用遗传学与生理学相结合的方法研究氨基酸生产

1、 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 2 前前 言言 对微生物的代谢途径及代谢网络进行对微生物的代谢途径及代谢网络进行有目的的改造从而提高氨基酸的产量仍然有目的的改造从而提高氨基酸的产量仍然是现代生物工程学的一个主攻目标。为了是现代生物工程学的一个主攻目标。为了攻克这个目标，就有必要对尚待进一步完攻克这个目标，就有必要对尚待进一步完善的细胞生理学、生物化学、分子生物学善的细胞生理学、生物化学、分子生物学及生物过程工程等学科的基本状况做一番及生物过程工程等学科的基本状况做一番描述，主要有如下几个话题描述，主要有如下几个话题:2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 3 与生物工程相关的

2、氨基酸产生与生物工程相关的氨基酸产生菌的相关途径的研究进展情况，菌的相关途径的研究进展情况，其中必须包括这些途径的其中必须包括这些途径的代谢调代谢调节以及细胞的整个调节网络节以及细胞的整个调节网络的研的研究进展情况。究进展情况。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 4对所有的相关途径进行详细的对所有的相关途径进行详细的代谢流代谢流量分析量分析。这涉及到基质进入细胞的碳架。这涉及到基质进入细胞的碳架物流量，流经向心途径、中心代谢途径物流量，流经向心途径、中心代谢途径和离心途径的碳架物流量，以及代谢中和离心途径的碳架物流量，以及代谢中间产物流出细胞的间产物流出细胞的碳架物流量碳架物流量 （

3、 the central and peripheral carbon fluxes）。）。 还原力的流量还原力的流量 （ redox flux ）及及能量流能量流量量（energy flux）。）。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 5以协调和调节的方式以协调和调节的方式对碳架流、氧对碳架流、氧化还原反应的电子流、能量流进行导化还原反应的电子流、能量流进行导向向，以提高基质的吸收能力，以提高基质的吸收能力、限制前限制前体物向支路途径的流量、减少中间产体物向支路途径的流量、减少中间产物的积累及副产物的形成，还要绕过物的积累及副产物的形成，还要绕过氧化还原平衡及能量平衡中可能出现氧化还原平

4、衡及能量平衡中可能出现的难题。的难题。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 6 传统的设计育种（传统的设计育种（ 随机诱变加定随机诱变加定向筛选），以及向筛选），以及DNA重组技术在设计重组技术在设计育种中的应用已经大大提高了育种中的应用已经大大提高了 微生物微生物对氨基酸的生产能力，对氨基酸的生产能力， 但人们对于氨但人们对于氨基酸产生菌的基酸产生菌的生理学生理学与与生物化学生物化学等等 主主要领域的基础知识还相当匮乏。要领域的基础知识还相当匮乏。 目前可从以下几方面理解氨基酸目前可从以下几方面理解氨基酸的代谢基础：的代谢基础： 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 7具有生物工

5、程学重要性的微生物的具有生物工程学重要性的微生物的基本代谢途径基本代谢途径及其对应的及其对应的酶的性质酶的性质；酶及其酶及其调节方式调节方式，途径及其调节方，途径及其调节方式；式；中心代谢途径及离心途径代谢中心代谢途径及离心途径代谢流量流量的定量分析的定量分析；对对跨膜传送跨膜传送（基质吸收和产物分泌）（基质吸收和产物分泌）的详尽的了解。的详尽的了解。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 8 目的产物的合成途径是理解氨基酸目的产物的合成途径是理解氨基酸生产的前提和核心内容生产的前提和核心内容 。相关的代谢途。相关的代谢途径不仅包括那些直接导致某特定氨基酸径不仅包括那些直接导致某特定氨基酸

6、的合成的专用途径，也包括提供前体碳的合成的专用途径，也包括提供前体碳架物的途径、从专用途径分流最终导致架物的途径、从专用途径分流最终导致副产物生成的分支途径、相应氨基酸自副产物生成的分支途径、相应氨基酸自身被降解的途径、以及那些身被降解的途径、以及那些提供还原力提供还原力和代谢能量的途径。和代谢能量的途径。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 9 除了以上这些反映代谢途径基本除了以上这些反映代谢途径基本信息的资料外，代谢流量的相对固定信息的资料外，代谢流量的相对固定的分布以及代谢流量的动力学响应同的分布以及代谢流量的动力学响应同样是至关重要的。这既涉及到中心代样是至关重要的。这既涉及到中

7、心代谢途径（提供碳架物质、还原力及代谢途径（提供碳架物质、还原力及代谢能）的代谢流的定量分析，又涉及谢能）的代谢流的定量分析，又涉及到特定氨基酸专用的合成途径的代谢到特定氨基酸专用的合成途径的代谢流的定量分析。流的定量分析。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 10 此外，基质吸收和目的产物输出等此外，基质吸收和目的产物输出等有方向性的跨膜反应对于氨基酸的生产有方向性的跨膜反应对于氨基酸的生产也是极其重要的。除大肠杆菌外，一般也是极其重要的。除大肠杆菌外，一般工业微生物基质吸收方面的知识是相当工业微生物基质吸收方面的知识是相当欠缺的。氨基酸跨膜输出的研究领域近欠缺的。氨基酸跨膜输出的研究

8、领域近年才受到关注。方向性的跨膜反应的机年才受到关注。方向性的跨膜反应的机理、微生物能学及氨基酸分泌的调节等理、微生物能学及氨基酸分泌的调节等方面的知识对于理解氨基酸生产过程也方面的知识对于理解氨基酸生产过程也是相当重要的。是相当重要的。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 11 我们将一起回顾发酵法生产氨基酸的我们将一起回顾发酵法生产氨基酸的代谢基础的建立过程，一起讨论代谢流量代谢基础的建立过程，一起讨论代谢流量分析对于了解细胞生理的意义和氨基酸生分析对于了解细胞生理的意义和氨基酸生物合成的代谢工程，还将一起讨论跨膜输物合成的代谢工程，还将一起讨论跨膜输送方面为数不多的研究工作，以及这

9、方面送方面为数不多的研究工作，以及这方面研究对于微生物过量合成氨基酸的意义。研究对于微生物过量合成氨基酸的意义。在此基础上，讨论以氨基酸为目的产物的在此基础上，讨论以氨基酸为目的产物的微生物代谢设计的新进展和新方法。微生物代谢设计的新进展和新方法。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 121. 氨基酸生产的代谢基础氨基酸生产的代谢基础2. 氨基酸生物合成的代谢流量氨基酸生物合成的代谢流量 分析分析3. 基质的跨膜吸收与氨基酸的基质的跨膜吸收与氨基酸的 跨膜输出跨膜输出4. 氨基酸生产的代谢设计氨基酸生产的代谢设计 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 131.氨基酸生产的代谢基础氨

10、基酸生产的代谢基础1.1 氨基酸的生物合成氨基酸的生物合成1.2 代谢产物生产的生理学代谢产物生产的生理学2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 14 1. 1 氨基酸生产的代谢基础氨基酸生产的代谢基础 氨基酸的生物合成涉及以下氨基酸的生物合成涉及以下5个方面：个方面： （1）基质吸收；）基质吸收；（2）进入中心代谢途径前的准备途径；）进入中心代谢途径前的准备途径；（3）经中心代谢途径产生碳架化合物（氨）经中心代谢途径产生碳架化合物（氨基酸的前体化合物）、还原力（如基酸的前体化合物）、还原力（如NADPH、NADH ）和代谢能（和代谢能（ ATP 和磷酸烯醇式丙和磷酸烯醇式丙酮酸等）；酮酸

11、等）； 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 15（4）通过同化（）通过同化（ 合成）合成） 途径将碳途径将碳架化合物转化成目的氨基酸，此过架化合物转化成目的氨基酸，此过程涉及到还原力与代谢能的供需平程涉及到还原力与代谢能的供需平衡，同时也涉及主要载流途径与分衡，同时也涉及主要载流途径与分支途径之间的关系；支途径之间的关系； （5）目的氨基酸的跨膜输出等；）目的氨基酸的跨膜输出等；（6）目的产物进一步代谢的途径。）目的产物进一步代谢的途径。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 16 谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的合成谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的合成是研究得最为广泛的。是研究得最为广泛的。图图

12、2 列出了列出了谷氨酸棒杆菌中天冬族氨基酸生物谷氨酸棒杆菌中天冬族氨基酸生物合成相关的途径及重要步骤的代谢合成相关的途径及重要步骤的代谢调节情况。调节情况。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 17基质基质异化途径同化途径氨基酸副产物降解途径氨基酸全局调节系统跨膜吸收碳架、还原力、代谢能跨膜输出重吸收反馈调节图图1. 微生物细胞合成氨基酸的微生物细胞合成氨基酸的相关途径及代谢调节示意图相关途径及代谢调节示意图 其中，各相关酶及其中，各相关酶及途径水平上的代谢调节，途径水平上的代谢调节，以及整个细胞水平上的以及整个细胞水平上的全局调节对于代谢流的全局调节对于代谢流的导向和改造是至关重要导向

13、和改造是至关重要的。对微生物整个代谢的。对微生物整个代谢网络进行有目的的改造网络进行有目的的改造和设计涉及到大范围的和设计涉及到大范围的遗传改造。遗传改造。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 18 该同化（合成）途径通过草酰乙酸该同化（合成）途径通过草酰乙酸 （OAA）与中心代谢途径相接，天冬氨与中心代谢途径相接，天冬氨酸是该族氨基酸的共同前体物。酸是该族氨基酸的共同前体物。 来自回来自回补途径及补途径及TCA 环的草酰乙酸，环的草酰乙酸， 进入合进入合成途径并在天冬氨酸成途径并在天冬氨酸 - 半醛（半醛（ ASA）处分为两条支路，一条通往赖氨酸，另处分为两条支路，一条通往赖氨酸，另一

14、条通往苏氨酸、蛋氨酸（一条通往苏氨酸、蛋氨酸（ 甲硫氨酸甲硫氨酸 ）及异亮氨酸。该途径上主要调控点是天及异亮氨酸。该途径上主要调控点是天冬氨酸激酶（冬氨酸激酶（ AK ），），其他重要的酶包其他重要的酶包括高丝氨酸脱氢酶（括高丝氨酸脱氢酶（ HDH ） 和苏氨酸和苏氨酸脱氢酶（脱氢酶（TDH）。）。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 19 再往后的流量控制点是是通往赖再往后的流量控制点是是通往赖氨酸氨酸 DDP合酶（见图中合酶（见图中DHDPS） 以以及赖氨酸的需能输出。要获得令人满及赖氨酸的需能输出。要获得令人满意的结果，必须全面考虑这些方面，意的结果，必须全面考虑这些方面，仅仅对于

15、个别反应（即便是最重要的仅仅对于个别反应（即便是最重要的调控点）进行改造并不是理想的方法，调控点）进行改造并不是理想的方法，Broer 等曾将脱敏的等曾将脱敏的 AK 的基因导入的基因导入野生菌中进行表达，但并未获得很令野生菌中进行表达，但并未获得很令人满意的赖氨酸产量。人满意的赖氨酸产量。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 20 该途径上另一值得关注的该途径上另一值得关注的特征是从六氢吡啶二羧酸出发特征是从六氢吡啶二羧酸出发合成二氨基庚二酸的旁路途径合成二氨基庚二酸的旁路途径的出现，借助于的出现，借助于 NMR 手段已手段已经得知，旁路的出现依赖于某经得知，旁路的出现依赖于某些代谢

16、条件，特别是可利用的些代谢条件，特别是可利用的NH4+的存在。的存在。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 21 另一个重要的方面是参与特定另一个重要的方面是参与特定氨基酸合成途径及与之相关的其他氨基酸合成途径及与之相关的其他代谢途径的代谢途径的酶的调节特性酶的调节特性，包括酶，包括酶活力的调节和酶的表达的调节。特活力的调节和酶的表达的调节。特别是必须详细研究中间产物或终端别是必须详细研究中间产物或终端产物对途径起点或分支处的关键酶产物对途径起点或分支处的关键酶的调节。的调节。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 22图图2 2. . 天冬族氨基酸的生物合成及代谢调节.(其中 表

17、示反馈抑制； 表示反馈阻遏)IR缩写符号：缩写符号：ASA为天门冬氨酸为天门冬氨酸-半醛，半醛，H s e 为 高 丝 氨 酸 ，为 高 丝 氨 酸 ，SucAKPA为琥珀酰二氨为琥珀酰二氨基庚二酸；基庚二酸；AK为天冬氨为天冬氨酸激酶，酸激酶，DHDPS为二氢为二氢吡啶二羧酸合酶，吡啶二羧酸合酶，HDH为高丝氨酸脱氢酶，为高丝氨酸脱氢酶，HK为高丝氨酸激酶，为高丝氨酸激酶，TDH为为苏氨酸脱氢酶，苏氨酸脱氢酶，AHAS为为乙酰羟酸合酶；乙酰羟酸合酶； PEPS为为PEP合成酶，合成酶，PK为丙酮为丙酮酸激酶，酸激酶，PC为丙酮酸羧为丙酮酸羧化酶，化酶，OAADC为草酰乙为草酰乙酸脱羧酶，酸脱

18、羧酶，PEPC为为PEP羧化酶，羧化酶，PEPCK为为PEP羧激酶。羧激酶。PYRAcCoAOAATCACTAHDHhomDHDPSdapAAspAsp-PAKlysCASAHseIMetDDPSucAKPADAPLysHKthrBIleThrTDHilvAAHASilvBNIThrLysIThrMetRMetRIle，Leu,ValRIleIIleIEMPPEPPEPCPEPCKPCOAADCPKPEPSGlcG6PPTS奇异三角区2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 23 要想根据细胞粗提取液的测定要想根据细胞粗提取液的测定结果对这些酶的调控性质做出适当结果对这些酶的调控性质做出适当

19、的解释是靠不住的。的解释是靠不住的。这一方面是因这一方面是因为它们在这些条件下可能不稳定；为它们在这些条件下可能不稳定；另一方面，对于需要什么样的辅因另一方面，对于需要什么样的辅因子才能保持它们的活性或（和）它子才能保持它们的活性或（和）它们在缓冲液中的稳定性，也知之甚们在缓冲液中的稳定性，也知之甚少；而且特别是因为在抽提的过程少；而且特别是因为在抽提的过程中，那些参与胞内酶活性调节的必中，那些参与胞内酶活性调节的必需因子会丢失。需因子会丢失。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 24 谷氨酸棒杆菌中存在谷氨酸棒杆菌中存在 - 酮戊二酮戊二酸脱氢酶便是一例。酸脱氢酶便是一例。人们最初认

20、为人们最初认为这个酶在谷氨酸棒杆菌中并不存在。这个酶在谷氨酸棒杆菌中并不存在。正因为如此，才出现了这样的假设，正因为如此，才出现了这样的假设，即：即：TCA 环在该处的中断引起环在该处的中断引起 - 酮戊二酸的酮戊二酸的 “ 溢出溢出 ”， 最终导致最终导致谷氨酸的分泌谷氨酸的分泌。后来才弄清这个酶后来才弄清这个酶在谷氨酸棒杆菌中实际上是存在的，在谷氨酸棒杆菌中实际上是存在的，但是它似乎很不稳定但是它似乎很不稳定。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 25 另外，另外，在关于代谢流的研究中在关于代谢流的研究中有迹象表明，在谷氨酸棒杆菌中有迹象表明，在谷氨酸棒杆菌中-酮戊二酸脱氢酶的活性

21、已被调低了酮戊二酸脱氢酶的活性已被调低了（dawn-regulated），）， 但这在细胞但这在细胞抽提物中至今不能得到证实。进行抽提物中至今不能得到证实。进行详细的代谢流量（包括相关中间产详细的代谢流量（包括相关中间产物的流量）分析，或许是解决这一物的流量）分析，或许是解决这一问题的唯一办法。问题的唯一办法。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 26 正确描述代谢网络的主要节点的正确描述代谢网络的主要节点的调控模式是十分必要的，但常常是十调控模式是十分必要的，但常常是十分困难的。谷氨酸棒杆菌中丙酮酸和分困难的。谷氨酸棒杆菌中丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸节点的复合模式就磷酸烯醇式丙酮酸节点的

22、复合模式就是最好的例子。谷氨酸棒杆菌中是最好的例子。谷氨酸棒杆菌中PEP、PYR和和OAA所构成的所构成的 “ 奇异三角区奇异三角区 ”（magic triangle）是研究的热点是研究的热点 。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 27GlcPEPPYRAcCoAOAAG6PGlc注：注：PK, PC,PEPC, PEPCK,OAADC,PEPS, PTS奇异三角区奇异三角区2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 28 PEP通过通过PYR和和AcCoA向向TCA环提供环提供C2单位，同时，单位，同时，PEP、PYR 以及以及 AcCoA 还还通过回补反应通过回补反应（ 通通过乙醛

23、酸环）为过乙醛酸环）为TCA环提供重要中环提供重要中间产物，这些回补反应对于以间产物，这些回补反应对于以TCA环代谢中间产物环代谢中间产物 为前体的氨基酸的为前体的氨基酸的生产来说是非常必要的。生产来说是非常必要的。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 29 该区包含可能有多达七个酶的参与，该区包含可能有多达七个酶的参与，其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（ PEPCK ）、）、丙酮酸激酶丙酮酸激酶 （ PK ）、）、 草酰乙酸脱羧草酰乙酸脱羧酶酶 （OAADC ）和磷酸烯醇式丙酮酸磷和磷酸烯醇式丙酮酸磷

24、酸转移酶系统（酸转移酶系统（PTS）都已得到鉴定，都已得到鉴定，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶（磷酸烯醇式丙酮酸合成酶（ PEPS ）已已被假定存在。丙酮酸羧化酶（被假定存在。丙酮酸羧化酶（ PC ）的的存在已得到代谢流量分析的实验数据的存在已得到代谢流量分析的实验数据的支持。支持。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 30 合成代谢途径通常受反馈抑制和合成代谢途径通常受反馈抑制和反馈阻遏的严格调控，比如反馈阻遏的严格调控，比如 图图2 中的中的AK、HDH、TDH、AHAS等。等。 不过，不过，相对于大肠杆菌而言，谷氨酸棒杆菌相对于大肠杆菌而言，谷氨酸棒杆菌中的调节尤其是天冬族氨基酸合成途中的

25、调节尤其是天冬族氨基酸合成途径的调节还是比较简单的。径的调节还是比较简单的。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 31 研究表明，仅仅研究与合成途径直研究表明，仅仅研究与合成途径直接相关的酶的调节以及还原力和能量的接相关的酶的调节以及还原力和能量的供给，以及对供给，以及对“瓶颈瓶颈”处关键酶的处关键酶的解调解调节节或或过量表达过量表达仍是不够的。中心代谢途仍是不够的。中心代谢途径和合成代谢途径，特别是合成代谢途径和合成代谢途径，特别是合成代谢途径，同全局调控机制密切相关，如紧缩径，同全局调控机制密切相关，如紧缩控制、营养阻遏、供氧控制、氮源调节、控制、营养阻遏、供氧控制、氮源调节、渗透压

26、调节及生长阶段调节等。这些问渗透压调节及生长阶段调节等。这些问题对于氨基酸的合成非常重要，但对它题对于氨基酸的合成非常重要，但对它们了解得并不多。们了解得并不多。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 32 氨基酸的生产中经常用到特定氨基酸的生产中经常用到特定的氨基酸营养缺陷型菌株。一方面，的氨基酸营养缺陷型菌株。一方面，在分成两支的氨基酸合成途径中，在分成两支的氨基酸合成途径中，一个分支途径的终端产物氨基酸的一个分支途径的终端产物氨基酸的营养缺陷，通常对另一分支的终端营养缺陷，通常对另一分支的终端产物氨基酸的合成起促进作用。产物氨基酸的合成起促进作用。2021-12-4张星元：发酵原理（

27、讲座） 33(其中 表示反馈抑制； 表示反馈阻遏)图图3.3.天冬族氨基酸过量合成的机理IRPYRAcCoAOAATCACTAHDHhomDHDPSdapAAspAsp-PAKlysCASAHseIMetDDPSucAKPADAPLysHKthrBIleThrTDHilvAAHASilvBNIThrLysIThrMetRMetRIle,Leu,ValRIleIIleIEMPPEPPPCPCKPCODCPKPPSGlcG6PPTS比如图比如图 3 中，谷中，谷氨酸棒杆菌中高氨酸棒杆菌中高丝氨酸缺陷或苏丝氨酸缺陷或苏氨酸缺陷的赖氨氨酸缺陷的赖氨酸生产菌株，大酸生产菌株，大肠杆菌中甲硫氨肠杆菌中甲硫

28、氨酸缺陷、二氨基酸缺陷、二氨基庚二酸缺陷或异庚二酸缺陷或异亮氨酸缺陷的苏亮氨酸缺陷的苏氨酸生产菌株。氨酸生产菌株。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 34 另一方面，某些化合物另一方面，某些化合物对菌对菌体生长的限制体生长的限制，不论是氨基酸或，不论是氨基酸或其他化合物（其他化合物（ 比如磷酸盐比如磷酸盐 ）, 都都可能成为有利于特定生物过程的可能成为有利于特定生物过程的最优控制的技术条件。最优控制的技术条件。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 35 尽管连续培养得到的结果表尽管连续培养得到的结果表明，赖氨酸的生成是与细胞的生明，赖氨酸的生成是与细胞的生长是相关联的。但长是相关

29、联的。但在在有效分泌有效分泌的的生理条件下，氨基酸生产菌一般生理条件下，氨基酸生产菌一般都处于生长受限制的状态。都处于生长受限制的状态。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 36 然而，对于与生长限制相关的中心然而，对于与生长限制相关的中心代谢（代谢（ central metabolism ） 和外围代和外围代谢（谢（peripheral metabolism） 的改变如的改变如何影响氨基酸的有效生成，还不很清楚；何影响氨基酸的有效生成，还不很清楚；这或许与影响到许多不同的基因和操纵这或许与影响到许多不同的基因和操纵子的调节网络子的调节网络 （ regulatory networks )

30、 的作用有关。的作用有关。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 37谷氨酸的生产可以建筑在完全谷氨酸的生产可以建筑在完全不同的细胞代谢态势下。许多方法不同的细胞代谢态势下。许多方法可诱导其分泌，包括生物素饥饿法可诱导其分泌，包括生物素饥饿法（用于谷氨酸生产的谷氨酸棒杆菌（用于谷氨酸生产的谷氨酸棒杆菌是生物素缺陷型）、添加胺类表面是生物素缺陷型）、添加胺类表面活性剂、在菌体生长期添加青霉素、活性剂、在菌体生长期添加青霉素、甘油或脂肪酸缺陷菌株在限制条件甘油或脂肪酸缺陷菌株在限制条件下生长等。下生长等。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 38 很显然，所使用的这些很显然，所使用的这些

31、方法都对细胞质膜或细胞壁方法都对细胞质膜或细胞壁有一定影响，但使细胞膜通有一定影响，但使细胞膜通透性发生变化的机理是不完透性发生变化的机理是不完全一样的。全一样的。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 39谷氨酸的分泌曾被认为是因为相谷氨酸的分泌曾被认为是因为相对简单和直接的代谢改变（即影响细对简单和直接的代谢改变（即影响细胞膜性质）的而引起的，然而最近发胞膜性质）的而引起的，然而最近发现在没有紧缩效应的大肠杆菌（现在没有紧缩效应的大肠杆菌（rel A 基因缺损）中，通过氨基酸饥饿法可基因缺损）中，通过氨基酸饥饿法可以触发细胞的借助于载体的谷氨酸分以触发细胞的借助于载体的谷氨酸分泌活性，

32、这表明全局调节机制对分泌泌活性，这表明全局调节机制对分泌的影响是存在的。的影响是存在的。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 40 1.2 氨基酸生产的微生物生理学氨基酸生产的微生物生理学对于经氧化还原过程实现氨基酸对于经氧化还原过程实现氨基酸生产的重要性，早有所认识。但对其生产的重要性，早有所认识。但对其中大多数现象（至少在分子水平上）中大多数现象（至少在分子水平上）仍未很好理解。对一般的代谢调节现仍未很好理解。对一般的代谢调节现象做如下五点概述，可能将有利于我象做如下五点概述，可能将有利于我们从生理学的角度去理解代谢中间产们从生理学的角度去理解代谢中间产物的生产。物的生产。 2021

33、-12-4张星元：发酵原理（讲座） 41（1） 氨基酸的生产与菌体生长之间氨基酸的生产与菌体生长之间的关系尚未解决（耦合与否？）。的关系尚未解决（耦合与否？）。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 42（2） 限制生长条件下的微生物生理。限制生长条件下的微生物生理。 在缓慢生长或非生长条件下，有目的在缓慢生长或非生长条件下，有目的地控制基质的吸收与代谢的速率，能地控制基质的吸收与代谢的速率，能提高发酵工业生产效率。因此，要用提高发酵工业生产效率。因此，要用分子技术或生化技术对此进行深入细分子技术或生化技术对此进行深入细致的研究，以阐明在限制生长条件下，致的研究，以阐明在限制生长条件下，微

34、生物的生理背景同工业生物过程的微生物的生理背景同工业生物过程的应用必定密切相关的道理。应用必定密切相关的道理。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 43（3）溢出代谢的概念：）溢出代谢的概念： 当这个生当这个生理学的新见识同过量生产的特定代理学的新见识同过量生产的特定代谢条件，在分子水平上发生相互关谢条件，在分子水平上发生相互关联的时候，溢出代谢（联的时候，溢出代谢（overflow metabolism）的概念是值得关注的。的概念是值得关注的。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 44 例如，在过量生产某种产物的代谢例如，在过量生产某种产物的代谢条件下，已观察到某些特有的代谢中间

35、条件下，已观察到某些特有的代谢中间产物，如产物，如 丙酮酸、丙酮酸、 - 酮戊二酸酮戊二酸等，会等，会大量分泌。这些特定的代谢中间产物先大量分泌。这些特定的代谢中间产物先在细胞内累积（这取决于碳源的性质和在细胞内累积（这取决于碳源的性质和生长限制），然后分泌到细胞外（如果生长限制），然后分泌到细胞外（如果细胞具备允许这些代谢中间产物跨膜机细胞具备允许这些代谢中间产物跨膜机构或有输送系统存在），从而构或有输送系统存在），从而抵消在碳抵消在碳架物质、还原当量和代谢能等在代谢中架物质、还原当量和代谢能等在代谢中的不平衡。的不平衡。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 45（4）代谢不平衡：）代

36、谢不平衡： 细胞的代谢不平衡指碳细胞的代谢不平衡指碳架物质不平衡，特别是指代谢能和还原当量架物质不平衡，特别是指代谢能和还原当量的不平衡。代谢不平衡的条件常常涉及到的不平衡。代谢不平衡的条件常常涉及到溢溢流阀流阀（ overflow valves ）的功能。事实上，的功能。事实上，代谢网络之所以能够在失去平衡的条件下代谢网络之所以能够在失去平衡的条件下（如大量氨基酸的过量合成（如大量氨基酸的过量合成 ）得以维持，）得以维持，是因为它具备使通常情况下（指碳架物质和是因为它具备使通常情况下（指碳架物质和代谢能限制的条件下代谢能限制的条件下 ）耦合在一起的代谢耦合在一起的代谢流流脱钩脱钩的灵活性的灵

37、活性。 好几个术语，如好几个术语，如 “ 解耦解耦联联 ”、“ 代谢能溢出代谢能溢出 ” 等就是用来说明等就是用来说明这种灵活性的。这种灵活性的。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 46 实际上，曾有人这样描述过细实际上，曾有人这样描述过细菌的这种行为：菌的这种行为：“ 可以推断，细菌可以推断，细菌对于代谢能过剩的解决办法是把它对于代谢能过剩的解决办法是把它浪费（用）掉浪费（用）掉 ”。然而，对特定条。然而，对特定条件下（如与不生长发生耦合或耦合件下（如与不生长发生耦合或耦合欠佳的氨基酸的生产条件下）代谢欠佳的氨基酸的生产条件下）代谢能耗散的机制，尚待进行深入的研能耗散的机制，尚待进

38、行深入的研究。究。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 47 在细菌中存在很多能够浪费代在细菌中存在很多能够浪费代谢能的反应和反应组合。如谢能的反应和反应组合。如 K+ 离离子或子或 NH4+ 的无效循环，（在某些的无效循环，（在某些情况下也会发生）质子的无效循环。情况下也会发生）质子的无效循环。这样的代谢能溢出反应表明，这样的代谢能溢出反应表明，合成合成代谢与分解代谢之间存在不平衡代谢与分解代谢之间存在不平衡, 而这正是氨基酸生产菌种所希望得而这正是氨基酸生产菌种所希望得到满足的条件。到满足的条件。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 48 其实，关于谷氨酸棒杆菌的赖氨其实，关

39、于谷氨酸棒杆菌的赖氨酸生产的能量溢出问题已有过争论，酸生产的能量溢出问题已有过争论，赖氨酸生产的最大转化率可能受到过赖氨酸生产的最大转化率可能受到过量的代谢能的约束。赖氨酸的合成的量的代谢能的约束。赖氨酸的合成的高度增加使代谢发生改变，引起代谢高度增加使代谢发生改变，引起代谢能的过剩。因此，可以认为能的过剩。因此，可以认为高的能量高的能量耗散能力适合于代谢中间产物（如氨耗散能力适合于代谢中间产物（如氨基酸）的过量合成基酸）的过量合成。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 49（5）有关渗透适应性问题：）有关渗透适应性问题： 在分批培养的条件下，醪液中溶在分批培养的条件下，醪液中溶质（碳源

40、和能源）的浓度会发生很大质（碳源和能源）的浓度会发生很大的变化，那么了解和控制有关渗透适的变化，那么了解和控制有关渗透适应性的代谢过程显然就相当重要了。应性的代谢过程显然就相当重要了。细胞外部渗透压（实际上是水活度）细胞外部渗透压（实际上是水活度）的改变不但对细胞的代谢，而且对基的改变不但对细胞的代谢，而且对基质的吸收、产物的释放都会产生有效质的吸收、产物的释放都会产生有效的影响。的影响。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 50 关于真细菌这方面的基本机制的关于真细菌这方面的基本机制的研究，可能促使我们去选育已丧失以研究，可能促使我们去选育已丧失以下两种能力的菌株：下两种能力的菌株：

41、 一是丧失对不利于生产的渗透保一是丧失对不利于生产的渗透保护物质（如海藻糖）的合成能力；二护物质（如海藻糖）的合成能力；二是丧失对代谢和输送反应做出渗透压是丧失对代谢和输送反应做出渗透压响应的能力。响应的能力。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 51 2. 氨基酸生物合成的代谢流量分析氨基酸生物合成的代谢流量分析 除了代谢途径及其调节机制和除了代谢途径及其调节机制和已知途径的化学计量分析以外，稳已知途径的化学计量分析以外，稳态代谢流量和流量动力学分析对于态代谢流量和流量动力学分析对于理解氨基酸生产的代谢网络也越来理解氨基酸生产的代谢网络也越来越重要。越重要。 2021-12-4张星元：

42、发酵原理（讲座） 52 这既涉及到提供碳架物质这既涉及到提供碳架物质、 氧氧化还原当量和代谢能的中心代谢途化还原当量和代谢能的中心代谢途径，也涉及到那些通往特定氨基酸径，也涉及到那些通往特定氨基酸的合成代谢途径。代谢流量分析和的合成代谢途径。代谢流量分析和代谢流的动力学分析的一个主要目代谢流的动力学分析的一个主要目的在于鉴定代谢网络中所一般认为的在于鉴定代谢网络中所一般认为的限速步骤。的限速步骤。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 53 CO2NADP+NADPH+NADP+NADPH+6-P-GF-6-PFDPDHAPGA-3-P1,3-2P-GA3-P-GA2-P-GAPEPPY

43、RAcCoACTASCAOAAICA -KGScCoAFMAMLAGOAGlcG6P6-P-GARu-5-PX-5-PR-5-PE-4-PSed-7-PPRPPUMPCTPdTMPAMPGMPDNA,RNAATPPR-ATPPR-AMPBBMBBMIGPPRAICIAPHPHOLHisIGlu -KGH2OPiHALNAD+NAHD+NAD+NAHD+GlnGluGlu -KGNADPH+NH3ATPADPADPATPNADPH+NADP+PiATPADPNAD+AspGluArgProCHOTrpPRPP PPiSerGluPREBTyrPheGluGluSerCysS2-SO42-AlaG

44、luGOAGlyAMPGMPPRPPFig. Metabolic Pathyways for the Biosynthesis of Amino AcidsFADH2NADH+GTPCO2NADH+NADH+CO2HisEDAHPGlcPEPPYRASAATPADPAsp-PNADPH+NADP+DDPNADPH+NADP+HseThrIleMetLysIDAPH4DSCAGlu -KGNADPH+NH3SCACO2LysEOrnCitGluAsp -AL -OIVAValGluNADPH+NADP+AcCoALeuGluH2OppspykFppcpckpcodc2021-12-4张星元：发酵

45、原理（讲座） 54 主要可通过两种不同的方法定量地、主要可通过两种不同的方法定量地、完整地描述细胞的代谢网络：完整地描述细胞的代谢网络：（1）描述各步反应（酶）的动力学属）描述各步反应（酶）的动力学属性及其他有用数据的方法；性及其他有用数据的方法；（2）直接测定基质、产物及一些代表）直接测定基质、产物及一些代表性中间产物的方法，如物料平衡性中间产物的方法，如物料平衡 （ 代代谢物平衡）技术。谢物平衡）技术。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 55 如果要对代谢网络做出完整描述并如果要对代谢网络做出完整描述并且对各步反应及其代谢物流量的重要程且对各步反应及其代谢物流量的重要程度做出评价

46、，就要弄清每一个酶的的调度做出评价，就要弄清每一个酶的的调节（包括对酶的活性的调节和对表达水节（包括对酶的活性的调节和对表达水平的调节）情况，这当然是不容易如愿平的调节）情况，这当然是不容易如愿的，但已被实践证明，以下简化的策略的，但已被实践证明，以下简化的策略也可以用来对代谢流进行定量的描述。也可以用来对代谢流进行定量的描述。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 56 第一种方法，在某些场合下用代谢第一种方法，在某些场合下用代谢控制理论来对有关生物技术学的研究进控制理论来对有关生物技术学的研究进行反应动力学的分析。其基本原理就是行反应动力学的分析。其基本原理就是分析酶活力或酶浓度的微量

47、变化对代谢分析酶活力或酶浓度的微量变化对代谢流量及代谢物浓度的影响，进而确定特流量及代谢物浓度的影响，进而确定特定的流量控制系数定的流量控制系数 （ flux control coefficients ），），该系数反映特定反应对该系数反映特定反应对复杂途径的影响程度。另一种更常用的复杂途径的影响程度。另一种更常用的理论是生化系统理论（略）。理论是生化系统理论（略）。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 57 第二种方法，代谢物平衡技术。第二种方法，代谢物平衡技术。其模式的推导建立在对基质、产物及其模式的推导建立在对基质、产物及某些重要中间产物的直接测定上。这某些重要中间产物的直接测定上

48、。这种方法已在谷氨酸棒杆菌生物合成赖种方法已在谷氨酸棒杆菌生物合成赖氨酸的研究中得到了应用。如果所研氨酸的研究中得到了应用。如果所研究的代谢网络的途径结构已知，又假究的代谢网络的途径结构已知，又假定进行稳态代谢，那么就可通过准确定进行稳态代谢，那么就可通过准确测得的所有进出细胞代谢流的流量，测得的所有进出细胞代谢流的流量，推导出特定途径的代谢流量分布。推导出特定途径的代谢流量分布。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 58 但用这类方法计算，很难把代谢但用这类方法计算，很难把代谢环路（环路（ 如如TCA环环 ）、重要节点（）、重要节点（ 如如 PYR、 PEP 节点节点 ） 、以及平衡

49、反应、以及平衡反应（酶促反应的正向和逆向流量）的特（酶促反应的正向和逆向流量）的特殊重要性包罗在内。这是这类方法的殊重要性包罗在内。这是这类方法的局限性。为了弥补这种局限性，近年局限性。为了弥补这种局限性，近年已有几种技术用到这种类型的分析中已有几种技术用到这种类型的分析中去了。去了。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 59 如采用示踪流量实验（如采用示踪流量实验（tracer flux experiments ）技术、快速取技术、快速取样技术及核磁共振（样技术及核磁共振（NMR）技术技术可获得关于代谢流分布的另外一可获得关于代谢流分布的另外一些信息，些信息， 如代谢网络的有关组成如代

50、谢网络的有关组成部分中的流量分布、部分中的流量分布、 胞内不同代胞内不同代谢产物的累积量，谢产物的累积量， 以及它们各自以及它们各自随时间而变化的情况。随时间而变化的情况。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 60 有人分析了谷氨酸棒杆菌在对数生长有人分析了谷氨酸棒杆菌在对数生长期、赖氨酸生产期（生物素量足够）及谷期、赖氨酸生产期（生物素量足够）及谷氨酸生产期（生物素限量）等条件下胞内氨酸生产期（生物素限量）等条件下胞内代谢流的不同分布情况（代谢流的不同分布情况（ 下图），它们下图），它们以以13C 标记的葡萄糖为碳源进行分批发酵，标记的葡萄糖为碳源进行分批发酵，然后运用然后运用 NMR

51、 测定标记了的代谢物，同测定标记了的代谢物，同时运用质量平衡法进行计算，得到了图中时运用质量平衡法进行计算，得到了图中的流量分布图，或称的流量分布图，或称代谢断面代谢断面 （ sections of the metabolism ）图图。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 61GluG6PF6PGA3PPYRR5PCO2OAACO2GOABiomass HMP TCA CO2回补 EMP1005940733852171351810(60)14 15436133A. 对数生长期GluG6PF6PGA3PPYRR5PCO2OAACO2GOABiomass HMP TCA CO2回补 EM

52、P100524783989821341816(80)6 15335215LysCO21216244B. 赖氨酸生成期GluG6PF6PGA3PPYRR5PCO2OAACO2GOABiomass HMP TCA CO2回补 EMP100831731497000322133(25)0 164434411C. 谷氨酸生成期Glu552021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 62 由图可见，在不同条件下，由图可见，在不同条件下，流量发生了显著的变化。酵解途径流量发生了显著的变化。酵解途径的的 HMP 旁路的流量分布在赖氨酸旁路的流量分布在赖氨酸生成时增加，而在谷氨酸生成时则生成时增加，而在谷氨酸生成

53、时则下降。在氨基酸分泌的情况下，回下降。在氨基酸分泌的情况下，回补反应变得更重要一些。补反应变得更重要一些。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 63 另一个长期以来不能确定的另一个长期以来不能确定的问题也在研究中得到了解决，也问题也在研究中得到了解决，也就是氨基酸生成条件下就是氨基酸生成条件下 GOA 环环活力的问题，在氨基酸生成条件活力的问题，在氨基酸生成条件下，下， GOA 环的活力实测是非常环的活力实测是非常低的。低的。 下图为在下图为在不同转化率时的理不同转化率时的理论流量分布图论流量分布图。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 64 G6PF6PPEPPYRAcCoAR

54、u5PGlcCO2OAALys1001511837982100515303317331158520A. 平衡生长G6PF6PPEPPYRAcCoARu5PGlcCO2OAALys10069499100633512812835B. YLys/Glc=35%G6PF6PPEPPYRAcCoARu5PGlcCO2OAALys100150-5075100-25750075C. YLys/Glc=75%CO2CO2CO251252021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 65课外学习参考资料：课外学习参考资料：Metabolic Pathway Synthesis (p288)Metabolic Flu

55、x Analysis (p309)in Metabolic Engineering, 1998Metabolic Flux Balance Analysis (p13) in Metabolic Engineering, 19992021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 66 3. 基质的跨膜吸收与氨基酸的跨膜输出基质的跨膜吸收与氨基酸的跨膜输出 基质的吸收和产物的输出对于氨基基质的吸收和产物的输出对于氨基酸的生成是非常重要的。对于某些细菌，酸的生成是非常重要的。对于某些细菌，特别是大肠杆菌对基质吸收的不同机制特别是大肠杆菌对基质吸收的不同机制已作了详尽的研究，但对于其它生物工已作了详尽的研

56、究，但对于其它生物工程有关的微生物，如谷氨酸棒杆菌的蔗程有关的微生物，如谷氨酸棒杆菌的蔗糖及羧酸的吸收机制则知之甚少。而关糖及羧酸的吸收机制则知之甚少。而关于产物氨基酸怎样跨过膜而被分泌出细于产物氨基酸怎样跨过膜而被分泌出细胞的问题，似乎或多或少被忽略掉了。胞的问题，似乎或多或少被忽略掉了。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 67 近年的研究表明，在氨基酸生产近年的研究表明，在氨基酸生产的条件下，的条件下， “ 氨基酸被动扩散跨过氨基酸被动扩散跨过细胞质膜细胞质膜 ” 这一设想是武断的。谷这一设想是武断的。谷氨酸棒杆菌中至少有谷氨酸、赖氨酸、氨酸棒杆菌中至少有谷氨酸、赖氨酸、异亮氨酸

57、及苏氨酸，以及大肠杆菌中异亮氨酸及苏氨酸，以及大肠杆菌中谷氨酸和苏氨酸，都是借助于载体的谷氨酸和苏氨酸，都是借助于载体的输送过程，而且不纯粹是被动的。而输送过程，而且不纯粹是被动的。而运动发酵单胞菌（运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）的重组菌株中，丙氨酸则是依靠简单的重组菌株中，丙氨酸则是依靠简单扩散机制来分泌。扩散机制来分泌。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 68 详细了解特定氨基酸跨过细胞质详细了解特定氨基酸跨过细胞质膜渗透屏障的机理，对于提高发酵过膜渗透屏障的机理，对于提高发酵过程的效率和转化率也非常重要。尽管程的效率和转化率也非常重要。尽管采用细菌来生产氨基

58、酸往往可以获得采用细菌来生产氨基酸往往可以获得极高的胞外氨基酸浓度，人们却并未极高的胞外氨基酸浓度，人们却并未意识到这至少部分是由于细胞向载体意识到这至少部分是由于细胞向载体系统所催化的分泌反应提供了代谢能系统所催化的分泌反应提供了代谢能的结果。这一点已被有关赖氨酸和异的结果。这一点已被有关赖氨酸和异亮氨酸分泌的研究所证实亮氨酸分泌的研究所证实 。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 69 下图显示了谷氨酸棒杆菌在下图显示了谷氨酸棒杆菌在异亮氨酸生产过程中发生的不同异亮氨酸生产过程中发生的不同流量。所观察到的异亮氨酸的净流量。所观察到的异亮氨酸的净产量实际上是借助于载体而形成产量实际上

59、是借助于载体而形成的向外分泌的流量、向内吸纳的的向外分泌的流量、向内吸纳的流量及扩散流量的代数和。流量及扩散流量的代数和。 2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 702021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 71 在分批发酵的开始阶段，异在分批发酵的开始阶段，异亮氨酸从胞内向胞外扩散，但随亮氨酸从胞内向胞外扩散，但随着胞外异亮氨酸浓度的增加，其着胞外异亮氨酸浓度的增加，其扩散方向也发生改变，并越来越扩散方向也发生改变，并越来越多地抵消异亮氨酸载体系统的分多地抵消异亮氨酸载体系统的分泌作用。泌作用。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 72 这一方面解释了所能获得的最这一方面解释了

60、所能获得的最大胞外浓度取决于异亮氨酸对质膜大胞外浓度取决于异亮氨酸对质膜的透性常数，以及分泌和吸收载体的透性常数，以及分泌和吸收载体的活力；另一方面，由此可看出在的活力；另一方面，由此可看出在生产条件下可能发生生产条件下可能发生由代谢能驱动由代谢能驱动的分泌与被动回流构成的无效循环的分泌与被动回流构成的无效循环是浪费代谢能的是浪费代谢能的。2021-12-4张星元：发酵原理（讲座） 73 一般说来，抵消氨基酸的产量的一般说来，抵消氨基酸的产量的氨基酸的吸收系统对于整个过程并不氨基酸的吸收系统对于整个过程并不重要。用谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸时，重要。用谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸时，吸收系统的活力非常低