB 0.5 ug/ml )，加热使其全部溶解；2. 封口、安放梳子；3. 待凝胶稍凉后铺板；4. 胶凝固后，放入电泳槽中，倒入1 XTAE，淹没胶面，拔去梳子；5. 将DNA样品与6X的上样缓冲液混合，加于加样孔中；6. 80-100V 恒压电泳，待溴酚蓝走至凝胶适当位置时，停止电泳，紫外灯下 观察或拍照。六、从琼脂糖凝胶上回收DNA片

7、段(Vitagene DNA 片段回收Kit)1. 用一灭菌刀片割下含目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶块，放入 Eppendorf 管中；2. 用Vitagene DNA片段回收Kit，并按照试剂盒提供的步骤回收所要的DNA片段。七、DNA 片段的连接反应1. 总体系为10-20 h外源DNA插入片段和载体片段按一定摩尔比混合;2. 加入 1-2 ul 10 Buffer，2 ul T4DNA 连接酶，混匀；3. 12-16 C反应过夜。八、大肠杆菌感受态细胞的制备1. 挑取单菌落接种于3-5 ml LB液体培养基中，37 C振荡培养过夜；2. 取0.5 ml培养物转接种于50 ml LB液体培

8、养基中，37 C振荡培养约3 h至对 数生长期 (OD 600 = 0.4-0.6) ；3. 将细菌转移至 50 ml 离心管中，冰浴 20 min；4. 于4 C, 4200 rpm 离心 10 min，弃上清；5. 用5 ml 冰预冷的0. 1 M CaCl 2悬浮菌体，冰浴 30 min；6. 于4 C, 4200 rpm 离心 10 min，弃上清；7. 用3 ml 0.1 M CaCI 2/15%甘油悬浮菌体(动作要轻)，每管分装100 d，立 即使用或置于-70 C冰箱保存。九、大肠杆菌感受态细胞的转化1. 感受态细胞若保存于-70 G冰箱，取出后先在冰上复苏5-10 min ；2

9、. 加入适量 DNA 样品，混匀，冰浴 30 min ；3. 42 C水浴1 min，立即放入冰上冷却2 min ；4. 加入0.5 ml LB 液体培养基，37 C振荡培养45 min ；5. 取适量转化的菌体，涂布于含抗生素的 LB 平板上，等平板表面的液体被吸 收后，倒置放入37 °C温箱，培养过夜。十、大肠杆菌质粒 DNA 的小规模制备(一)、材料：1. Solution I2. Solution II葡萄糖50mMTris-HCl (pH8.0)25mMEDTA (pH8.0)10mMNaOH0.2 M3. Solution III5 M 乙酸钾60 ml冰乙酸11.5 m

10、l去离子水28.5 ml4. TE Buffer (pH8.0)Tris-HCl (pH8.0)10 mMEDTA (pH8.0)1 mMSDS1%(二)、方法：1. 在2 ml含相应抗生素的LB液体培养基中接种单菌落，37 C剧烈振摇培养过 夜；2. 取细菌培养物置于 Eppendorf 管中， 13000 rpm 离心 30 sec ，弃上清；3. 用100 dSolution I重悬菌体沉淀，冰浴 2-3 min ；4. 加200 d新鲜配制的Solution U,颠倒Epp管数次以充分混匀，室温放置 2 min；5. 加150 d用冰预冷的Solution川，温和振荡数次，冰浴 3-5

11、 min ；6. 13000 rpm 离心 5 min ，将上清转移至一新 Epp 管中；7. 加等体积异丙醇振荡混匀，室温 5 min ；8. 13000 rpm离心5 min，弃上清，并用200 ul去离子水溶解沉淀；9. 加 100 ul 7.5 M (NH4) 2Ac 混匀，冰浴 5 min；10. 13000 rpm 离心 2 min ；11. 转移上清至一新 Epp 管；12. 加 2 倍体积的乙醇， 振荡混匀，于室温放置 5 min， 13000 rpm 离心 5 min；13. 用1 ml 70 %乙醇洗涤双链DNA沉淀，13000 rpm 离心5 min，弃上清， 在空气中使

12、核酸沉淀干燥 10 分钟；14. 用20 dTE buffer重新溶解核酸沉淀，贮存于-20 C备用。十一、蛋白质诱导表达（一）、材料1. 氨苄青霉素（用去离子水配成60 mg/ml，用0.22 m滤器过滤除菌，-20 C避光保存）2. IPTG （用去离子水配成200 mM，用0.22 m滤器过滤除菌，-20 C保存）3. PMSF （用异丙醇配成10 mM，-20 G呆存）（二）、方法1. 挑取单克隆接种于含有氨苄青霉素 （100旧/ml）的小量LB培养液中，37 C 振荡培养过夜；2. 将过夜培养物按1 ：100的比例接种到含氨苄青霉素（100他/ml ）的LB液 体培养基中，37 C振

13、荡培养至OD600约为0.5 ;3. 加入IPTG至终浓度为0.1-1 mM，每隔一小时取一次样；4. 在诱导了 3小时的菌液中取适量（如10 ml），离心，去上清，加入1ml PBS 重悬，再加入PMSF至终浓度为0.1 M，冰上预冷10 min ;5. 进行超声破碎 10 min（10-20 sec / 次），至菌液较为澄清，离心，取上清；6. 用相同体积的 PBS 重悬沉淀，将诱导前及诱导后所取的样品，以及超声破碎后的上清和沉淀分别进行蛋白电泳检测，染色、脱色；7. 根据脱色结果，可确定是否有表达出目的蛋白，选择合适的诱导时间以及表 达量较高的克隆，并且判断所表达的蛋白是可溶性的还是以包

14、涵体形式存 在。十二、 GST 融合蛋白的表达和纯化1. 按上述蛋白质诱导表达的方法表达出 GST融合蛋白，此时GST融合蛋白是 溶于PBS中的；2. 取适 量 Glutathione Sepharose TM 4B beads （ Amersham Biosciences ，Sweden ），用 PBS 洗3 遍；3. 将beads加入GST融合蛋白的上清液中，4C Rotation 4-6 h ；4. 4 C最高速离心3-5 sec，小心吸弃上清；并用PBS洗3遍；5. 藕联了 GST 融合蛋白的 beads 备用于后面的实验。十三、蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（一）、材料1. 30

15、%丙烯酰胺储存液：丙烯酰胺29.2 g亚甲双丙烯酰胺0.8 g加蒸馏水溶解后，补加蒸馏水至终体积为100ml检测其pH值，应不大于7.0过滤，避光储存。100 mM4 %0.2 %20 %2. 2七DS凝胶加样缓冲液：Tris-HCI （pH6.8）SDS （电泳级）溴酚蓝甘油使用前加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度为200 mM3. 5 XTris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris碱15.1 g甘氨酸94 g溶解于 900 ml dd H2O，再加入50 ml 10% （w/v） SDS （电泳级），用dd H2O补至 1000 ml。匚）、方法1. 配制所需浓度的分离胶:12 %分离胶15 %分离

16、胶dd H2Odd H2O2.64 ml1.7 ml30 %丙烯酰胺30 %丙烯酰胺3.2 ml4 ml1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)2 ml2 ml10 % SDS10 % SDS80止8010 % APS10 % APS80 Jl80TEMEDTEMED3.21卩3.2 U2.将配好的分离胶灌注到两玻璃板的空隙中，用异丁醇覆盖;3. 室温聚合，倾出异丁醇，用蒸馏水洗涤，并用滤纸吸净残留的液体;4. 配制5%的浓缩胶：dd H2O3.4 ml30 %丙烯酰胺0.83 ml1.0 M Tris-HCl （pH 6.8）0.63 ml

17、10 % SDS50止10 % APS50止TEMED5止5.在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶，立即插入梳子，室温聚合30 min ;6待浓缩胶聚合完全后，小心拔出梳子；7. 向电泳槽中加入1 XTris-甘氨酸电泳缓冲液，加样，并在所有不用的样品孔中加入等体积的1XSDS凝胶加样缓冲液；8. 接通电源（正极接下槽），先用120 V电压电泳至染料前沿进入分离胶再将电压提高到150-200 V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部；9. 关闭电源，从电泳装置上卸下玻璃板，剥胶，接下来染色脱色或者做 WesternBlotting 鉴定。十四、Western Blot（一）、材料1. 转移 Buffer:

18、 Tris 碱25 mM6.08gGlycine L-甘氨酸192 mM 28.80gMethnol 甲醇 20% v/v500ml（ddH2O 定容至2 L）2.2. TBST:3. 封闭液:5 %脱脂奶粉（溶于 TBST）4. ProtoBlot HAP System with Stabilized Substrate, Human （Promega , USA）5. Lumi-Phos TM WB （Pierce, USA）（二）、方法1. SDS-PAGE 电泳分离蛋白；2. 电转移至”。膜（100V恒流1 h）;3. 用封闭液封闭2 h或4 C封闭过夜；4. 加入一抗，室温温育1-2

19、 h或4 C温育过夜；5. 用 PBST 洗3 次，每次 5-10 min ；6. 加入相应的二抗，室温温育 45 min ；7. 用 PBST 洗3 次，每次 5-10 min ；8. 用PBS润洗2次；9. 加入适量的显色底物 （1 ：1 混合 ）（ ProtoBlot H AP System with StabilizedSubstrate ）至目的条带清晰可见，或者用 Lumi-Phos TM WB底物做ECL。十五、免疫共沉淀（一）、抗体的偶联：1. 在Epp管中，加入 500 pl PBS、适量的抗体和 Protein A/G Beads （Perice公司），再加BSA至终浓度至

20、0.1 % ；2. 将Epp管置4 °C，rotation 4 h以上，4 C最高速离心3-5 sec，小心吸弃上清；3. 在Epp管中加入1 ml相应的细胞裂解buffer，颠倒混匀，4 C最高速离心3-5sec后小心吸弃上清；4. 重复步骤3，用细胞裂解液清洗Beads 3-4 次,最后吸弃上清，将Beads放4 C备用。（二）、免疫共沉淀：1. 收集转染后的细胞，800Xg离心5 min ；2. 吸弃上清，加入适量的PBS清洗细胞，重复2次，800 Xg离心5 min，最后吸弃上清；3. 加4倍细胞沉淀体积的裂解buffer，并在4 C Rotation 1h ；4. 1400

21、0 rpm , 4 °C离心 15 min ;5. 小心吸取上清，加入到已偶联上抗体的 Protein A/G Beads , 4 C Rotation过夜；6. 4 C最高速离心3-5 sec，小心吸弃上清；7. 加入裂解buffer重悬Beads，最高速离心3-5 sec后，小心吸弃上清；8. 重复步骤7,用裂解buffer清洗Beads 3-4次；9. 最后加入适量的上样buffer，95 C加热5 min后SDS-PAGE分析。十六、细胞培养 （一）、细胞培养条件HeLa、HEK293T以及MCF-7细胞培养在DMEM+10% FBS的培养基中，H1299 细胞培养在RPMI

22、-1640+10 % CS 的培养基中，所有细胞均在37 C，5% CO 2孵 箱中培养。（二）、贴壁细胞的传代1. 在细胞组织培养通风橱中，用灭菌过的巴氏德吸管吸去旧培养液；2. 用PBS洗涤细胞，旋转培养皿使溶液覆盖整个细胞表面，然后吸去；3. 加入Trypsin/EDTA消化细胞，旋转培养皿使溶液覆盖整个细胞表面， 然后吸 去，将培养皿在室温放置数分钟直至细胞从培养皿底部分离开来；4. 加入细胞培养液，用吸管吹打，使细胞脱离瓶底，从而获得单细胞悬液；5. 按一定比例将细胞悬液接种在含有新的细胞培养液的培养皿中，放入细胞培 养箱中继续培养。（三）、细胞的冻存（保种）1. 在冻存前一天换一次

23、培养液；2. 对于贴壁细胞，用 Trypsin/EDTA 把细胞消化下来，将细胞收集于离心管中；3. 室温800-1000 rmp ，离心5 min；4. 去除培养液，加入冻存液，细胞最终密度为 5X106/ml -X107/ml ；5. 用吸管吹打使细胞均匀，按 1 ml 分装到冻存管中；6. 在-70 C冰箱中保存一天后，转移到液氮中长期保存。 （五）、细胞的冻融（复苏）1. 需要进行培养的冻存细胞取出，立即投入 37 C水浴中融化；2. 用吸管将细胞转移到 25 cm 2培养瓶中，加入一定量培养液；3. 37 C培养，细胞贴壁后，换新鲜培养液继续培养。十七、细胞转染1. 按约1-3为05

24、细胞/孔的细胞量在六孔板中接种指数期生长的细胞，在37 °C,5% CO2 孵箱中培养过夜，直至转染前细胞密度达到 50%-80% ；2. 制备下列溶液：Solution A:在100 d不含血清的培养液中加入1-2 g DNA。Solution B:在100 pl不含血清的培养液中加入 2-25 d Lipofectamine (Invitrogen , USA)试剂。3. 充分混匀上述两种溶液，室温放置15-45 min，使之形成DNA-脂质体复合物；4. 用2 ml 不含血清的培养液润洗细胞；5. 在上述混合液中加入 0.8 ml 不含血清的培养液， 混匀，加入到细胞中。 37

25、 C，5% CO 2孵箱中培养2-24小时，推荐5小时；6. 往每孔细胞中加入1 ml含2倍平时浓度血清的培养液；7. 转染18-24小时后，换新鲜培养液；8转染72 h后，将细胞按1: 12接种到两个六孔板中，加入含G418的选择性培 养液；9. 将细胞培养适当时间以选择真正被转染的细胞克隆；10. 挑出单克隆细胞并用 Western blot 的方法验证。十八、细胞凋亡率的测定1. 转染前 18-24 h 用胰酶消化并传代细胞于 24 孔中，使其在转染时密度可达 50% 左右；2. 每24 孔瞬时转染等量不同质粒， 24 h 后，每孔中所有细胞经 Hoechst 33342 染色、充分混匀

26、并静置 5-10 min 后，在荧光显微镜 (Olympus IX71) 下随机选 取5 个不同的视野进行拍照；3. 凋亡细胞的特征是在配有蓝色滤光片的荧光显微镜下可见细胞核发生了 DNA 凝集和 (或)片段化，同时在光学显微镜下可见其细胞有明显的皱缩、起泡和脱起；4. 计数荧光观察绿色荧光蛋白（ GFP ）融合的绿色的细胞及经 Hoechst 33342 染色后核的形态发生变化的细胞占所有发绿色荧光的细胞的百分比为凋亡细 胞的死亡率。每个处理计数五个区域的细胞，并做三个处理。计数活细胞数 和凋亡细胞数并进行数学统计。十九、间接免疫荧光1. 取出培养有细胞的盖玻片，吸干上面残留的培养基后，用适

27、量预冷的 PBS 润 洗盖玻片 1-2 次；2. 吸去残留液体，用 4 的多聚甲醛 /TBS 室温固定细胞约 20 min ；3. 吸去残留液体，用适量的 TBST 清洗细胞 3 次，每次 5-10 min ；4. 0.01 的 Triton X-100/TBST 室温下处理 5-10 min ；5. 用 0.1 % Tween/TBS 清洗细胞 2 次，每次 5-10 min ；6. 用 1 BSA/TBS 封闭细胞 1 h ；7. 将适量的含有一抗的 1 BSA/TBS 加到含有细胞的盖玻片上，室温下孵育 1h；8. 吸去抗体，用 0.1 % Tween/TBS 清洗细胞 3 次，每次 5

28、-10 min ；9. 将适量的含有二抗的 1 BSA/TBS 加到含有细胞的盖玻片上，室温下孵育30 min ；10. 吸去液体，用 0.1 % Tween/TBS 清洗细胞 3 次，每次 5-10 min ；11. TBST 清洗细胞 3 次，每次 5-10 min ；12. 加适当浓度的 Hoechst 染细胞 1 min ；13. TBST 清洗细胞 3 次，每次 5-10 min ；14. 最后吸去残留的液体后， 在载玻片中央滴一滴抗淬灭剂， 然后小心地盖上含 有细胞的盖玻片，吸去周围多余的液体，用指甲油小心封片；15. 在荧光显微镜下观察蛋白质的细胞定位。二十、放线菌酮（ CHX

29、）抑制实验1. 按约5X104细胞/孔的量在24孔板中接种指数期生长的细胞，在 37 °C, 5 %CO 2培养箱中培养过夜，直至细胞长至 50 %-80 % 密度；2. 用 Lipofectamine 2000 转染所需的质粒；3. 转染 24 h 后加入 25 ug/ml 的放线酮处理一定的时间，然后收集、裂解细胞 并做 Western Blotting 。二十一、体外泛素化实验GST、GST-Siah-1以及GST-Siah-1表达在DH5a或者BL21/DE3的大肠杆菌中。诱导表达以及纯化的方法如前所述。ubiquitination buffer ： 50 mMTris-HCl (pH7.6),50 nMrabbit E1500 nMUbcH5c25卩MFlag-ubiquitin2 mMATP.反应总体系为30 ul，总的反应体系在37 °C以适当的速度振荡孵育1 h。反应结 束后， GST、GST-Siah-1 以及 GST-Siah-1 分别用 ubiquitination buffer 洗 6 遍， 然后加等体积