基因组序列注释--功能基因组学8

1、Xiaofang Xie College of Life ScienceFujian Agriculture and Forestry University E-mail:为什么需要功能基因组学？为什么需要功能基因组学？ 虽然从结构基因组学可以揭示基因组中基因的数量和分布，虽然从结构基因组学可以揭示基因组中基因的数量和分布，并预测基因的种类和功能，但这仅仅是预测而已，并不能并预测基因的种类和功能，但这仅仅是预测而已，并不能肯定其确切功能，而且有许多基因的功能还无法预测。肯定其确切功能，而且有许多基因的功能还无法预测。 从结构基因组学也无法知道各个基因参与了哪些生命过程，从结构基因组学也无法知道

2、各个基因参与了哪些生命过程，其表达是如何调控的，不同基因之间是如何互作的。其表达是如何调控的，不同基因之间是如何互作的。 总之，从结构基因组学无法了解基因的总之，从结构基因组学无法了解基因的确切功能、表达调确切功能、表达调控以及相互作用控以及相互作用。功能基因组学的产生正是为了研究这些。功能基因组学的产生正是为了研究这些内容。内容。 COLLEGE OF LIFE SCIENCE功能基因组学是反向遗传学功能基因组学是反向遗传学传统的遗传学也称为正向遗传学，它是在已知基因功能的前提下，去传统的遗传学也称为正向遗传学，它是在已知基因功能的前提下，去寻找基因（序列）的，亦即寻找基因（序列）的，亦即“

3、从功能到基因从功能到基因”。功能基因组学正好相反，它是在已知基因（序列）的前提下，去寻找功能基因组学正好相反，它是在已知基因（序列）的前提下，去寻找基因功能的，亦即基因功能的，亦即“从基因到功能从基因到功能”，所以也称为反向遗传学。，所以也称为反向遗传学。正向遗传学的研究方法正向遗传学的研究方法图位克隆法图位克隆法：根据目标基因在染色体上定位的结果，对目标基因进行根据目标基因在染色体上定位的结果，对目标基因进行克隆，最后了解其核苷酸序列。克隆，最后了解其核苷酸序列。转座子（或转座子（或T-DNA）标签法标签法：利用转座子（或：利用转座子（或T-DNA）插入引起的突插入引起的突变，克隆控制突变性

4、状的基因。变，克隆控制突变性状的基因。图位克隆（图位克隆（Positional Cloning） 图位克隆又称基于图谱的图位克隆又称基于图谱的克隆（克隆（map-based cloning）。）。首先是寻找与目标基因紧密首先是寻找与目标基因紧密连锁的标记，然后通过染色连锁的标记，然后通过染色体步行方法（体步行方法（chromosome walking）建立局域物理图，建立局域物理图，找到与目标基因共分离的找到与目标基因共分离的BAC克隆。进一步通过亚克克隆。进一步通过亚克隆和遗传互补试验（将野生隆和遗传互补试验（将野生型基因转入突变体中），找型基因转入突变体中），找到目标基因。到目标基因。转座

5、子标签转座子标签 / T-DNA标签标签（Transposon Tagging / T-DNA Tagging） 转座子转座插入是一个自发的过程，而转座子转座插入是一个自发的过程，而T-DNA插入则是插入则是通过转基因产生的。转座子插入和通过转基因产生的。转座子插入和T-DNA插入引起突变的频插入引起突变的频率要比自然突变的频率高。因此，在已知存在转座子的群体率要比自然突变的频率高。因此，在已知存在转座子的群体或转基因后代群体中发现的突变体，很可能是转座子或或转基因后代群体中发现的突变体，很可能是转座子或T-DNA插入引起的。通过转座子或插入引起的。通过转座子或T-DNA标签克隆基因的方法标签

6、克隆基因的方法主要有以下三种：主要有以下三种： 菌落原位杂交法（菌落原位杂交法（in situ hybridization） 反向反向PCR法（法（inverse PCR, IPCR） 质粒拯救法（质粒拯救法（plasmid rescue） COLLEGE OF LIFE SCIENCE菌落原位杂交法菌落原位杂交法 建立突变体基因组建立突变体基因组DNA克隆文库，以克隆文库，以转座子序列为探针与菌落克隆杂交，阳性转座子序列为探针与菌落克隆杂交，阳性克隆即包含被转座子插入的目标基因。克隆即包含被转座子插入的目标基因。 COLLEGE OF LIFE SCIENCE反向反向PCR法法 将突变体基因

7、组将突变体基因组DNA进行限制酶切，进行限制酶切，然后用连接酶使之连然后用连接酶使之连成环状。依据转座子成环状。依据转座子序列设计反向引物，序列设计反向引物，进行进行PCR，即可扩增即可扩增出目标基因片段。为出目标基因片段。为了提高特异性，可以了提高特异性，可以采用巢式（采用巢式（nested）PCR方法。方法。 COLLEGE OF LIFE SCIENCE质粒拯救法质粒拯救法 经过改造的转座子带经过改造的转座子带有质粒的复制原点和选择有质粒的复制原点和选择标记基因，从而犹如一个标记基因，从而犹如一个载体。将突变体基因组载体。将突变体基因组DNA酶切并连接后，可以酶切并连接后，可以得到转座子

8、和目标基因片得到转座子和目标基因片段组成的环状段组成的环状DNA。用它用它转化大肠杆菌，目标基因转化大肠杆菌，目标基因片段即被克隆出来。片段即被克隆出来。 COLLEGE OF LIFE SCIENCE反向遗传学的研究方法：针对特定基因反向遗传学的研究方法：针对特定基因 消除或抑制基因的表达消除或抑制基因的表达 基因敲除（基因敲除（gene knockout） 反义反义RNA（antisense RNA） RNA干扰（干扰（RNA interference） 提高或改变基因的表达提高或改变基因的表达 使目标基因过量表达（使目标基因过量表达（overexpression） 使目标基因异位表达（使

9、目标基因异位表达（ectopic expression） COLLEGE OF LIFE SCIENCE基因敲除基因敲除 在体外先将某个基因在体外先将某个基因的内部插入一个选择标记的内部插入一个选择标记基因，使该基因失活。并基因，使该基因失活。并将包含该失活基因的染色将包含该失活基因的染色体片段组装到载体上。导体片段组装到载体上。导入细胞后，通过同源重组，入细胞后，通过同源重组，失活基因会取代细胞中原失活基因会取代细胞中原来正常的基因，从而产生来正常的基因，从而产生基因失活突变体。基因失活突变体。 COLLEGE OF LIFE SCIENCE COLLEGE OF LIFE SCIENCE反

10、义反义RNA 将目标基因颠倒过来，使其编码链变成模板链，而模板链变成编将目标基因颠倒过来，使其编码链变成模板链，而模板链变成编码链，即成为该目标基因的反义码链，即成为该目标基因的反义RNA基因。将反义基因转入到植物细基因。将反义基因转入到植物细胞中，反义基因将转录出反义胞中，反义基因将转录出反义RNA，而反义而反义RNA会与目标基因的会与目标基因的mRNA结合，使之无法翻译，从而达到抑制目标基因表达的目的。结合，使之无法翻译，从而达到抑制目标基因表达的目的。PromoterPromoterTarget geneAntisense gene COLLEGE OF LIFE SCIENCERNA干

11、扰（干扰（RNAi） RNA干扰是指干扰是指dsRNA（双链双链RNA）在细胞中可以诱发在细胞中可以诱发与之同源的与之同源的mRNA降解，从而导致编码该降解，从而导致编码该mRNA的基的基因沉默的现象。因沉默的现象。 RNA干扰的最初证据来自干扰的最初证据来自1995年年Guo和和Kemphues对线对线虫的研究。他们发现，将虫的研究。他们发现，将par-1基因的反义基因的反义RNA和正义和正义RNA注射进线虫体内，都能引起该基因的沉默。注射进线虫体内，都能引起该基因的沉默。 基于该研究结果，基于该研究结果，1998年年Andy Fire首次在线虫中证明，首次在线虫中证明，dsRNA可以有效地

12、、特异地抑制基因的表达。可以有效地、特异地抑制基因的表达。 COLLEGE OF LIFE SCIENCERNA干扰所需的酶干扰所需的酶 Dicer：为：为RNase III家族的一个成员，可以产生双链小家族的一个成员，可以产生双链小型干扰型干扰RNA（siRNA，长度长度21 23bp）。）。该酶含有多个该酶含有多个结构域，包括一个解旋酶结构域，两个相邻的结构域，包括一个解旋酶结构域，两个相邻的RNase III结构域，以及一个结构域，以及一个dsRNA结合基元。结合基元。 RISC（RNA-induced silencing complex）：由）：由RNA诱导诱导的沉默复合体，是一种核酸

13、蛋白复合体。的沉默复合体，是一种核酸蛋白复合体。 RdRP（RNA-directed RNA polymerase）：由）：由RNA指指导的导的RNA聚合酶。聚合酶。 COLLEGE OF LIFE SCIENCERNA干扰的基本干扰的基本过程过程Dicer与与dsRNA结合，将结合，将dsRNA剪切成剪切成siRNA。siRNA与与RISC结合，形结合，形成有活性的成有活性的RISC复合体。复合体。有活性的有活性的RISC与目标与目标mRNA结合（结合（siRNA单链单链与与mRNA互补），将互补），将mRNA切断。切断。RNA干扰的分子机制干扰的分子机制dsRNA的来源的来源 用于用于RN

14、A干扰的干扰的dsRNA既可以在体外合成，然后导入到受体细既可以在体外合成，然后导入到受体细胞里，也可以人为地构建一个基因（将目标基因中某一段序列镜像胞里，也可以人为地构建一个基因（将目标基因中某一段序列镜像对接）对接） ，将它导入到受体细胞，直接在受体细胞中合成，将它导入到受体细胞，直接在受体细胞中合成dsRNA。该该基因具有自互补结构，因而转录出来的基因具有自互补结构，因而转录出来的RNA可以形成发夹结构。可以形成发夹结构。5-AAGCTTATCCCGTGGTGGTATGAAAGGTTCCGCTATAGG-33-TTCGAATAGGGCACCACCATACTTTCCAAGGCGATATCC

15、-55-AAGCTTATCCCGTGGTGGTATCCACCACGGGATAAGCTT-33-TTCGAATAGGGCACCACCATAGGTGGTGCCCTATTCGAA-5过量表达和异位表达过量表达和异位表达通过转基因技术将完整的目标基因（包括启动子区域）导入正常通过转基因技术将完整的目标基因（包括启动子区域）导入正常个体细胞中，使目标基因的个体细胞中，使目标基因的拷贝数增加拷贝数增加，这样可能会使目标基因，这样可能会使目标基因的表达量增加，超过了正常的需要（即过量表达），这会引起性的表达量增加，超过了正常的需要（即过量表达），这会引起性状的改变。由此可以推断目标基因的功能。状的改变。由此

16、可以推断目标基因的功能。如果转基因中所用的启动子是组织特异的，而且其表达的部位与如果转基因中所用的启动子是组织特异的，而且其表达的部位与目标基因正常表达的部位不同，则出现异位表达现象。异位表达目标基因正常表达的部位不同，则出现异位表达现象。异位表达可能使得某种（些）性状在非正常的部位出现。据此也可推断目可能使得某种（些）性状在非正常的部位出现。据此也可推断目标基因的功能。标基因的功能。使用组成型启动子会同时造成过量表达和异位表达。使用组成型启动子会同时造成过量表达和异位表达。 COLLEGE OF LIFE SCIENCE水稻水稻OsMADS3基因过量和异位表达的表现基因过量和异位表达的表现

17、使用组成型启动子让来自水稻的使用组成型启动子让来自水稻的OsMADS3基因在水稻中过量和基因在水稻中过量和异位表达，发现在正常的小穗旁边还长出一个不完全的小穗。由此可异位表达，发现在正常的小穗旁边还长出一个不完全的小穗。由此可以推断，该基因与水稻的小穗发育有关。以推断，该基因与水稻的小穗发育有关。功能基因组学的研究方法：高通量功能基因组学的研究方法：高通量 建立大规模随机插入突变体库及基因机械筛选（建立大规模随机插入突变体库及基因机械筛选（gene machine screening） 分析基因表达谱（分析基因表达谱（expression profile） 转录组（转录组（ transcipt

18、ome ） 蛋白组（蛋白组（ proteome ） 代谢组（代谢组（ metabolome ） COLLEGE OF LIFE SCIENCE突变体库对于遗传学研究的意义突变体库对于遗传学研究的意义 随着一些物种全基因组测序的完成，以及数随着一些物种全基因组测序的完成，以及数据库中现有的成百上千的据库中现有的成百上千的ESTs 序列，如何分析序列，如何分析这些基因的功能、如何理解基因与基因之间在生这些基因的功能、如何理解基因与基因之间在生物体内的相互作用是一项重要的工作。基因功能物体内的相互作用是一项重要的工作。基因功能的预测建立在与其他物种同源基因之间的比对，的预测建立在与其他物种同源基因之

19、间的比对，但许多基因的预测功能与他们实际的功能并不一但许多基因的预测功能与他们实际的功能并不一致。还有许多的基因功能尚未归类。突变体在研致。还有许多的基因功能尚未归类。突变体在研究基因的功能的过程中十分重要。究基因的功能的过程中十分重要。 COLLEGE OF LIFE SCIENCE突变体库对于遗传学研究的意义突变体库对于遗传学研究的意义 COLLEGE OF LIFE SCIENCE30为原来已鉴定的基因；30为同源分析鉴定的基因；10为数据库中存在同源序列，但功能未知，称为孤儿家族；剩下30在数据库中无同源序列，其中7%很可能不是基因，23看起来像基因，称为单身孤儿。酵母基因组中基因的分

20、类产生突变体库的方法产生突变体库的方法 研究一个基因的功能，最可靠的方法是把一个基因的结构破坏掉，然后研究破坏后的表现型。借助大量的突变体，将会加速人们对这个物种基因功能的研究。常见的方法是：1、插入突变2、缺失突变3、物理化学诱变 COLLEGE OF LIFE SCIENCE插插 入入 突突 变变 插入突变作为研究基因组基因功能的有效手段，广泛地应用于植物、哺乳动物的基因功能的研究。这个技术手段的优势优势在于，插入片段的序列已知，并且携带容易识别的报告基因。其中，常用的插入突变技术有 T-DNA插入突变 Ac/Ds 转座子插入突变 COLLEGE OF LIFE SCIENCET-DNA

21、T-DNA是农杆菌是农杆菌Ti质粒中的一个片段。农杆菌质粒中的一个片段。农杆菌Ti质粒可以从植物伤质粒可以从植物伤口侵入植物细胞，口侵入植物细胞，T-DNA可以整合到植物基因组中，并引起细胞疯狂可以整合到植物基因组中，并引起细胞疯狂分裂，形成冠状肿瘤。分裂，形成冠状肿瘤。 COLLEGE OF LIFE SCIENCE转座子转座子Ac/Ds系统系统 Ac/Ds是目前植物中最常用的转座子系统。该系统来自是目前植物中最常用的转座子系统。该系统来自玉米，但已经通过转基因技术将该系统导入其它植物玉米，但已经通过转基因技术将该系统导入其它植物（如水稻）中。（如水稻）中。 Ac是自主型转座子，而是自主型转

22、座子，而Ds是非自主型转座子，需要是非自主型转座子，需要Ac存在时才能发生转座。因此，可以通过有性杂交的方存在时才能发生转座。因此，可以通过有性杂交的方法将法将Ac和和Ds聚合在一个基因组中。当发现某个聚合在一个基因组中。当发现某个Ds插入插入引起的突变体时，又可以通过有性杂交的方法使引起的突变体时，又可以通过有性杂交的方法使Ac和和Ds分开，这样就能稳定地保存分开，这样就能稳定地保存Ds插入突变体。插入突变体。 COLLEGE OF LIFE SCIENCE建立随机插入突变体库及基因机械筛选建立随机插入突变体库及基因机械筛选 为了高通量地研究基因的功能，应该大规模地建立T-DNA或转座子插入

23、株系，然后对所有已知序列的基因进行筛选，确定各个基因的插入突变体。 采取基因机械筛选的策略，可以同时对许多基因进行筛选，实现高通量的分析目标。主要有以下三种方法： PCR检测 分子杂交检测 侧邻DNA测序 COLLEGE OF LIFE SCIENCEPCR检测法检测法 根据目标基因和根据目标基因和T-DNA（或转座子）的序列设计一或转座子）的序列设计一对引物，则仅当对引物，则仅当T-DNA （或转座子）插入到目标基因中或转座子）插入到目标基因中间时，才能得到间时，才能得到PCR产物。因此，能得到产物。因此，能得到PCR产物的株产物的株系即为该目标基因的插入突变体。系即为该目标基因的插入突变体

24、。Target geneT-DNANo PCR productPCR product COLLEGE OF LIFE SCIENCE分子杂交检测法分子杂交检测法 对所有株系进行反向对所有株系进行反向PCR（IPCR），），然后将各株系然后将各株系IPCR的产物按阵列形式固定在尼龙膜或玻璃片上，再以的产物按阵列形式固定在尼龙膜或玻璃片上，再以各个待测基因的序列为探针进行杂交，有阳性杂交信号各个待测基因的序列为探针进行杂交，有阳性杂交信号的点（株系）即为该基因的插入突变体。的点（株系）即为该基因的插入突变体。 COLLEGE OF LIFE SCIENCE侧邻侧邻DNA测序法测序法 将所有株系的将

25、所有株系的T-DNA（或转座子）插入位点两侧的序或转座子）插入位点两侧的序列扩增出来并测序，然后将这些序列储存在一个基因敲除列扩增出来并测序，然后将这些序列储存在一个基因敲除数据库中。用生物信息学的方法将各个待测基因的序列与数据库中。用生物信息学的方法将各个待测基因的序列与该数据库中的序列进行比较，即可获知哪些株系发生了哪该数据库中的序列进行比较，即可获知哪些株系发生了哪些基因的插入突变。些基因的插入突变。 COLLEGE OF LIFE SCIENCE分析基因表达谱（分析基因表达谱（expression profile） 转录组分析（转录组分析（transcriptome） 转录组（转录组（

26、transcriptome）是指在某一特定条件下单个或是指在某一特定条件下单个或一组细胞所具有的一组细胞所具有的mRNA的总和。对转录组的分析，就的总和。对转录组的分析，就是检测各种是检测各种mRNA的表达水平，由此可以反映各种基因的表达水平，由此可以反映各种基因的表达调控，推断其可能的功能和作用网络。的表达调控，推断其可能的功能和作用网络。 对转录组的分析主要有以下两种方法：对转录组的分析主要有以下两种方法： SAGE（Serial Analysis of Gene Expression） Microarray（微阵列）微阵列）/ DNA chip（DNA芯片）芯片） COLLEGE OF

27、LIFE SCIENCESAGE 分析分析SAGE: 能同时分析大量的转录本能同时分析大量的转录本 三项原则：三项原则： 取短片段的序列（取短片段的序列（10-14 bp），必须包括能区分一），必须包括能区分一个转录本的足够的信息。个转录本的足够的信息。 短片段的序列之间能够相互连接形成长的序列分子，短片段的序列之间能够相互连接形成长的序列分子，这样的分子能够被克隆与测序。这样的分子能够被克隆与测序。 某特异序列被观察到的时间量某特异序列被观察到的时间量(标签出现的频率标签出现的频率)代代表某个转录本的表达丰度表某个转录本的表达丰度 。 技术关键：技术关键： 用一种特殊的限制性内切酶，能够切取

28、特定的标签长用一种特殊的限制性内切酶，能够切取特定的标签长度。如度。如:BsmF1 COLLEGE OF LIFE SCIENCESAGE从特定组织中提取从特定组织中提取mRNA，通过反转录成为通过反转录成为cDNA。通过限制酶切从每条通过限制酶切从每条cDNA上得到一条长上得到一条长10-15bp的片段，的片段，称为称为SAGE标签。标签。将来自各种将来自各种cDNA上的标签上的标签连接成许多串联复合体，并连接成许多串联复合体，并将其克隆。将其克隆。对这些克隆进行测序，然后对这些克隆进行测序，然后统计各种标签的数量。这样统计各种标签的数量。这样就能了解各种就能了解各种mRNA的相对的相对丰度

29、。丰度。 COLLEGE OF LIFE SCIENCESAGE 实验计算机软件的用途实验计算机软件的用途 选择具有合适相间距离的限制性内切酶位点 在繁浩的基因序列数据中提炼“标签” 将标签的序列信息储藏在数据库之中 在计算机中模拟“标签”序列与基因组序列的相匹配 COLLEGE OF LIFE SCIENCEDNA 芯片芯片 （Microarry）- 什么是什么是Microarry技术？技术？一种非常有效的基因表达研究技术，可以同时检测多达10万个基因的表达状况。特别是用于了解在一种组织中各类mRNA的丰度。它的特点是：平行性高通量大范围、大规模基因组水平上的 COLLEGE OF LIFE

30、 SCIENCEDNA 芯芯 片片（DNA Microarry）- 概概 况？况？原则上是在玻璃片、尼龙膜或其他材料上点上一系列的DNA片段，然后与不同的转录本探针进行杂交。这些有序排列的“点”可以是细菌克隆、纯化后的质粒DNA、插入片段、或者是核苷酸片断。点样的密度可以达到每片10万个多种高技术的有机组合 COLLEGE OF LIFE SCIENCEDNA 芯芯 片片（DNA Microarry）- 尼龙膜上点样尼龙膜上点样用放射性物质标记探针，这是一种经济的方法 COLLEGE OF LIFE SCIENCEDNA 芯芯 片片（DNA Microarry）- 几种常见的技术几种常见的技术 高速的机器手在玻璃芯片上点样，通常是点经过PCR扩增的cDNAs，所谓芯片的“印制” 依赖高速机器手，点长片段的核苷酸（70mer Agilent技术） 用所谓的照相平板印刷法，直接在芯片上合成25mer的多低聚核苷酸 (Affymetrix GeneChips) 用“铝镜”技术在芯片上直接合成25-70 mers的低聚核苷酸 (Nimble GeneChips技术) COLLEGE OF LIFE SCIENCEDNA 芯片的分析过程芯片的分析过程 COLLEGE