大肠杆菌培养感受态制备质粒转化及鉴定

1、大肠杆菌的培养1. LB培养基配制：（液体培养基） 取1L的烧杯，加入适量的一蒸水（v 1000ml）,称取胰蛋白月东10g ,酵母提取物5g , Nacl10 g倒入烧杯中 加入磁子搅拌，至完全溶解 用NaoH调PH=7.0,定容至1L 分装后高压蒸汽灭菌（固体培养基） 在液体培养基的基础上加入琼脂糖：1L液体培养基15g琼脂糖（用水先溶解） 在电炉子上边加热边搅拌至煮沸溶解 分装后高压灭菌抗生素的加入温度要求：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55 C的水浴中，待培养基温度降到55 C时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。注意事项： 电炉子温度不要太高，烧杯

2、直接加热时电炉子上要加石棉网高压灭菌时，瓶盖上要插上针头，防止灭菌时瓶盖喷出2. 倒平板：培养皿要提前进行灭菌、 烘干，在超净工作台里，打开酒精灯，在酒精灯的火焰旁进行操作，倒完后做好标记3. 接种（平板划线分离法）：接种环挑取大肠杆菌进行接种：图式：注意：每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。4. 37°恒温培养箱培养：接种好的培养皿正置 15分钟，然后倒置放入培养箱过夜培养倒置培养原因：恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸汽的形式蒸发，倒置培养皿则会使水蒸汽凝结成水滴留在盖上。如果正方，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成

3、单菌落，达不到分离目的。大肠杆菌感受态的制备及转化感受态：细菌处于容易吸收外源 DNA的状态叫感受态。转化：是指质粒DNA以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。一、制备：步骤从大肠杆菌DH&的培养平板上挑取一个单菌落接于2mLLB液体培养基的试管中，37C振荡培养过夜。以1%勺接种量将以上过夜培养物接种于液体培养基中I37 C振荡培养23hI将菌液转移到 50mL离心管中，冰上放置 10minI4000rpm,离心10min回收细胞I倒出培养液，将管倒置 1min以便培养液流尽I用冰冷的0.1mol/L CaCl 2 10mL悬浮沉淀I立即放在冰上保温 30minI4C, 4000rp

4、m,离心10min,回收细胞I用冰冷的0.1mol/L CaCl 2 2mL悬浮细胞（务必放冰上）分装细胞，每200 l 一份。此细胞为感受态细胞。、转化：步骤：在200 l新鲜配制的感受态细胞中加入质粒DNA2 l（ < 50ng）,混匀同时做以下对照管（受体菌对照：200 l感受态细菌+2 l无菌水质粒对照：200 l 0.1mol/L CaCl 2 溶液+2 l质粒）I冰上放置30minI将管放到42 C循环水浴热冲击 90sI取出，迅速冰浴2minI每管加800 l LB液体培养基，37 C慢摇复苏1h取50 l已转化的感受态细胞或对照样品，各分别涂在含有或不含有氨节青霉素的培养

5、皿中待吸干菌液后，倒置培养皿，于37C培养过夜次日在含氨节青霉素的培养皿上长的菌落即为含有质粒的大肠杆菌（即转化成功）质粒dnA勺提取1. 溶液：溶液 I : 50 mmol/L 葡萄糖 、25 mmol/L Tris（ pH=8.0）、10 mmol/L EDTA溶液 n : 0.4mol/L NaoH、2% SDS溶液m： 5mol/L 醋酸钾（KA©： 60ml、冰醋酸：11.5 ml、H2Q 28.5 ml2. 步骤：在锥形瓶中加入100mL液体培养基，向培养基中加入100ul氨节青霉素I挑取单菌落接种于锥形瓶中，37 C培养过夜I次日，取1.5ml培养物于EP管中，4000

6、rpm离心2min吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥将细菌沉淀悬浮于 100ul溶液I中，充分混匀，室温放置10minI加200ul溶液n （新鲜配制），盖紧管皿，轻柔混匀混合物，冰上放置5minI加入150ul预冷的溶液山，盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置 15minI12000rpm离心15min,将上清转移至另一 EP管向上清中加入等体积的氯仿（去蛋白），反复混匀，12000rpm离心5min,将上清转移至另一 EP管I向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，室温放置510min,12000rpm离心5min ,倒去上清液，把 EP管倒扣在吸水纸上，吸干液体I用1ml70%醇洗涤质粒 D

7、NA沉淀，震荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥加入20ul TE缓冲液或无菌水，溶解 DNA -20 C保存3. 注意事项： 在混匀时，不能剧烈震荡，动作一定要轻柔。 氯仿抽提完，转移上清时，一定不要吸到中间蛋白层，宁少勿多。质粒DNA勺鉴定琼脂糖凝胶电泳检测DNA步骤：1.制备琼脂糖凝胶电泳：在锥形瓶中加入45 ml 0.5 X TBE缓冲液，称取0.45g琼脂糖放入锥形瓶中，置微波炉中 2min,中火加热至完全熔化，取出摇匀，则为1%勺琼脂糖凝胶。2. 待琼脂糖凝胶冷却至 70C时，加入10ul漠化乙锭(Eb)3. 取有机玻璃内槽， 洗净晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好，

8、一定要封严，放 好梳子4. 将冷到60 C琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的 胶面(注意不要形成气泡)5. 目视凝胶凝固后，再过半个小时，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内，加入0.5 X TBE缓冲液至电泳槽中，加至液面刚没过胶板约1mm6. 加样：将buffer (染料)与被测 DNA昆合，用移液枪将样品加入到梳子孔中，对照滴在 最下面的孔7. 电泳：接通电源，调节电压120V、电流80mA8. 观察结果：在将胶板放在紫外灯下，连接电脑，拍照。氨节青霉素 (ampicillin ) (100mg/ml)溶解1g氨节青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。

9、分装成小份于-20 C贮存。常以25ug/ml50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。愈节青霉素 (carbenicillin ) (50mg/ml)溶解0.5g愈节青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20 C贮存。常以25ug/ml50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。甲氧西林 (methicillin ) (100mg/ml)溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20 C贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨节青霉素一起添加于生长培养基。卡那霉素 (kanamycin ) (10mg/ml)溶解100mg卡那霉素于足量的

10、水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20 C贮存。常以10ug/ml50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。氯霉素 (chloramphenicol ) (25mg/ml)溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20 C贮存。常以12.5ug/ml25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。链霉素 (streptomycin ) ( 50mg/ml)溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20 C贮存。常以10ug/ml50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。荼嚏酮酸 (nalidixic acid ) (5mg/ml)溶解50mg荼嚏酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20