锌指蛋白的设计与利用-文档资料

1、1锌指蛋白的设计锌指蛋白的设计与利用与利用生物技术三班生物技术三班蒋新培蒋新培邮箱邮箱:2l摘要：人工设计的锌指蛋白一般包括两个结构域：DNA结合结构域和效应结构域。DNA结合结构域主要采用对DNA序列特异识别结合的C2H2型锌指结构域，而功能结构域常常采用某些转录激活结构域、转录抑制结构域或某些酶的活性结构域。这样进行设计的锌指蛋白就可以在特定的核酸序列上行使相应的功能，这对于目的基因的表达调控及蛋白质与核酸的相互作用研究提供了新的思路。3主要内容主要内容v锌指结构v锌指的设计筛选v多锌指之间连接区的设计v人工锌指蛋白的应用v展望 具有重复结构的氨基酸模式，每个重复的“指”状结构约含23个氨

2、基酸残基，锌以4个配价键与4个半胱氨酸、或2个半胱氨酸和2个组氨酸相结合。 相隔特定距离的半胱氨酸结合锌指，能与某些RNA/DNA结合。56锌指结构锌指结构v在在1989年年Lee等揭示锌指立体结构具有保守等揭示锌指立体结构具有保守型，每个锌指均是由型，每个锌指均是由1对反平行的对反平行的折叠和一折叠和一个个螺旋组成，每一个锌指结构都形成独立的螺旋组成，每一个锌指结构都形成独立的包含锌原子的小结构域包含锌原子的小结构域,它通过它通过2个保守的个保守的His和和2个个Cys螯合一个锌因子螯合一个锌因子,从而使结构更加从而使结构更加稳定。稳定。 v锌指结构的共同特征是通过肽链中锌指结构的共同特征是

3、通过肽链中氨基酸氨基酸残残基的特征集团与基的特征集团与Zn2+的结合来稳定一种很短的结合来稳定一种很短的，可自我折叠成的，可自我折叠成“手指手指”形状的的形状的的多肽多肽空空间构型。间构型。 789 9锌指蛋白锌指蛋白 2 21313个手指，各由个手指，各由2323氨基酸组成，并氨基酸组成，并由由7 78 8个氨基酸连接；与个氨基酸连接；与 DNADNA大沟结大沟结合并环绕合并环绕DNADNA分子，大沟与特异分子，大沟与特异DNADNA碱碱基互作。基互作。 锌指蛋白大多都是与锌指蛋白大多都是与基因表达基因表达的调控有的调控有关的功能蛋白。关的功能蛋白。1011 锌指的设计筛选锌指的设计筛选在锌

4、指结构中，只有-螺旋中的几个氨基酸残基对DNA的特异性识别有作用。因此通过构建锌指的噬菌体展示库，从中可筛选与特定DNA序列有高特异性与高度和力的锌指。Rebar和Choo就分别建立了鼠转录因子Zif268的第二个锌指结构中-螺旋残基的随机肽展示库4，5。，用随机三联体碱基进行三轮筛选，得到了与不同三连体碱基对相应结合的64个锌指序列，结果发现：-螺旋的三个主要位（-1、+3、+6位）和一个辅助位+2位与DNA的识别密切相关。12Zif268 Zif268是Milbrandt及Lim等分别于1987年克隆发现的.其包括一内含子序列和两个外显子序列，基因全长为3.8kb.Zif268编码一分子质

5、量为61ku的蛋白质Zif268.131416 多锌指之间连接区的设计多锌指之间连接区的设计l（1）采用具有柔韧性的连接区，使锌指对所结合DNA亲和力与特异性有所提高。l（2）把天然转录因子的二聚化区域作为连接区。l总之设计多锌指蛋白时应考虑到锌指之间的连接区，这对于锌指蛋白对所结合DNA特异性与亲和力是重要的。17人工锌指蛋白的应用 （1）人工设计的转录抑制 （2）转录激活子 （3）人工限制性内切酶 18人工设计的转录抑制子 人工设计的锌指蛋白可以通过以下方式抑制基因的转录： n（1）特异性的锌指与转录抑制结构域相连形成的融合蛋白。n （2）设计靶向转录区域的锌指蛋白，抑制转录的延伸； 19人工设计的转录抑制子n（3）设计靶向转录起始区的人工锌指蛋白，阻断或抑制转录起始复合物的装配；n（4）靶向目的基因转录增强子结合的区域设计的锌指蛋白，从而抑制基因的转录。 20人工转录激活子主要通过以下两种方式实现：（1）锌指与转录激活结构域连接形成融合蛋白，通过促进转录复合物的装配激活基因的转录。（2）通过与转录抑制子对基因上游结合的竞争，从而激活基因的转录。212222展望 C2H2型锌指为DNA序列特异性锌指蛋白的设计提供了一个很好的框架，通过噬