不同钛合金表面形貌对成纤维细胞生物学行为的影响

1、# 实用 口腔医学杂志 J Pract Stomato)2014 Mar,30 2)?1994-2015 Chirta Academic Journal Ekerronic Publishing House. A1 rights rtsserved. httpLnet# 实用 口腔医学杂志 J Pract Stomato)2014 Mar,30 2)?1994-2015 Chirta Academic Journal Ekerronic Publishing House. A1 rights rtsserved. httpLnet# 实用 口腔医学杂志 J Pract Stomato)2014

2、 Mar,30 2)?1994-2015 Chirta Academic Journal Ekerronic Publishing House. A1 rights rtsserved. httpLnet# 实用 口腔医学杂志 J Pract Stomato)2014 Mar,30 2)不同钛合金表面形貌对成纤维细胞生物学行为的影响王闻天 孟维艳 周延民 蔡青 王淑艳 王晶晶 刘童斌【摘要】 目的：比较3种不同钛合金表面形貌对成纤维细胞生物学行为的影响。方法：通过机械加工法 M组）、直流电解蚀刻法DC组）、交流电解蚀刻法 AC组）成形3种不同钛合金表面形貌，制备标准大小试件，使用场发射扫描电子

3、显微镜FE-SEM）观察其表面微观形态，将L929成纤维细胞共同培养于钛合金表面，吖啶橙染色法检测初期粘附性 ；MTT法检测表面细胞的增殖情况。结果：DC组钛表面可见直径5 -20呵微孔,AC组微孔分布更均匀,M组表面可见微沟纹,无微孔。细胞在3 组钛片表面粘附良好,AC组优于DC组和M组。DC组和AC组细胞增殖性优于 M组，第35天AC组细胞增殖性优于 DC 组。结论：通过交流电解蚀刻法形成的兼具微米-亚微米-纳米三级结构的钛合金表面具有良好的生物相容性，能够促进成纤维细胞的早期附着及增殖。【关键词】 电解蚀刻；钛合金；软组织；种植体；微米-亚微米-纳米结构The effects of di

4、fferent titanium alloy surface topograph on the biological character of fibroblastsWANG We ntian1 , MENG Weiyan1 , ZHOU Yan min1 , CAI Qi ng1, WANG Shuyar?, WANG Ji ngjing1 , LIU To ngbin1 . 1.130021 Cha ngchun, Departme nt of Oral Impla nt, 2. Departme nt of A nesthesiology School of Stomatology, J

5、ilin Un iversity, Chi naAbstract 】Objective : To compare the effect of three different titanium alloy surface topographieson the biological character fibroblasts Methods : Three different titanium alloy Ti6AI4V surface topographieswere created by machining (M), direct current electrochemical etching

6、 (DC) and alternating current electrochemical etching AC) respectively, and standard sized samples were prepared The surface topographieswere observedfield emission scanning electron microscopy(FE-SEM) . Mouse L929 fibroblasts were cultured on different surfaces The attachmentof cells was examined b

7、y acridine orange staining and observed under fluorescent microscope The proliferation of cells wasmeasuredusing MTT assay .R esults Tubles with the diamete of 5 20 gm were observed on the surfaceof the sampleof group DC, and more evenly distributed tubles on that of group AC. Micro-sulci were obser

8、vedand no microtuble was found on the sample surface of group M. L929 cells were attached on the surface of all the samples in the 3 groups .More adhered and better strached cells were observed on AC treated surface The proliferation of fibroblasts on AC and DC surfaces was superior to that on M tre

9、ated surface and at the 3 5 day the proliferation of fibroblasts on the AC surface was higher than that on DC treated surface Conclusion :AC treated surface with the micro-submicro-nano hierarchical topographyof titanium alloy has a superior biocompatibility and can promote the early attachment and

10、proliferation of the fibroblasts .Key words 】 Electrochemical etching; Titanium alloy ； Soft tissue Implant ； Micro-submicro-nano hierarchical structure中图分类号：R 7831 文献标志码：A doi: 10.3969/j issn 1001 3733.2014.02.01?1994-2015 Chirta Academic Journal Ekerronic Publishing House. A1 rights rtsserved. htt

11、pLnet# 实用 口腔医学杂志 J Pract Stomato)2014 Mar,30 2)?1994-2015 Chirta Academic Journal Ekerronic Publishing House. A1 rights rtsserved. httpLnet153 实用 口腔医学杂志 J Pract Stomato)2014 Mar,30 2)种植的成功与否不仅取决于良好的骨结合，还有赖于良好的种植体周软组织封闭厲。良好的种植体周软组织封闭能够阻止细菌及其他致炎因子侵入组织基金项目：吉林省发展与改革委员会项目（编号：2013C022-6）作者单位:130021长春,吉林大学

12、口腔医院种植科王闻天 孟维艳周延民 蔡青 王晶晶 刘童斌）,麻醉科 王淑艳）通讯作者：孟维艳 E-mail :mengsitong66163 .com内环境，避免上皮向根端迁移，保护下方骨组织，提高 种植体成功率。种植体周软组织封闭作用主要取 决于种植体周结合上皮和结缔组织对种植体表面的附 着,种植体周围的结缔组织类似于瘢痕样结构，主要由成纤维细胞及其产生的胶原纤维组成：3：。成纤维细胞及其分泌的胶原纤维能够维持种植体周围软组织的 稳定性，在建立和维持适宜的黏膜屏障和防御机制中 起到重要作用“。然而种植体周胶原纤维排列与天 然牙明显不同，天然牙胶原纤维垂直走行，而种植体周 围胶原纤维呈环形围绕

13、种植体,这种排列方式使种植体 周的黏膜封闭作用弱于天然牙，更易受到机械和毒素刺 激,引起炎症反应。研究表明，种植体周围软组织附着 与种植体颈部的表面形貌密切相关，表面形貌显著影响 上皮细胞以及成纤维细胞的粘附：5卞。因此，寻找一种 有利于成纤维细胞粘附、增殖以及胶原纤维附着的种植 体颈部表面形貌，成为目前亟需解决的一个问题。本实验通过电解蚀刻方法刀在钛合金表面形成不同的微形貌，并研究它们对成纤维细胞的生物学行 为影响，进而寻找出更适合成纤维细胞附着的种植体 颈部表面形貌，为种植体颈部设计提供指导。1材料与方法1 1不同钛合金表面制备圆柱形钛合金试件（d 4 mm X10 mm,Ti6AI4V宝

14、鸡市钛莱医药器械设备有限公司）依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声波清洗各10 min，活化1 min 29g/L HF、334 g/L HNO3），去离子水超声清洗1 min，干 燥,备用。机械加工组 M）制备：将清洗后的试件用 低速金刚切割机切成1 mm厚圆片。直流电化学腐 蚀组DC）制备：将清洗后的试件进行直流电化学腐 蚀，去离子水超声清洗10 min，干燥，同M组切割制备。交流电化学腐蚀组AC）制备:将上述经直流电化学腐蚀处理过的试件经交流电化学腐蚀处理，去离子水超声清洗10 min，干燥，同M组切割制备。将以 上3组钛片分别用丙酮、无水乙醇、去离子水超声波清 洗各10 min,干燥塑封

15、，高温高压灭菌消毒，备用。1 2表面形貌观测随机分别抽取3组钛片中各2片，采用场发射扫 描电镜XL30FEG-SEM FEI公司），对各组钛片表面 形貌进行观测。1.3不同钛合金表面对成纤维细胞生物学行为的影响 1.3.1成纤维细胞对不同钛合金表面的粘附吖啶橙染色）本实验采用小鼠成纤维细胞系L929为细胞模型。将制备好的3组钛片置于24孔板中，每组3 片,将处于对数生长期的L929细胞制成细胞悬液，以1 X104 /ml的终浓度接种到放置钛片的孔中，每孔1ml,密闭后置于37 C、95%湿度、5% CQ的细胞培养 箱内培养，24 h后取出，将各组钛片转移到周围干净 孔中，PBS冲洗3次，95%

16、乙醇固定15 min，干燥后，加 入1%冰醋酸作用30 s,PBS冲洗,4 X104 mg/L的吖啶 橙染色1 min ,PBS冲洗3次，0.1 mol/L的氯化钙作用2 min, PBS冲洗3次，荧光显微镜下观察。1.3.2 成纤维细胞在不同钛合金表面的增殖（MTT） 将消毒好的3组钛片置于96孔板中，每组3片，将L929细胞悬液以1 X104 /ml的终浓度接种到 96孔 板中的钛片上，每孔200讪，周围孔加入PBS做边缘封 闭，将培养板置入37 C、95%湿度、5% CO2的细胞培 养箱内培养，每3 d换液。细胞接种后第1天取出一 块96孔培养板，将每组钛片按顺序依次转移到周围清 洁、未

17、用的孔内，用PBS轻轻冲洗钛片2次，加入新鲜 配制的2.5% MTT溶液20讪/孔、含10%小牛血清的 DMEM培养液200讪/孔，培养板放入孵箱中继续孵 育。4h后取出培养板，倾斜培养板并用加样枪小心 吸弃孔内培养上清液，加入200讪/L二甲基亚枫，使 之刚好压住钛片。振荡10 min使结晶完全溶解。将3 组96孔培养板内液体分别按顺序依次转移到周围清 洁、未用的孔内，用HTs7000Plus多孔板高效分析仪在 492 nm光波长处测其光吸收值。同理，第27天各取出一块板，进行检测。2结果2.1不同处理方法获得的钛合金表面形貌观测DC组表面低倍镜下观均匀细腻，微粗糙 图1A）; 2 000倍

18、镜下可见深浅不一、分布均匀、呈类圆形的微米 孔，直径为520 m,孔的边缘连续 图1B） ; 10 000倍 镜下可在孔的侧壁及底部见到清晰的亚微米突起，高度约150200 nm图1C）。AC组表面低倍镜下观更 加均匀细腻，微粗糙 图1D ） , 2 000倍镜下可见分布 均匀的类圆形微米孔，直径为520 m,孔边缘圆钝 图1E） ; 20 000倍镜下见在孔的侧壁、底部及孔间隔 处可见分布均匀的亚微米孔，孔的直径约 100600nm图1F） ; 40 000倍镜下可见微米孔侧壁及底部分 布着纳米突起及纳米沟壑，高度约为50100 nm图 1G） ; 50 000及100 000倍镜下可见亚微

19、米孔内有纳 米球样突起，直径约为2050 nm图1H、11 ）。M组 表面有沟纹，无微孔 图1J、1K、1L）2.2 成纤维细胞在不同钛合金表面的生物学行为2.2.1成纤维细胞在不同钛合金表面的粘附L929接种24 h后在不同钛片表面粘附情况如图2所示,A、B、C为4倍镜下观察3组钛片表面细胞粘附情况，A为M组，B为DC组，C为AC组，3组钛片表面 AC 组细胞数明显高于 DC组及M组，M组细胞数最少，即 M VDC VAC; D、E、F为40倍镜下观察 3组钛片表面 细胞，D为M组，E为DC组，F为AC组，可见3组钛 片表面细胞生长良好，核仁清晰，胞质丰满。?1994-2015 Chirta

20、 Academic Journal Ekerronic Publishing House. A1 rights rtsserved. httpLnet实用 口腔医学杂志 J Pract Stomato) 2014 Mar,30 2)-# 2.2.2成纤维细胞在不同钛合金表面的增殖情况各组钛片表面细胞增殖情况如图3所示，在第17天各组细胞数量均呈递增趋势 ，第1天3组之间细胞数 没有明显区别，第27天DC组与AC组细胞数高于 M组，第35天AC组细胞数高于 DC组，第67天 AC组细胞数与DC组趋于一致。?1994-2015 Chirta Academic Journal Ekerronic P

21、ublishing House. A1 rights rtsserved. httpLnet实用 口腔医学杂志 J Pract Stomato) 2014 Mar,30 2)-# ?1994-2015 Chirta Academic Journal Ekerronic Publishing House. A1 rights rtsserved. httpLnet实用 口腔医学杂志 J Pract Stomato) 2014 Mar,30 2)-# A y : DC 组；D I : AC 组；J L : M 组A:X30; B、E :X2 000; C:X10000； D：X35; F:X20

22、000;G:X40 000; H:X50000; I :X100 000；J：X21; K:X500; L :M 000?1994-2015 Chirta Academic Journal Ekerronic Publishing House. A1 rights rtsserved. httpLnet实用 口腔医学杂志 J Pract Stomato) 2014 Mar,30 2)-157 图1直流电解蚀刻组DC)、交流电解蚀刻组 AC)、机械加工组 M)钛合金表面形貌FE-SEM )A C: DC group； D I: AC group； J L: M groupMicrograph o

23、f the titanium alloy surfaces treated by direct DC) , alternating AC) current electrochemical or machining M) FE-SEM)Fig 13讨论材料表面形貌能够显著影响成纤维细胞的粘附、增殖、排列及生长，对软组织的附着有引导作用，即“接触导向”。研究认为适度粗糙的材料表面能够 增加成纤维细胞的粘附、增殖、迁移及排列 ，吖丫啶橙 实验结果显示，细胞接种24 h后，经过电解蚀刻处理 形成的具有微米孔结构的表面及具有微米 -亚微米- 纳米三级结构的表面细胞数均多于机械加工表面 ，提 示具有微米粗

24、糙的表面能够促进细胞的粘附，与前面图3 MTT实验检测L929细胞在不同钛合金表面的增殖Fig 3L929 cell proliferation on different titanium alloy surfacesexamined by MTT assayA、D: M组表面细胞粘附；B、E: DC组表面细胞粘附；C、F: AC组表面细胞粘附图2不同钛合金表面成纤维细胞粘附情况吖啶橙染色，荧光显微镜，AC : X40; DF : X400)A,D： M group； B,E： DC group； C, F: AC groupFig 2L929 cells adheredon the tita

25、nium alloy surfaces of 3 groupsacridine orangestaining, fluorescent microscope A C: X40； D F : X400)所述学者研究结果一致。本实验通过电解蚀刻法形成 的微米孔结构表面及微米-亚微米-纳米三级结构表 面均具有微米粗糙的结构，其表面的微米孔直径约520 m,Lai等匚10研究发现，具有15 750宽沟纹的材料表面有利于成纤维细胞分泌纤连蛋白，促进细胞粘附，本实验形成的微米孔直径在此范围内，也证明了通过电解蚀刻法形成的微米结构能够促进成纤维细 胞粘附。而微米-亚微米-纳米三级结构的表面细胞 数多于微米孔

26、表面，则提示增加的亚微米-纳米结构更有利于成纤维细胞的粘附。Hori等皿研究发现具有200 nm大小亚微米结构 的表面面积较单纯的微米结构表面面积增大了50% ,为细胞与材料的粘附提供了更多的接触面积。本实验通过交流电解蚀刻法形成的微米-亚微米-纳米结构 表面,在微米孔的侧壁及底部附着着大量的亚微米孔，亚微米孔的直径为100600 nm,根据Hori等的研究 可推测，该表面较单纯的微米孔表面面积可增加50%以上，故吖啶橙实验结果显示微米-亚微米-纳米表 面细胞附着数量多于微米孔表面。目前，通过纳米技术增加钛及钛合金表面的生物 活性成为种植领域的研究热点匚12。纳米结构能够增大材料表面积，为种植

27、体表面和种植体周围软组织结 合提供了较大的机械嵌合力，提高了组织与表面的结 合率。因为纳米材料表面具有更多的晶界，可以影 响初期蛋白质的相互作用，故细胞喜欢粘附在纳米颗 粒的边界，同时，具有纳米结构的表面能够仿生模拟天 然细胞生存环境：14 , Andersson等研究发现 70 100 nm表面有利于粘着斑的形成，可促进细胞粘附、增殖。本实验中，在微米-亚微米-纳米三级结构中 的微米孔侧壁上附着了大量纳米突起，突起高度约50100 nm,可促进粘着斑形成，有利于细胞粘附，故其表面细 胞附着数量多于其他2组表面。Seunarine "研究发现成纤维细胞对 30 nm凹孔反应较160

28、nm 凹孔更敏感。本实验中，在微米-亚微米-纳米表面 的亚微米孔底壁上的纳米球直径在2050 nm,这些纳米结构增加了表面附着面积，提高了成纤维细胞的 敏感度，促进了细胞基质分泌，使成纤维细胞更易于附 着。MTT结果显示，在第27天经过电解蚀刻处理 过的粗糙表面 A值均高于机械加工组，说明成纤维细 胞的增殖性在微米级粗糙的表面优于光滑的钛合金表 面。第35天微米-亚微米-纳米结构表面 A值高 于微米孔表面，提示在软组织附着初期，具有微米-亚 微米-纳米结构的钛合金表面比单纯微米结构钛合金 表面更有利于细胞的增殖，进而可推测具有微米-亚 微米-纳米三级结构的钛合金表面可加速软组织早期 愈合。吖啶

29、橙实验中，高倍镜下观察3组表面细胞，细胞 形态均良好，核仁清晰较大，胞质丰满，提示经过电解 蚀刻处理形成的表面仍然具有良好的生物相容性。综上，经过交流电解蚀刻法形成的兼具微米-亚微米-纳米三级结构的钛合金表面具有优良的生物相 容性,有利于成纤维细胞的早期粘附及增殖，是一种有利于软组织早期愈合及附着的优良表面，为后序基础及临床试验提供了理论依据。参考文献1 Myshin HL , Wiens JP. Factors affecting soft tissue around dental implants： A review of the literature J . J Prosthet Den

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