发酵罐操作与发酵过程中主要生化指标测定

1、小型发酵罐的使用与发酵过程中主要生化指标测定华南农业大学为研究小型发酵罐分批培养过程中大肠杆菌的菌体生长状况，本实验以分批培养法培养大肠杆菌，通过控 制发酵过程的温度、溶氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等参数，并每小时取样测OD值和还原糖量，制作菌体生长曲线，以此判断大肠杆菌的生长发酵状况。结果表明大肠杆菌在发酵的前三个小时处于生长 延迟期，发酵36小时为对数生长期，发酵 6小时后该菌开始进入平衡期，第8小时时结束发酵实验。发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大，均用钢板或不锈钢板制成；供实验室使 用的小型发酵罐，其容积可从约1L至数百升或稍大些。一般来说，5L以下是用耐压玻

2、璃制作罐体，10 L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备1。在当今市场上，各厂家生产的发酵罐会有所差别，但基本原理是相同的，基本结构是类似的。本实验使用 的是BIOTECH-7BGZ发酵罐，其结构主要又罐体和控制器两大部分组成，罐体为一硬质玻璃圆筒，底和 顶两端用不锈钢板及橡胶垫圈密封构成，容积为5L,顶盖上有多个孔口，分别是加料及接种口补料口、放置DO （溶解氧）电极口、放置 pH电极口、放置消泡电极口、放置取样管口等2;本罐可配置不同性能的控制器，控制器能完成最基本的功能，它由下

3、列几部分构成：参数输入及显示装置，用以输入控制发酵条件的各种参数及显示发酵过程中罐内培养液的温度，pH、DO （溶氧）的测定数值。碱泵和酸泵分别用以向发酵罐加入碱液和酸液以调节培养液中的pH;消泡剂加入泵用以向发酵罐加入消泡剂，以消除发酵过程中产生过多的泡沫。自动或人工控制按钮用以决定本控制器是处在自动控制或人工控制状态。电极连接导线：有三条连接导线，分别与 pH、DO和AF （消泡）电极连接。1 .材料与方法1.1实验材料1.1.1菌种大肠杆菌（E.coil ）1.1.2培养基配方种子培养基：葡萄糖1.0g，蛋白月东1.0g，酵母膏0.5g，牛肉膏1.0g，氯化钠0.5g，水1000mL ,

4、 pH7.0。发酵培养基：葡萄糖 20g，蛋白腺10g，酵母膏5g,牛肉膏10g,氯化钠5g ,氯化铉5g ,水1000mL , pH7.0。1.1.3仪器设备BIOTECH-7BGZ发酵罐一套（配套蠕动泵、pH电极、溶氧DO电极、空压机及所有连接管）、光光度计、 旋转式摇床、离心机、冷藏箱、滴点装置、电子天平、电磁炉等。1.1.4用具烧杯、三角瓶、量筒、保鲜膜、玻璃棒、比色杯、试管、离心管、移液管、波珠等。1.1.5试剂 泡敌、斐林试剂、0.1%标准葡萄糖溶液、40%氢氧化钠等。1.2实验方法1.2.1菌种准备1.2.1.1配制种子培养基 配制种子固体培养基100mL，分装试管，0.1MPa

5、 (121 C)灭菌20min ,然后摆成斜面。配制种子培养液500mL，各分装50mL于两个250mL三角瓶中(作一级种子瓶)，余下的培养液装进 三个500mL的三角瓶中(作二级种子瓶)， 0.1MPa (121 C)灭菌20min。1.2.1.2接种与培养 上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜面，37 C培养24h。 上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子瓶，37 C振荡(125r/min )培养12h，然后转接二级种子瓶，37C 振荡(125r/min )培养 10h。1.2.2上罐前的准备及实罐灭菌洗净发酵罐及各联接胶管。配制发酵培养基4000ml ,置发酵罐内，视情况加入几滴泡敌。 安装好

6、发酵罐，把取样管、电极插口、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后，开夹套溢流口V2、进水阀 W1 ,使夹套充满水。用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4,启动蒸汽发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min ,开启冷凝水出水阀 V1 ,开进水阀门S1 ,进行在位灭菌。 将灭菌温度设为115 C，保温时间0.33h,设为自动。当达到 795s时，灭菌温度达到121 C。 灭菌结束后，不打开保护罩，使发酵罐自然冷却至室温。用75%酒精消毒pH电极和DO电极，接入发酵罐，连接各电极导线。 流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使胶管内充满液体

7、，将输 出上限设为15%,下限设为0,待一切准备就绪，将 手动”开关调节到 自动”状态。设定搅拌转速为 300r/min，空气流量23L/min、pH7.0、DO100% ,系统进入发酵状态。1.2.3发酵操作当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，取样(用于接种前培养基成分分析)：松开弹簧夹J2,用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧J2,将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹 J3,发酵液被压入接料瓶，开J2、J3排出取样管内残料，夹紧 J2、J3o 接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口，点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入二级种 子，然后旋紧接种盖，移取火焰圈。接种后立即进行第

8、一次取样，用于测定细菌OD值。1.2.4发酵管理控制发酵过程的各项参数(温度、PH、溶解氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等)，如参数出现异常现象，则应及时排除。每小时取一次样，每次取样 50ml。取样时先将空气流量计旋钮调至 01L/min，松开弹簧夹J2,用无菌 空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧 J2,将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹 J3,发酵液被压入 量筒，当达到40mL,开J2排出取样管内残料，夹紧 J3、J2。将样液入标记有取样时间的三角瓶，用保 鲜膜封口，立即入冰箱冷藏，取完样要及时清洗量筒。 每次取样前（每隔1小时）记录发酵过程温度、PH值、DO、通风、转速的测定数值，并

9、记录操作情况。1.2.5发酵过程中各生化指标的测定1.2.5.1 测定OD值 大肠杆菌标准曲线的绘制：取 10mL离心管，与105 C烘2h至恒重，用镶子夹取入干燥器，待冷却后 于分析天平上称重（W0 ）,精确到小数后 4位，然后准确取10mL发酵液，于3000rpm离心10min ,弃 去上清液，用蒸熠水洗涤沉淀，同上离心，弃上清液，与 100 C烘至恒重，用镶子夹取如干燥器中冷却， 于分析天平上称重（W1 ）,精确至小数后4位，得细胞干重为 W1-W0。取同一发酵液，稀释 2、5、10、 20、50倍，于600nm下测OD值。以0D值为纵坐标，菌液浓度（g/L）为横坐标，绘制标准曲线。均匀

10、取样品5mL于编号试管中，用空白发酵液稀释至一定浓度，在 721分光光度计上测定 A600 ,根 据菌体浓度与吸光度之间关系地标准曲线换算出菌体浓度。其余发酵液于3C, 2000r/min条件下离心分离8min,上清液装入编号三角瓶，用于测糖。1.2.5.2测定葡萄糖 样品处理：用蒸熠水对样品液进行稀释待用。标定碱性酒石酸铜溶液：分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL, 加入玻璃珠2粒，混匀，从滴定管滴加约 9mL葡萄糖标准溶液，控制在 2min内加热至沸腾，趁沸以每 2 秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准

11、溶液的总体 积，同时平行操作三份，取其平均值，计算每 10mL （甲、乙液各5mL）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖 的质量（mg）。样品溶液预标定：分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于 150mL锥形瓶中，加水10mL ,加入玻璃珠2粒，混匀，控制在 2min内加热至沸腾，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管滴加样品溶液，并 保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒 1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录 样液消耗体积。 样品溶液测定：分别吸取 5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于 150mL锥形瓶中，加水10mL ,加 入玻璃珠2粒，混匀，从滴定管滴加比预滴定体积少1mL的

12、样品溶液，使在2min内加热至沸腾，趁沸继续以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，同 法平行操作3份，得出平均消耗体积。结果计算：式中：c 葡萄糖标准溶液的浓度， mg/mL ；V标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL ;V1 测定时平均消耗样品溶液体积，mL ;N 被测样品稀释倍数。1.2.6放罐发酵8小时后，测OD值及还原糖量，当发酵液的 PH不断上升且为碱性、OD值增长缓慢，且还原糖 量很低时，可判断发酵结束，准备放罐。 放罐操作同取样。将全部发酵液取出后，100 C煮沸10分钟灭菌，灭完菌的发酵液可排放入下水道。1.2.7清洗 放罐完毕

13、后，打开自来水进水口，往发酵罐中注满水，同时开动搅拌轴搅动清洗五分钟，排水。 再次注入自来水清洗，操作如 1。 清洗结束，关闭电源。2.结果与分析2.1实验结果2.1.1发酵过程数据结果每小时记录发酵过程温度、PH值、DO、通风、转速的测定数值，结果如下表：表1发酵过程各参数值时间发酵时间h温度CpH值DO%通风L/min转速r/min取样mL空白377.01002-33002008:300377.0109.02-3300509:30136.96.98124.12.53045010:30236.86.97115.62.53035011:30336.96.9244.02.83035012:304

14、36.96.7446.23.03035013:30537.06.7243.42.03035014:30637.06.9442.12.03035015:30736.97.3938.92.03035016:30836.98.0637.12.030350取完最后一次样品后放罐 大肠杆菌标准曲线绘制如下所示：下表2为所测菌液浓度与 OD值间的关系表。表2菌液浓度与OD值的关系表干菌体浓度（g/L）1.1600.5800.2320.1160.0580.0232测得OD值1.4310.7710.4810.2690.1270.043根据表2得到两者的关系曲线图1 ,如下图：图1 菌液OD值与干菌体浓度关系图

15、得大肠杆菌干菌体浓度 x与菌液OD值y之间的关系为：y=0.8433x-0.0773则 x=（y+0.0773）/0.8433测定不同时间发酵液的OD值，确定对应时间的菌液浓度，结果如下表:表3发酵液OD值与菌液浓度关系表发酵时间（h）发酵 液（mL）空白培养基（mL）稀释度OD值（y值）x=(y+0.0773)/0.8433干菌体浓度（g/L ）0501倍0.0790.1850.1851501倍0.2550.3940.3942501倍0.6320.8410.8413145倍0.4330.6053.024145倍0.7500.9814.9051910倍0.7290.9569.5661910倍0

16、.8721.1311.371910倍0.8991.1611.681910倍0.9301.1911.9测定不同时间发酵液的葡萄糖浓度，结果如下表:表4培养液中葡萄糖含量表编号0123456、7、8空白稀释倍数/倍1815121063消耗体积/mL19.177.795.856.084.534.179.5129.017.705.996.014.674.209.28319.41996.16.0914.564.119.6/mL平均消耗体积09.207.816.06674.584.179.4g/L还原糖含量/5318.2118.9118.6315.4312.06.82.1.2数据整理及分析由于pH值、DO

17、值、干菌体浓度（g/L ）、葡萄糖浓度（g/L）等数据的数值范围相差较远，难以在同一 个坐标图中综合分析，故根据发酵过程中，表 1的pH值、DO值，表3的干菌体浓度（g/L）,表4的葡萄糖浓度（g/L）等数据结果，整理成下表：表5发酵过程各参数数据表发酵时间hpH 值（X0.1 ）DO值%干菌体浓度（0.1） g/L葡萄糖浓度（X1/6） g/L0701091.85111.18169.8124.13.94109.23269.7115.68.41113.46369.24430.293.78467.446.24974.58567.243.495.640.8669.442.1113773.938.9

18、116880.637.1119根据上表，以发酵时间h为横坐标，以pH值（0.1）、DO值、干菌体浓度（0.1 ） g/L、葡萄糖 浓度（X1/6） g/L等为纵坐标，绘制发酵过程中各参数的变化规律的坐标图，观察并分析其变化规律，从而得到发酵过程中大肠杆菌的生长情况和培养基的利用情况。注：由于6、7、8号样品中蛋白质含量较多，而葡萄糖较少，用直接滴定法难以滴定，因此 6、7、 8号样品不予测定和做分析。下图为发酵过程中各参数的变化规律曲线图：大肠杆菌经过8个小时的分批发酵培养，发酵过程中pH值（冲.1 ）、DO值、干菌体浓度（冲.1 ） g/L、葡萄糖浓度（X1/6 ） g/L等参数的变化规律曲

19、线如图所示，可以分为3个阶段：第一个阶段：大肠杆菌生长的延迟期是0h到2h。可以从曲线图看出：在该阶段内，DO值曲线较原始DO值上升了一点，但幅度不大，基本还是维持在原始DO值的附近值内，葡萄糖浓度曲线和干菌体浓度曲线平缓，无明显变化，即大肠杆菌利用葡萄糖发生发酵的呼吸作用低，说明大肠杆菌还在适应发酵环境。第二个阶段：大肠杆菌生长的对数生长期是 2h到6h。可以从曲线图看出：在 2h到3h内，DO值急剧下 降，说明大肠杆菌快速生长，需氧量急剧上升，直至 3h到6h内，DO值在40%50%的范围内变化，大 肠杆菌代谢能力持续在高水平上，需氧量也相对地维持在高水平范围内 ；葡萄糖浓度曲线在2h后就

20、急剧下 降，大肠杆菌在代谢过程中，利用葡萄糖含量大幅度上升；干菌体浓度曲线在2h到6h内急剧上升，大肠杆菌代谢旺盛，菌体快速生长，细菌很少死亡或不死亡，增长速度呈对数生长。第三个阶段：大肠杆菌生长的稳定期是6h后。可以从曲线图看出：6h后，菌体浓度曲线趋于平缓，此时生长速率下降，死亡率上升，细胞数达到最大值，新生的细菌数和死亡的细菌数相当；而DO值在30%左右，是由于菌体数达到最大值，仍然需要大量供氧来代谢生长。由于葡萄糖浓度在6h后极低，合成蛋白质多，在滴点时生成大量气泡，无法测得，故不予讨论。由于实验发酵时间有限，无法完成整个发酵过程，故不能得到大肠杆菌生长的衰亡期。总体上看，大肠杆菌的分

21、批发酵培养过程，在限制性条件下的生长，经历了延迟期、对数生长期、稳定期 和衰亡期。在发酵过程中，pH值的影响也是不可忽视的。pH值影响基质水解、酶活性、代谢方向，pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。若不控制pH值，在发酵过程中，葡萄糖的代谢分解成酸和醇，使pH下降，氮的代谢和产物的酸性也会使pH下降，从而影响发酵效果，故应严格控制好pH,该实验中pH控制在7.0。由pH值曲线图可以看出，在 6h前，pH严格控制在7.0左右，菌体正 常发酵生长，6h后，pH值开始上升，说明菌体开始自溶，细胞死亡。温度对发酵的影响：温度通过影响微生物的酶反应速度、发酵液中溶解氧而影

22、响发酵；温度还能影响酶系 组成及酶的特性、以及生物合成方向；温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基 质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制，可根据大肠杆菌菌种的生长阶段和培养条件综合考 虑，以及发酵大肠杆菌的长期经验考虑，设定该实验发酵大肠杆菌的最适温度是37 C，从表1可以看出，温度已严格控制在最适温度要求范围内。在发酵过程中，通风和搅拌的剧烈程度影响着泡沫的形成。通风和搅拌程度小，会使发酵液的溶氧量下降， 影响后续发酵，通风和搅拌程度大，则易生成泡沫，而增加染菌的机会，使菌体提早自溶，导致菌体产量 下降，故应严格控制通风和搅拌的程度，该实验中，通风量是23 L/min，搅拌器的转速是303 r/min 。综合分析，在发酵过程中