生化与分子生物学研究思路与技术-陈汉春课件

1、1生化与分子生物学生化与分子生物学研究思路与技术研究思路与技术中南大学生物科学与技术学院生物化学系,生物化学研究所陈汉春E-mail: 2生物化学 : 研究活细胞及有机体内各种分子及其相互间化学反应的科学。 研究活细胞的化学组成及相互反应和进程的科学，即“生命的化学” 。 生命科学的基础语言，即研究生命的分子基础(molecular basis of life)。 3一.生物化学研究的目的：从分子水平了解活细胞相关的所有化学进程。对健康、营养的理解和维持以及对疾病的发生机理的阐明和有效治疗。 4 二.生物化学的研究对象： 研究生物分子的组成成分如碳、氢、氧、氮、磷

2、等化学元素以及水和无机盐代谢。 研究生物大分子如DNA、RNA、蛋白质、多糖及脂类的结构、功能、结构与功能的关系以及这些生物大分子的代谢和相互作用。5三三.生物化学生物化学研究的发展：发展： 生物化学研究历经两百多年进入分子生物学年代，走过了三个发展阶段： 叙述生物化学阶段 动态生物化学阶段 功能或分子生物化学阶段 61. 叙述生物化学(descriptive biochemistry)阶段(17701903) 又称为静态或形态生物化学(static or morphological biochemistry)。研究生物体内主要化学物质的组成；分离出各种氨基酸、脂酸、甘油、糖类、柠檬酸、乳酸和

3、苹果酸；从肝中分离出糖元；发现了核质（nuclein）及核酸；奠定了酶学基础理论。7我国人民在公元前二十一世纪，已用曲酿酒，称曲为酒母，又叫做酶；公元前十二世纪，已将豆、谷发酵，捣烂、加盐以造酱，并制出麦芽糖，当时称为 “饴”。公元九世纪或十世纪已制成豆浆和豆腐。此阶段中国人民的贡献：82. 动态生物化学(dynamic biochemistry)阶段（19031950） 又称为生理化学（physiological chemistry）。主要研究生物体内组成物质的化学变化。分离制备结晶酶；阐明细胞氧化和呼吸链及维生素和激素化学性质与生理作用；建立了有关发酵和三羧酸循环、脂酸的氧化作用以及肝中尿

4、素合成的完整生化途径等。9此阶段中国人民的贡献： 我国生物化学家建立了血滤液制备与血糖测定的生化方法；提出了蛋白质变性学说；首先使用定量分析技术研究抗原抗体反应的机理。103. 功能或分子生物化学（functional or molecular biochemistry）阶段 （1950年至今） 从分子水平探索蛋白质、酶和核酸等生物大分子结构与功能的相关和它们的相互作用，包括蛋白质和核酸的提纯及其化学组成、氨基酸或核苷酸的一级结构序列以及空间构型、构象的确定；建立DNA双螺旋模型；人工合成肽激素、tRNA和核酶；建立分子克隆技术和遗传工程技术等。 11此阶段中国人民的贡献： 我国生化工作者于1

5、965年首先成功合成了有生物活性的牛胰岛素；1972年借助X-射线衍射技术研究了猪胰岛素分子的晶体结构；1981年首次合成具生物活性的酵母丙氨酸tRNA；九十年代，成功制备重组因子和促红细胞生成素(EPO)；参与完成人类基因组计划。12四四.生化研究的基本思路生化研究的基本思路 和技术路线：和技术路线： 经典的生物化学研究包括三个主要步骤： 分离细胞器和生物分子。 判断生物分子的结构。 分析生物分子的功能和代谢（合成与 分解）及其相互作用。131 .细胞器和生物分子的分离： 细胞器是一种独立亚细胞单位。一般采用匀浆及离心等进行亚细胞分离。分离后还必须采用测量“标志”酶及特殊化学成分或电子显微镜

6、观察的方法来评估各亚细胞组分。 14 要了解生物分子的结构，首先必须得到纯化的生物分子。用于分离和纯化生物分子的方法很多，例如盐析法、层析法、凝胶过滤、电泳、超速离心等。要得到均一性的生物分子往往需要综合性采用多种方法。15亚细胞器/单位 标志物 主要功能细胞核线粒体核糖体内质网溶酶体胞膜高尔基复合体过氧化物酶体细胞骨架细胞质DNA谷氨酸脱氢酶高丰度的RNA葡萄糖-6-磷酸酶酸性磷酸酶Na+-K+-ATP酶,5-核苷酸酶半乳糖基转移酶过氧化氢酶,尿酸氧化酶没有特征性酶乳酸脱氢酶组成染色体，携带遗传信息。以自身为模板指导合成RNA（转录）。三羧酸循环，氧化磷酸化。蛋白质合成位点（以mRNA为模板

7、翻译成蛋白质）。合成多种脂类，氧化外源性生物分子（细胞色素P450）。含有众多水解酶（酶促降解反应）。转运物质进出细胞，细胞粘附和联系。细胞内的蛋白质分类，糖基化作用，硫化反应。降解部分脂肪酸和氨基酸，产生和分解过氧化氢。微丝、微管、中间纤丝。糖酵解酶类，脂肪酸合成酶。细胞器的标志性成分和主要功能 162 .生物分子的结构确定 ： 质谱和核磁共振。 某些已知特性的酶。 X-射线衍射和晶体学方法。173 .生物分子的功能和代谢分析：1）生物分子的功能分析 人类和动物的研究最初是从动物整体水平开始的，例如对呼吸和消化的研究。将许多整体动物水平的复杂现象转移到体外研究则简单得多。18 策略 方法动物

8、整体水平研究去除一个器官(例如切除肝脏)。改变能量来源(例如禁食)。给予药物(例如苯巴比妥)。给予有毒药物(例如四氯化碳)。利用有特定疾病的动物(例如糖尿病)。离体器官灌注肝脏、心脏、肾脏灌注。灌注可以维持离体器官的功能达数小时，可以不受其它器官和神经系统的影响而独立研究某个器官。组织切片细胞研究组织匀浆如肝脏切片。器官切片不受该器官其它部分的影响,但由于缺氧，在几小时内切片组织的状态会变差。如血细胞,因为血细胞相对容易纯化。细胞可在体外较长时间培养。可以加入或去除某些特殊成分而研究它们的作用。通过离心分离亚细胞器。分离细胞器分离亚细胞组分 抽提、离心制备，细胞器结构和功能研究。超离心制备，细

9、胞器功能研究。代谢物和酶的分离及特征确定化学组成、组织表达谱、酶学特性及化学反应途径分析。酶或蛋白质的基因克隆生物信息学分析蛋白质功能分析基因克隆及其编码的酶或蛋白质的氨基酸序列分析，基因定位及表达调控分析。序列比较、空间结构及功能域预测。基因敲除或转基因动物，核酸-蛋白质及蛋白质-蛋白质相互作用分析。不同层次研究生物分子功能的方法 192）生物分子的代谢分析： 生化代谢途径是指一系列由酶催化的生物化学反应，这些反应包括由一个或多个简单的分子合成复杂的复合物以及一个复合物降解为其终产物的过程。 20 某些氨基酸、糖和脂肪酸可以与一个合适的稳定同位素结合，然后注入动物体内或用于体外实验来观测它们

10、的代谢过程。这些研究证实代谢是一个很活跃的过程，细胞内大部分复合物都在不停地合成和降解。 21五.分析生化反应的总体策略 ： 整体动物水平观察和推论某种生化反应或代谢途径的存在 将它定位于一个或多个器官 定位于一个或多个细胞器或亚细胞组分 纯化该反应的底物、产物、酶和辅因子及其它成分 确定该反应的体外控制机制 分析该反应的体内调控机制 体内外重建该反应 。22六六.生化研究技术的进步：生化研究技术的进步： 生命科学研究的主要目的在于获得最新的基础信息，例如纯化和鉴定新发现的酶及其功能，生物化学与分子生物学新技术、新方法不断涌现，为生命科学研究工作者提供了有用的工具。23 1.细胞器及生物分子的

11、分离与纯化： 研究细胞器及生物分子的结构与功能及其代谢和作用机制，必须从组织或细胞中分离出这些生物分子或亚细胞复合物。24基本技术：匀浆离心层析电泳25 1）匀浆: 破坏细胞或组织的固有结构，使 细胞破裂而释放胞内容物 。方法: 化学(酶消化)、物理(超声)或机械(碾磨)。要求: 保持生物分子或亚细胞结构的完整性。措施: 合适pH值、合适离子强度、缓冲液、 低温(0 4 ) 、短时间、蛋白酶抑 制剂、核酸酶抑制剂。26 使样品绕离心机转轴的中心旋转而获得一个 远大于地球重力的沉降应用力，样品介质中 不同大小、形状和密度的颗粒将以不同的速 度沉降。影响因素: 离心力(转速及颗粒与中心轴的 距离)

12、，颗粒的大小、形状、密 度，介质的粘度。 2）离心：27低速离心: 6 000 r/min 、室温， RCF (相对离心力)6 000 g 。高速离心: 6 000 25 000 r/min 、低温， RCF = 6 000 60 000 g 。超速离心: 25 000 r/min 、低温 + 真空， RCF = 60 000 600 000 g 。差速离心: 连续用几种递增的离心速率离心。密度梯度离心: 样品中不同组份在离心力场的 作用下停留于相应密度的支持物 层面。类型:28 根据样品中各组分物理生化特性、分子大小形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性或亲和性等的不同而将它们分离。 类型:

13、 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤、疏水相互作用层析、亲和层析、共价层析和金属螯合层析。 3）层析（色谱分析）：29 常用层析法: 薄层层析和纸层析； 柱层析； 高效液相层析 ； 气相色谱。30 薄层层析和纸层析: 将样品点在薄层或纸(支持基质又称层析床或固定相 )的一端，展层剂(流动相)沿着薄层或纸向上展开并带动样品中的物质迁移。 相对迁移率: Rf = 组分移动距离/溶剂移动距离； Rx = 待测物移动距离/标准物移动距离。 31 柱层析: 将样品从装有固定相的柱顶部加入，然后在重力或蠕动泵的作用下使流动相过柱并带动样品中的不同组分进入固定相，样品中各组分在固定相中会形成不连续带

14、型，继而用流动相洗脱，分别收集各时间段流出的洗脱液进行定量或定性分析。 3233 4）电泳： 根据带电荷的物质在电场中移动的原理而分离、分析复杂混合物及纯化、鉴定离体生物分子。 影响因素: 分子所带的净电荷量、分子的形状与大小及电场强度。 34 电泳支持物:惰性支持物(如醋酸纤维素) : 仅提供物理支持，分离效果取决于电荷密度 。 多孔支持物(如Agarose、PAG) :同时利用了分子筛效应，分离效果取决于电荷密度和分子大小及形状。 35 电泳缓冲系统: 连续缓冲系统: 样品、凝胶和缓冲液含有相同的缓冲离子， 具有相同的pH值。 非连续缓冲系统: 凝胶及缓冲液中的缓冲离子和pH值均不同。36

15、 常用电泳技术:基本电泳等电聚焦毛细管电泳双向电泳37基本电泳:纸电泳、醋纤膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。3839等电聚焦:在pH梯度下进行。pH梯度由结构类似的小分子量两性电解质形成，等电点(pI)在pH 310之间。当存在外加电场时，每一种两性电解质向其pI值处移动而形成稳定的pH梯度。电泳过程中每一种带电分子都朝自己的pI位置移动而被分离。40 毛细管电泳: 毛细管电泳的特点在于分辨力高和应用范围广，可以分析极少量的样品(5 nl10 nl)。较常应用的有毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦。41 双向电泳双向电泳是一种分辨力极高的电泳技术，目前广泛用于基因表达谱

16、及蛋白质组学分析，可一次性分离1000多种蛋白质。第一向:根据蛋白质所带的电荷而进行等电聚焦。第二向:利用样品分子的相对分子质量不同，在另一方向上进行SDS-PAGE。42432D gel in proteomics44点匹配结果: 实验组和对照组蛋白点匹配图452.生物分子的分离与纯化：1）蛋白质纯化；2）DNA提取；3）RNA提取；4）糖类提取；5）脂类提取。46 1）蛋白质纯化:目的: 确定蛋白质的结构、功能及结构与功能的关 系；研究酶的动力学及其调节；药用成份的 分离与鉴定。方法: 匀浆、离心、电泳、过滤、层析、抽提、透 析等。要求: 合适的缓冲体系、低温、蛋白酶抑制剂。浓度和质量检测

17、: 分光光度法、PAGE 。47 2）DNA提取:原则 : 保持核酸一级结构的完整性。 去除杂质，保证核酸足够纯。步骤： 破膜 释放出目的核酸。 分离 通过酶、有机溶剂、调节pH 值、离心等手段得到粗制品。 纯化 进一步去除杂质。浓度和质量检测: 分光光度法、 Agarose凝胶电泳。 48基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱M: DNA/HindIII 分子量标准，泳道14分别代表4个不同样品的基因组DNA49 3） RNA提取:哺乳动物细胞总RNA主要由rRNA(80%-85%)、tRNA和核内小分子RNA (10%-15%)、mRNA(1%-5%)组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细

18、胞质中。注意事项: 使用RNA酶抑制剂； 防止污染。 50总RNA和mRNA的琼脂糖凝胶（1）电泳图谱51七. 生物分子的结构与功能分析： 1. 蛋白质结构分析 2. 酶活力检测 3. 蛋白质组学分析 4. DNA序列分析 5. 聚合酶链反应（PCR）6. 分子杂交 7. 基因克隆 8. 基因组文库构建 9. cDNA文库构建 10. 文库筛选 11. 报告基因检测 12. 基因芯片 13. 基因敲除 14. RNAi15. 转基因动物 52分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端的氨基酸残基测定多肽链的氨基末端与羧基末端的氨基酸残基把肽链

19、水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。基酸顺序的结果。1. 蛋白质结构分析:53通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因测定测定DNA序列序列排列出排

20、列出mRNA序列序列54 2. 酶活力检测: 酶是一类加快特定生化反应速度的球蛋白。在底物浓度、pH值及温度等适宜的条件下，每种酶控制着一些结构相似的底物生成产物。 酶活性单位(SI单位)：在最适条件下，一秒内将1 mol底物全部转化为产物所需的酶量。 55 3. 蛋白质组学分析: 一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome)。蛋白质是基因功能的实施者，对蛋白质结构、定位和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将为阐明生命现象的本质提供直接的基础。 方法: 二维电泳、质谱技术、蛋白质芯片等。 56 4. DNA序列分析: DNA序列分析(DNA sequencin

21、g)即测定DNA链中四种核苷酸(碱基)的排列顺序。 测序反应使用特异引物与单链DNA模板结合，由DNA聚合酶催化引物延伸，当遇到双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)时即发生碱基特异性链终止，引物延伸合成的新链DNA即是待测DNA模板的互补链。 57 5. 聚合酶链反应（PCR）: Polymerase chain reaction（ PCR）技术是利用DNA 聚合酶在体外条件下，催化一对引物之间特异DNA片段合成的基因扩增技术。 PCR包括三个基本过程： 变性； 退火； 延伸。 这三个过程组成一个循环周期,每个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板，如此循环往复，目的DNA片段的拷贝数呈指数形式扩增

22、。 58在在DNA变性后的复性过程中，如果将不变性后的复性过程中，如果将不同种类的同种类的DNA单链分子或单链分子或RNA分子放在同一分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成成杂化双链杂化双链(heteroduplex)。6. 分子杂交分子杂交(hybridization) 59DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子60 Southern印迹

23、杂交 : 利用琼脂糖凝胶电泳将经限制性核酸内切酶消化的DNA片段分离，并使这些DNA片段在凝胶原位经碱变性处理后, 从凝胶转移至一固相支持物上，再与标记的核酸探针杂交，经检测确定膜上与探针互补的电泳区带位置。61 Northern印迹杂交 : 用于检测组织、细胞中某基因的表达状态和表达水平。 基本原理和方法与Southern印迹杂交相似: RNA在琼脂糖凝胶中电泳分离后，被转移至尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，然后与标记的DNA或RNA探针杂交。62 Western免疫印迹: 基本过程与Southern 印迹杂交和Northern印迹杂交十分相似，都是由凝胶电泳、转膜、杂交和信号显示等步骤组成。不同

24、之处是Western免疫印迹检测的是蛋白质，使用的凝胶是SDS聚丙烯酰胺凝胶, 所用的探针是蛋白质抗体。 63 7. 基因克隆: 用酶学方法将不同来源的DNA分子在体外进行剪切和重新连接，组装成一个新的DNA分子。在此基础上，将这个DNA分子导入到一定的宿主细胞，使它能够在宿主细胞中扩增，形成大量的子代分子，此过程即称为基因克隆(gene cloning)。 64基因克隆包括四个基本技术环节： 目的基因和载体的获得； 目的基因与载体连接，形成重组分子； 重组DNA分子导入宿主细胞； 含有重组DNA分子的细胞的筛选和扩增。65 8. 基因组文库构建: 基因组文库(genomic DNA libr

25、ary)是含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群体。 提纯染色体DNA，通过机械剪切或酶切使之成为一定大小的片段，并与适当的载体DNA连接和转染宿主菌，得到一组含有不同DNA片段的重组分子。 66 9. cDNA文库构建: cDNA是指以mRNA为模板，由逆转录酶催化形成的互补DNA（cDNA），其核苷酸序列完全互补于模板mRNA链；再以cDNA为模板，由DNA聚合酶合成第二链，得到互补双链DNA。 67 将双链cDNA产物与载体（质粒或噬菌体）DNA重组，并转化到宿主细菌或包装成噬菌体颗粒，得到重组克隆混合体。每个克隆含单独一种cDNA (mRNA)分子，克隆总和则包含细胞的全部mR

26、NA信息。 cDNAcDNA文库文库(cDNA(cDNA library): library):68 10. 文库筛选: 文库筛选方法： 核酸分子杂交、免疫学方法等。 通过文库筛选，可以获得全长基因、分离出对应稀有mRNA的cDNA片段及鉴定目的重组子等。 69 11. 报告基因检测: 报告基因(reporter gene)是指那些表达产物容易被检测的基因。利用基因重组技术，将待检测的DNA片段插入报告基因表达载体中报告基因的上游，然后转染合适的细胞并表达，通过测定报告基因的表达产物，即可推测出该DNA片段在基因表达调控中的作用。 70 12. 基因芯片: 基因芯片(gene chip)是九十

27、年代中期发展起来的一项前沿生物技术，它融合了生命科学、化学、微电子技术、计算机科学、统计学和生物信息学等多学科的最新技术。71DNA芯片（芯片（基因芯片） 将大量的已知的DNA片段作为探针，有序地、高密度地排列在玻离、硅等载体上。 将待测样品用荧光标记物标记，并与DNA芯片进行分子杂交后进行信号检测。通过对芯片扫描获得荧光标记杂交信号图谱。72 芯片设计 73目目 录录7475 13. 基因敲除: 基因敲除（gene knock out），类似早期生理学研究的三部曲: 切除部分观察整体推测功能。 gene knock out是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除

28、，或用其它序列相近基因取代，然后从整体及分子水平观察实验动物，推测相应基因的功能。 76基因敲除的技术路线： （1）构建重组基因载体。（2）用电穿孔、显微注射等方法将重组DNA转入受体细胞核内。（3）用选择培养基筛选已击中的细胞。（4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。77 siRNA (small interfering RNAs： 2123核苷酸长的核苷酸长的 dsRNA小片段小片段 ) 14. RNA interference双链双链RNA对基因表达的阻抑作用被称为对基因表达的阻抑作用被称为RNA干预干预（RNA interference, RNAi），是发生在转录后水平），是发生在转录后水平的基因沉默。的基因沉默。 78安德鲁法尔(Andrew Fire， 1959年)， 美国斯坦福医学院病理学和遗传学教授克雷格梅洛(Craig C. Mello, 1960年)，美国马萨诸塞州大学医学院分子医学教授。79RNA干扰过程图干扰过程图 80 特异性降解同源mRNA，具有传递性（细胞间传递及生物个体代间传递）。 RNAi的特征 81 RNAi研究被Science杂志评为2001年的十大科学成就之一； RNAi研究被列为2002年Science杂志评的十大科学成就之首； RNAi研究被授予