微生物实验室操作指导

1、微生物实验室操作指导书目录（-）安全守则（-）检验总则（三）基本技术要求（四）食品平板菌落计数（五）食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法（六）沙门氏菌检验（七）金黄色葡萄球菌检验（八）霉菌计数（九）革兰氏染色（十）空气中微生物的检验（h一）水中微生物的检验（十二）食品接触面的微生物检验（十三）蔬菜农残的快速检测审核:编制:(-)安全守则1进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。2在进行高压、干燥、消毒等工作吋，工作人员不得擅自离开现场，认真观察温度、吋间， 蒸镭易挥发、易燃液体吋，不准宜接加热，应置水浴锅上进行。3严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液、病原体溅出容器外吋

2、，应 立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方能离开现场。4工作完毕，两手用清水肥皂洗净，必耍吋可用(杀菌剂)新洁尔灭、过氧乙酸液浸泡手， 然后用水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要吋高压消毒。5实验完毕，及时清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处理，并填写仃常 工作记录。6每日卜班，认真检杳水、相关电源是否关闭和止在使用的设备运转是否止常，并认真记录。 下班前关好门窗，方可离去。（二）检验总则1主题内容与适用范围木文规定了微生物检验一般规则。木文适用于食品中微生物学检验的采样、检验及结果报告。2样品的采集2.1采样口的确保采集的样品能代衣全部被检验的物质，使检验分析更具代衣

3、性。2.2采样原则2. 2.1采集的样品要有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、 周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在，同时能反映全部被检食品的组 成、质量和卫生状况。2. 2.2应设法保持样品原有微生物状况，在进行检验前不得污染，不发生变化。2. 2.3采样必须遵循无菌操作程，容器必须灭菌，避免环境屮微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，新洁尔灭、酒精等消毒物灭菌，更不能含有此类消毒药物，以避免杀掉样品中的 微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可使用。2.3采样数量取样数量的确定，应考虑分析项目的要求、分析方法的要求及被检物的均匀程度三个因索。样品应一

4、式三份，分别供检验、复检及备查使用，每份样品数量一般不少于200go根据不同种类采样数量略有不同，实验室检验样品一般为25克。2.4采样方法 2. 4. 1采取随机抽样的方式。2.4.2直接食用的小包装食品，尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。2.4.3如为非冷藏易腐食品，应迅速将所采样品冷却至0 4°c。2.4.4不要使样詁过度潮湿，以防食詁屮固有的细菌增殖。2.4.5在将冷冻食品送到实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。样甜一旦融化，不可使 其再冻，保持冷却即可。2.5样品的保存和运送2. 5.1样品采集完后，应迅速送往实验室检验，送检过程屮一般不超过3h,如路程较远，

5、可 保存在1 5°c环境屮，如需冷冻者，则在冷冻状态下送检。2. 5. 2冷冻样品应存放在一15°c以下冰箱内；冷却和易腐食品应存放在0 5°c冰箱或冷却库 内；其它食品可放在常温冷暗处。2. 5. 3运送冷冻和易腐食詁应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途屮样品不升温 或不融化。2.5.4待检样品存放时间一般不应超过36小时。3检验样品的制备3.1样詁的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。3.2检验冷冻样品前应先使其融化。可在04°c融化，时间不超过18小吋，也可在温度不 超过45°c的环境中融化，吋间不超过15分钟。3.3检验液体或半固

6、体样品前应先将其充分摇匀。如容器已装满，叮迅速翻转25次；如未 装满，可于7s内以30cm的幅度摇动25次。从混样到检验间隔时间不应超过3分钟。3.4开启样品包装前，先将表面擦干净，然后用75%乙醇消毒开启部位及其周围。3.5非粘性液体样品可用吸管吸取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基内，吸管插入样 品内的深度不应超过2. 5cm,也不得将吸有样品的吸管浸入稀释液或培养基内。3.6粘性液体样品可用灭菌容器称取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基。3.7固体或半固体样品可用灭菌的均质杯称取一定量，再加适量的稀释液或培养基进行均 质，从样品的均质到稀释和接种，相隔时间不应超过15分钟。4检验4.

7、1实验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责，严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。4.2检验所使用的稀释液、试剂、培养基接触的一切器皿必须经过有效的灭菌。4.3实验室所用仪器、设备的性能应定期检查和校正。4.4制备试剂和培养基所用的水，应为无离子水或用玻璃器血蒸傭的蒸傭水。4.5检验结束后，所有带菌的培养基、试剂、稀释液和器皿必须尽快灭菌和洗刷。清洗过的 器ih1不应残留洗涤剂的痕迹。5检验记录和结果的报告5.1经检验的每份样詁都应有完整的检验记录。样品检验过程屮所用方法、出现的现象和结 果等均要用文字写出试验记录，以作为对结果分析、判定的

8、依据，记录要求详细、清楚、真 实、客观、不得涂改和伪造。5.2检验结束后，根据检验结果，及吋填写检验报告书，签字并经负责人审核签字后发出。（三）基本技术要求1无菌操作要求微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多实验要求在无菌的条件下进行, 主要原因，一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌 由于操作不当造成个人污染。要求如下:1.1接种细菌吋必须穿工作服、带工作帽;1.2进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用;1.3接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球将手擦干净;1.4进行接种所用

9、的吸管、平川i及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器川l,不能放置后再使用，金屈用具应高压灭菌或用酒精点燃烧灼三次后使用;1.5从包装屮取出吸管时，吸管尖部不能触及试管或平皿边;1.6接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌活样品时，吸管从包装中取出后及 打开试管塞都耍通过火焰消毒；1.7接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金屈丝，必要时述要烧到针和环与杆的连接 处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水屮煮沸5min,再经火焰烧灼；1.8吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。2无菌间使用要求2.1无菌间应密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及门

10、，另尽量设有的小窗，以备进入无菌间后传递物品。2.2无菌间应保持清洁，工作后用煤酚皂液溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与试验无关 的物晶。2.3无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬掉紫外灯消毒时，需30w紫外灯，距离工作台im处，照射吋间不少于30分钟，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精球轻轻擦拭，除去上面的灰尘和油垢，以减少 紫外线穿透的影响。2.4处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意岀入，如需要传递物品，可通过小 窗传递。2.5在无菌间需用安装空调时，则应有过滤装置。3消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被

11、污染和接种的培养物等，必须经灭菌 后方能使用。3.1灭菌前准备3.1.1所有需经灭菌的物品首先要清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金 属筒应将上面气孔打开。3.1.2装培养基的三角瓶塞好棉塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布 包好。3.2装放3. 2.1大型高压蒸气锅：放置灭菌物品不应超过锅内容积的80%,物品应放置锅内搁架上或 铁丝筐中。3.2.2手提式高压锅：将物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。3.3设备检查3. 3.1检杳门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。3. 3.2压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察

12、是否漏气， 压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。3. 3.3对冇自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合丁进行灭 菌处理的要求。3.4灭菌处理于提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：3.4.1手提式高压锅在主体内加入3l清水，立式高压锅加水16l（重复使用时应将水量补足, 水变混浊需要更换）。3.4.2手捉式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管屮（无软管或软管锈蚀破裂的 灭菌器不得使用）。3.4.3盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶 盖上的排气阀放出冷气（水沸腾后排气1015min） o3.4.4

13、关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定吋间（按灭菌物品性质与有关情 况而定）。3.4.5达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸汽，待压力恢复到零时， 自然冷却至60°c后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待 自然冷却，压力恢复至零，温度降到60°c以下再打开盖取物，以防止突然减压液体剧烈沸腾 活容器爆破。3.5灭菌温度与时间3.5.1压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间见下表：物口口灭菌时间,min115°c121°c不含糖等耐热培养基15含糖类等耐热培养基15 20染菌培养物30器械器皿303.6灭菌处理：灭菌

14、后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器屮取出应仔细检查，以免再度 污染。3.6.1物品取出，随即检查包装的完整性，若冇破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌物品使用。3.6.2取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用。3. 6.3培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。3. 6.4取出的物品掉落在地或误放不洁z处，或沾冇水液，均视为受到污染，不可作为无菌 物品使用。3. 6.5取岀的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。3. 6.6凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。3. 6.7每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操

15、作者。4有毒有菌污物处理要求微生物实验室所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。4. 1经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待 统-进行高压灭菌。4.2经微生物污染的培养物，必须经12tc, 30min高压灭菌。4.3染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸溶液中，最少浸泡24小吋，再经 121°c, 30min高压灭菌。4.4涂片染色冲洗片的液体，一般町宜接冲入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂液中浸泡 24h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须经高压灭菌后洗涤。4.5打碎的培养物，立即用5%煤酚皂液或石炭酸喷洒和浸

16、泡被污染部位，浸泡半小吋后再擦 拭干净。4.6污染的工作服或进行烈性菌试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经 高压灭菌后方能洗涤。5玻璃器皿的清洗要求5.1目的为了保证微生物实验顺利进行，保证实验结果的准确性，不影响实验进度，必须把器皿 彻底清洗t净。5.2注意事项5. 2.1任何洗涤方法，都不应对玻璃器皿有所损伤，不能用有腐蚀作用的化学药剂，也不能 使用比玻璃器皿硕度大的物品来擦拭玻璃器皿。5. 2.2 一般新的玻璃器血用2%的盐酸液浸泡数小时，后用水冲洗干净。5. 2.3用过的器皿应立即洗涤，放置太久会增加洗涤困难。5.2.4强酸、强碱及其它氧化物和有挥发性的有毒物品，都不能

17、倒在洗涤榊内，以免污染环 境水质，必须倒在废水缸中。5.2.5含有对人体有传染性病菌的器具，应先煮沸灭菌后再进行洗涤。5.2.6难洗涤的器皿不要与易洗涤的器皿放在一起，以免增加洗涤的麻烦。有油的器皿不要 与无油的器皿混在一起，否则使木來无油的器皿沾上了油垢，浪费约剂和时间。5.3洗涤剂的种类：水、洗衣粉、柠檬洗涤剂、肥皂5.4洗涤方法5.4.1含有琼脂培养基的玻璃器皿的洗涤方法：事先应将器皿中的琼脂刮去，然后用清水洗 涤，并用试管刷刷其瓶壁，以除去粘污在壁上的灰尘和油垢。用洗衣粉水洗去油污，然后用 自來水冲洗。洗好后的器川i应倒置晾干或置于干燥箱中干燥至无水滴。5.4.2载玻片及盖玻片的洗涤法

18、：新载玻片及盖玻片先在20%的盐酸溶液中浸一小时，然后 用自來水冲洗23次，最后用蒸饰水换洗旷3次。用过的载玻片及盖玻片，应用纸擦去油垢, 再放在5%的洗衣粉水中煮30分钟后立即用自來水冲洗，然后放在稀的洗液中浸泡2小时， 再用自来水冲洗至中性。5.4.3移液管、倒管的洗涤方法：新的移液管及倒管先在的5 %盐酸溶液中浸一小时，然后 用自来水冲洗几次，最后用蒸饰水换洗几次。用过的移液管、倒管先用自来水洗去表而的残 液，再放在洗衣粉水屮浸泡一小时以上，再用自来水冲洗至管内舉无残渣，最后用蒸他水换 洗次，晾干后入恒温干燥箱屮烘干。6培养基、无菌水的制备6. 1基本原理培养基的种类很多，不同微生物所需

19、耍的培养基不同。培养基制成后的物理状态可分为 液体、i古i体、半同体三种类型。目前所用培养基均为已配制好的生物试剂和纸片。6.2器材三角瓶、试管、烧杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、铝箔纸、角匙、杜氏小管、硅胶塞、 电炉6.3培养基的种类营养琼脂培养基、乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、伊红美兰琼脂培养基、马铃 薯-葡萄糖琼脂培养基（附加抗菌素）、平板计数琼脂、刀桂基硫酸盐胰蛋口冻肉汤、煌绿乳糖 胆盐肉汤、ec肉汤、高盐察氏琼脂、三糖铁琼脂等6.4方法步骤6.4.1培养基的制备：6.4.2称量：根据培养基的配方，称取适量药品于搪瓷杯中；6.4.3溶解：用量筒量取所需水量，置电炉上加热，一边搅拌，

20、至完全溶解，加热至沸腾， 拔掉电源，待冷却；6.4.4分装：根据不同需要，立即趁热分装入三角瓶或试管中，分装三角瓶以不超过三角瓶 一半为宜，分装试管一般为管长的1/5 （需根据试管的大小而定）。液体培养基如乳糖胆盐 发酵培养基约分装10毫升左右。6.4.5塞硅胶塞：装好培养基的试管应塞上硅胶塞，松紧合适，紧贴管壁，不留缝隙，约1/2 塞入内，这样即可过滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分的蒸发。6.4.6包装：三角瓶棉塞头部应用锡箔纸包扎，试管集小于试管篓。6.5无菌水的制备：6. 5. 1用10ml移液管量取9. 2ml蒸憾水（稀释水）装入试管中。6.5.2用looinl量筒量取95ml

21、蒸憾水（稀释水）装入150ml的三角瓶中。可置少许玻璃珠于三角瓶内，防止暴沸。6. 5.3量取240ml蒸锚水（稀释水）于250ml的三角瓶小，塞上瓶塞用牛皮纸包扎好，高压 灭菌备用。7设备使用原则7.1实验设备的使用由实验员严格按照操作说明帖进行，其他人员不得随意操作。7.2实验设备的日常维护保养由实验员根据设备操作说明书进行，出现不可排除的故障时， 经部门总经理批准，商请专业人员维修。7.3实验设备应定期进行计量检测，确保仪器的准确性。7.4实验员应爱护仪器设备，使用前应检查，使用后应及时清理清洁，并定期维护保养，下 班前应检查设备电源是否关闭。（四）食品平板菌落计数1主题内容与适用范围木

22、文规定了食品平板菌落计数的方法。木文适用丁航空配餐的各种半成品、成品及原料，有专门规定的检验方法的除外。2设备和材料超净工作台、恒温培养箱（36±1°c）、均质器、振荡器、吸管（1ml、10ml）、平皿、 稀释瓶、天平等3培养基和试剂平板计数琼脂、75%乙醇、磷酸盐缓冲稀释液4操作程序4. 1样品制备4.1.1以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。如有包装，则用75%乙醇在包装开口 处擦拭后取样。4. 1.2制备样品匀液以无菌操作取25g样品，放入装有225ml稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质 l-2min,制成1： 10的样品匀液。如样品均质时间超过2m

23、in,应在均质杯外加冰水冷却。4. 2稀释样品匀液4. 2. 1用10ml灭菌吸管准确吸取1： 10的样品匀液10ml,放入装有90ml稀释剂的150ml稀 释瓶中。迅速振摇，将样品混匀，制成1： 100的样品匀液。振摇时，幅度为30cm, 7s内振 摇25次。从容器中吸取样品匀液和以后的稀释操作中，吸管尖不要碰着瓶口。吸入的液体应 先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端离开液面并贴在容器内壁将液体调至所要求的 刻度。4. 3平板接种 4.3.1对于每个样詁，选用合适的三个连续稀释度的样詁液进行平板计数。4.3.2分别用灭菌吸管吸取lml样品液放入作了适宜标志的平皿内。每个稀释度的样品液用

24、两个平皿。4. 3.3分别加12-15ml平板计数琼脂（约45°c左右）到平皿内。立即将平皿内的样品液和琼 脂培养基充分混合。要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。同时将平板计数琼脂倾入加冇lml 稀释剂的另一灭菌平皿作空白对照。将样品液加入平皿后应立即倾注琼脂培养基，每个样品 从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过20niin。4.4培养待琼脂凝固后将平皿翻转，立即放进36土 1°c的恒温培养箱培养48土2h。培养箱应保持 一定的湿度，经48h培养的琼脂培养基的失重不得超过15%。4. 5菌落计数和记录4.5.1培养后，立即计数每个平板上的菌落数。25-250个菌落为合

25、适范围。如不能立即计数, 应将平板存放于0-4°c,但不得超过24ho4.5.2操作者对同一平板复核自己的计数结果，其差异应在5%之内，而其他人对这一平板重 复计数，其差异应在10%这内。否则，应找出原因，加以校正。4.6计算和记录数字适宜稀释度的两个平板的菌落数平均值或两个稀释度的平板菌落数平均值乘以相应稀释 度倍数计算出每克（毫升）样品中平板菌落数。记录时，只有在换算到每克（毫升）样品中平板菌落数时，才能定下两位有效数字，第 三位数字采用四舍五入的方法记录。也可将样品的平板菌落数记录为10的指数形式。5结果报告报告每克（毫升）样品屮平板菌落数或估计的平板菌落数。注：本文参照sn0

26、168-92出口食品平板计数（五）食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法1主题内容与适用范围木文规定了食品屮大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法。木文适用丁航空食品的检验。2设备和材料吸管（1ml、10ml）、恒温培养箱（36±1°c、44. 5±0.5°c）、冰箱、均质器、振荡器、 平皿、稀释瓶、天平、显微镜等3培养基和试剂月桂基硫酸盐胰蛋示（lst）肉汤、煌绿乳糖胆盐（bglb）肉汤、ec肉汤、伊红美蓝 琼脂（emb）、营养琼脂斜面、色氨酸肉汤、mr-pv培养基、korser氏枸掾酸盐肉汤、结晶紫 中性红胆盐琼脂（vrba）、butterfi

27、eld氏磷酸盐缓冲稀释液、生理盐水、革兰氏染色液、 kovacs氏靛基质试剂、甲基红指示剂、vogcs-pros kaucr （v-p）试剂、4样品制备4.1以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。如有包装，则用75%乙醇在包装开口处 擦拭后取样。4. 2制备样品匀液以无菌操作取25g样品，放入装冇225ml稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质 l-2min,制成1： 10的样品匀液。如样品均质时间超过2min,应在均质杯外加冰水冷却。4. 3稀释样品匀液用10ml灭菌吸管准确吸取1： 10的样品匀液10ml,放入装有90ml稀释剂的150ml稀释瓶中。 迅速振摇，将样品混匀，制成

28、1： 100的样品匀液。5大肠菌群的测定5. 1大肠菌群mpn值的测定5. 1.1对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白月示（lst）肉汤，每管接种51。5. 1.2将接种管置于36±1°c的培养48±2ho5. 1.3观察试管的产气情况：检查倒管内是否冇气泡产生，记录在24h和48h内产气的lst 肉汤管数。如所冇lst肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如冇产气者，则进一步 作证实试验。5. 2大肠菌群的证实试验5.2. 1将所有产气管用直径为3nun的接种环移种到煌绿乳糖胆盐（bglb）肉汤管中。5.2.2

29、置bglb肉汤管于36± 1°c的培养48±2h。5. 2. 3记录所有bglb肉汤管的产气管数。5. 2. 4结果报告：按bglb肉汤产气管数，查mpn表报告每克（毫升）样品中大肠菌群的mpn 值。6粪大肠菌群测定6.1用接种环将所有48土2h内产气的lst肉汤管培养物移种于ec肉汤管中。6. 2将所有接种的ec肉汤管在30min内放入44.5±0.5°c水浴箱内，培养24±2h。水浴箱的 水平面应高于肉汤培养基液面。应以己知为44. 5°c产气阳性的大肠杆菌和44. 5°c不产气的产 气肠杆菌或其他大肠菌群细菌

30、作阳性和阴性对照。6. 3记录ec肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验 阴性。6. 4结杲报告：按产气管数，杳mpn表报告每克（毫升）样品中粪大肠菌群的mpn值。7大肠杆菌测定7. 1将6. 3条中的ec肉汤管继续培养24h取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝（emb） 平板,36±1°c的培养24±2ho7. 2检查平板上有无具黑色屮心有光泽或无光泽的典型菌落。7. 3如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落，则从毎个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36±

31、;1°c的 培养 18-24ho7.4将斜而培养物移种到下列培养基进行生化试验。7.4.1色氨酸肉汤：在36±1°c的培养24±2h后，加kovacs氏试剂0. 2-0. 3ml,上层出现红 色为靛基质阳性反应。7.4. 2 mr-vp培养基：在36±1°c的培养48±2h后。以无菌操作移取培养物1ml至13mm*100mm 试管中，加5% a-荼酚乙醇溶液0.6ml, 40%氢氧化钾溶液0. 2nd和少许肌酸结晶，振摇试 管后静置2h,如出现伊红色，为vp试验阳性。将mr-vp培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液

32、。如培养物变红色，为甲基 红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。7.4. 3 korser氏枸掾酸盐肉汤：于36± 1°c的培养96h记录有无生长。7. 4. 4 lst肉汤：于36±1°c的培养48±2h,观察试管屮是否产气。7.4.5革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。7.4. 6大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下靛基质mrvp枸掾酸盐鉴定（型别）+典型人肠杆菌+非典型犬肠杆菌+典型中间型+非典型中间型+典型产气肠杆菌+非典型产气肠杆菌如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要吋做

33、重复试 验。7. 5结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孑包杆菌，发酵乳糖产酸产气，imvic试验为+ 或-+-，再根据lst肉汤阳性管数查mpn表，报告每克（毫升）样品中大肠杆菌mpn值。注：本文参照sn0169-92出i食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法（六）沙门氏菌检验1主题内容与适用范围木文规定了食品屮沙门氏菌的检验方法。木文适用丁航空食品的检验。2设备和材料吸管（1ml、10ml）、恒温培养箱（36±1°c、42°c）、冰箱、均质器、振荡器、平皿、 稀释瓶、天平、显微镜、接种棒等3培养基和试剂缓冲蛋h月东水（bp）、氯化镁孔雀绿增菌液、四硫酸钠煌

34、绿（ttb）壇菌液、亚硒酸盐胱氨 酸（sc）增菌液、亚硫酸祕琼脂（bs）、diil琼脂、iie琼脂、ws琼脂、ss琼脂、三糖铁琼脂、蛋 口腺水、靛基质试剂、床素琼脂（pii7.2）、氧化钾（kcn）培养基、氨基酸脱竣酶试验培养基、 糖发酵管、0npg培养基、半固体琼脂、丙二酸钠培养基、沙门氏菌因子血清：按26种用于 初步分型；57种用于进一步分型；163种用于详细分型。4检验程序沙门氏菌检验程序如2h.s +靛基质-尿素kcn-赖氨酸+沙门氏菌血清学试验h2s + 尿素 赖氨酸+靛基质+kcn-甘露醇、山梨醇沙1'血清1氏菌学试验h2s -尿素赖氨酸+靛基质-kcn-/-onpg非沙1

35、、】氏菌非如力反应红述的各种i果非匕;门氏菌报告5操作步骤5. 1前增菌取检样25g,加入225ml缓冲蛋门月东水于均质杯内。用均质器以800010000r/min打碎 lmin,于36±1°c培养4h (干蛋品培养1824h),移取10ml,转种于looml氯化镁孔雀绿增 菌液(mm)或四硫酸钠煌绿(ttb)增菌液内，于42°c培养1824h。同时，另取10ml,转 种于looml亚硒酸盐肮氨酸(sc)增菌液内，于36±1°c培养1824h。5. 2分离取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸钮琼脂平板和一个dhl琼脂平板。两种增菌液可同时划线接种

36、在同一个平板上。于36±1°c分别培养1824h(dhl)或4048h(bs),观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌i、ii、iv、v、vi和沙门氏菌iii在各个平板上的菌落特征 见表lo表1沙门氏菌屈各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌i、ii、iv、v、vi沙门氏菌iii (即亚利桑那菌)bs琼脂产硫化氢菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或 灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有 些菌株不产硫化氢，形成灰绿色的菌落周围 培养基不变黑色有金属光泽dhl琼脂无色半透明；产硫化氢菌落屮心带黑色或几 乎全黑色乳糖迟缓阳性或阴性的菌株 与沙门氏菌i、ii、iv、v、

37、 vi和同；乳糖阳性的菌株为粉 红色，中心带黑色5. 3生化试验5.3.1自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂内, 肠杆菌科常见属种的反应结果见衣2。表2肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果斜而底层产气硫化氢可能的菌屈和种+/-+沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱 德华氏菌+/-+沙门氏菌iii、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌+沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、 普罗菲登斯菌属+伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、 蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌屈+/-大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌

38、属、 弗劳地氏柠檬酸杆菌说明：在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同吋硫化氢(h2s)阴性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同吋也均有不是沙门氏菌的可能。5. 3.2在接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋门陈水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pii7.2)、m 化钾(kcn)培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各1管，于36±tc培养1824h,必要时可延长至48h,按表3判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌屈的结果应屈于al、a2和bl,其他5种反应结杲均可以排除。表3肠杆菌科各屈生化反应初步鉴别表反应 序号硫化 氢靛基 质尿素氧化钾赖氨 酸判定菌屈a1+沙门氏菌屈a2+沙门氏

39、菌属（少见）缓慢爱德华氏菌a3+弟劳地氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌a 4+普通变形杆菌bl+沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、甲型伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属b2+大肠埃希氏菌、志贺氏菌属b3+/-+克雷们氏菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地氏柠+檬酸杆菌b4+/-+摩根氏菌、普罗菲登斯菌展5. 3.3反应序号a1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿索、kcn和赖氨酸3项屮有1项异常,按表4可判定为沙门氏菌。如有2项杲常，则按a3判定为界劳地氏柠檬酸杆菌。表4尿素氧化钾赖氨酸判定结果甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）+沙门氏菌iv或v （要求符合本群生化特性）+沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）5

40、. 3. 4反应序号a2：补做廿露醇和山梨醇试验，按表5判定结果。表5甘露醇山梨醇判定结果+沙门氏菌靛基质阳性变体（要求血清学鉴定结果）缓慢爱徳华氏菌5. 3. 5反应序号补做onpgo 0npg十为大肠埃希氏菌，0npg 为沙门氏菌。同时，沙门氏菌应为赖氨酸+,但甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸一。5. 3. 6必要时按表6进行沙门氏菌生化群的鉴别。表6沙门氏菌属各牛化群的鉴别项1iiiiiiivvvi卫矛醇+山梨醇+水杨莒+onpg+丙二酸盐+kcn+5. 4血清学分型鉴定具体内容见gb/t4789. 4-2003食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验屮6. 4。5. 5菌型的判定和结杲报告综合以上生

41、化试验和血清学分型鉴定的结果，按照gb/t4789. 4-2003食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验屮表8或冇关沙门氏菌屈抗原表判定菌型，并报告结果。注：本文参照gb/t4789. 4-2003食品一卫生微生物学检验沙门氏菌检验（七）金黄色葡萄球菌检验1主题内容与适用范围木文规定了食品屮金黄色葡萄球菌的检验方法。木文适用丁航空食品的检验。2设备和材料吸管（lnil、loinl）、恒温培养箱（36±1°c）、冰箱、均质器、振荡器、平皿、稀释瓶、 天平、显微镜、接种棒等3培养基和试剂普通肉汤培养基、胰蛋白月东人豆肉汤、baird-prker琼脂平板、缓冲蛋h月东水（bp）、 凝固

42、酶试验冻干血浆4检验程序（非选择性增菌法）金黄色葡萄球菌检验程序如5操作步骤 5.1称取25g固体样品；吸取25汕液体样品，加入225mlbp月东水，固体样品研磨或置均质器 屮制成混悬液。5. 2吸取10ml±述混悬液，接种于10ml双料胰蛋白豚大豆肉汤屮，置36±1°c培养2h。5.3再加入20ml含20%nacl的单料胰蛋白陈大豆肉汤，置36±1°c培养24±2h。5.4划线转种2个表面干燥的bai rd-parker琼脂平板上，36±1°c培养46±2h。5. 5挑取可疑菌落移种到肉汤培养基中，置3

43、6± 1°c温箱培养24h。5. 6取肉汤培养物0. 3ml同0. 5ml凝固酶试验冻干血浆于8mm* 100mm试管内充分混合,置 36±tc培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察6h,以内容物完全凝固，使试管倒置或 倾斜时不流动为阳性。试验中需同时做已知阳性和阴性对照。对可疑结果，应进行革兰氏染 色、镜检和其他辅助试验。5. 7木菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小, 直径约为0. 51 u m。在bairdparker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为23mm, 颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层冇

44、一透明圈。用接种针接触菌 落似有奶油树胶的硕度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。5. 8报告结果如发现有凝固酶试验阳性的菌落，即报告lg(ml)食品中冇金黄色葡萄球菌存在，否则为 阴性。注：木文参照sno172-92出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法（八）霉菌计数1主题内容与适用范围木文规定了食品和饮料霉菌计数的检验方法。木文适用于航空食品和饮料中霉菌计数的检验。2设备和材料温箱（2528°c）、振荡器、天平、玻塞三角瓶（500ml）、平皿（直径9cm）、吸管（iml 及loml）、酒精灯等。3培养基和试剂高盐察氏培养基、灭菌蒸徭水、乙醇4操作步骤4.1无菌操作称取

45、检样25g（或25ml）,放人含有225ml灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30min, 即为1： 10稀释液。4. 2用灭菌吸管吸取1 ： 10稀释液10ml,注入试管中，另用带橡皮乳头的1讥灭菌吸管反复 吹吸50次，使霉菌抱了充分散开。4.3取lmll : 10稀释液注入含有9ml灭菌水的试管小，另换一支iml灭菌吸管吹吸5次，此 液为1 ： 100稀释液。4. 4按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1讥灭菌吸管，根据对样品 污染情况的估计，选择3个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1讥稀释液于灭 菌平皿中，每个稀释度做2个平皿，然后将凉至45°c左右的培养

46、基注入平血中，待琼脂凝固 后，倒置于2528°c温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。4. 5计算方法：通常选择菌落数在10150之间的平皿进行计数，同稀释度的2个平皿的菌 落平均数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）检样中所含霉菌数。4. 6报告：每克（或毫升）食品所含霉菌以个/g（个/n）l）表示。注：木文参照gb/t4789. 15-2003食品微生物学检验霉菌和酵母计数（九）革兰氏染色1原理革兰氏染色法是细菌学屮重要的鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳 性菌和阴性菌两犬类。其过程是：草酸鞍结品紫初染一路哥尔氏碘液媒染一95%乙醇脱色一蕃 红花红复染。若细胞能保持结

47、晶紫与碘所形成的复合物而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称 革兰氏阳性菌，若被乙醇脱色而被蕃红复染成红色，则称革兰氏阴性菌，2药品与材料革兰氏染色液（草酸鞍结晶紫液+路哥尔氏碘液+ 95%乙醇+蕃红花红）、蒸憾水、菌落 培养物（培养1824小吋）、二甲苯、香柏油3器具及其它载玻片、盖玻片、酒精灯、废液缸、洗瓶、吸水纸、接种环、显微镜、铁了4操作程序涂片一干燥一固定一草酸钱结品紫初染一水洗一碘液媒染一95%酒精脱色2030秒一水 洗一蕃红花红液复染一水洗干燥一镜检4.1涂片：先滴一小滴蒸馅水于载玻片屮央，然后用接种坏取少量菌体轻轻混入水屮，涂成 一薄层并使细胞均匀分散。4. 2干燥：在空气屮令其自然

48、干燥或在酒精灯火焰上端高处微微加温但勿靠近火焰。4. 3固定：把涂有细菌的面朝上，在酒精灯火焰上通过三次，目的是杀死菌休细胞以及改变 对染色剂的通透性，同时使涂片的菌体紧贴载玻片而不易被水冲洗脱落。4. 4初染：用草酸钱结晶紫液初染1分钟，水洗、吸干。4. 5媒染：加一滴路哥尔氏碘液媒染1分钟、水洗。（此吋结晶紫与碘液成复合物）4.6脱色:斜置载玻片，用95%酒精冲洗约2030秒种,立即水洗,吸干。4. 7复染：用蕃红花红液复染广2分种，水洗晾干或用吸水纸吸干。4. 8镜检：在显微镜油浸镜下检查革兰氏阳性菌和阴性菌染色的差异，并观察菌体形态。5革兰氏染色成败的控制点5.1涂片厚度：涂片过厚，细

49、胞重叠，无法较好地观察单个细菌细胞形态，涂片过薄，细胞 数量少，不利于观察；5. 2染色时间。染色时间过长，结品紫与细胞结合，脱色不易，染色不够，结品紫尚未与细胞 结合。染色控制不好，易引起误判；5. 3乙醇脱色的程度。如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够，则阴性菌被误 染为阳性菌。（十）空气中微生物的检验1目的了解空气屮微生物的状况，掌握空气屮微生物的检验方法，分析引起食品屮微生物的来 源因素，及吋控制餐食卫生质量。2原理根据空气屮微生物一般吸附在半埃屮，由于地心引力尘埃下沉到地面或物体表面原理制 定的。3器材培养皿、生化培养箱、营养琼脂4方法（沉降法）4.1以无菌操作将已融化并冷

50、却至50°c的营养琼脂倒入培养1111中，放置凝固。4. 2在不同地点将培养皿分别打开，在空气小暴露15分钟，立即将培养皿盖好，作上记号， 并作一空白对照。4. 3将培养1111放置37°c恒温培养48小时，取出观察其结果并计算出菌落数。4. 4计算公式：每立方米空气小细菌数= 50000n/（axt）n：为培养血经培养后的菌落数a：为所用平皿面积（cm?）,平皿直径（0）9cmt：为平皿暴露于空气屮的时间（t=15分钟）（这个公式根据：根据15分钟内在100曲面积上降落的细菌数约等于10升空气中的含 菌数而佔计的。）注：本文参照gb15979-2002一次性使用卫生用品卫

51、生标准附录e（h一）水中微生物的检验1基本原理细菌总数是指水样在一定条件下培养后所得lml水样所含菌落的总数。总大肠菌群系指-群在37°c培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏 阴性无芽抱杆菌。该菌群主要來源于人畜粪便，具有指示菌的一般特征，故以此作为粪便污 染指标评价饮水的卫生质量。水屮总大肠菌群数系以100ml水样屮污染的总大肠菌群最可能 数（mpn）表示。按国家饮用水卫生标准规定，1毫升自来水中杂菌数不得超过100个，大肠菌群数1000 毫升水中不得超过3个才算合格。2材料营养琼脂、乳糖胆盐发酵培养基、酒精、棉签、培养皿、无菌广口瓶3方法3.1采样（自来水）：先

52、将水龙头打开，放水12分钟后，关闭水龙头。用酒精棉球灼烧龙 头三分钟灭菌，再开放水龙头使水流5分钟，用无菌瓶收集水样。3. 2细菌总数检查：3.2.1用灭菌吸管吸取lml水样，注入灭菌培养皿屮，共做2个。3. 2. 2分别倾注约15ml已熔化冷却至45°c左右的营养琼脂，混匀后置37°c培养24小时进行 菌落计数，同时应作一空白对照。两个培养皿的平均菌落数即为水样lml屮的细菌总数。3. 3大肠菌群数检查：乳糖发酵试验一分离培养一证实试验一报告3.3.1乳糖发酵试验：自来水的接种方法：在2个装有50ml三倍料乳糖胆盐发酵液的三角瓶中，各加入100ml 水样；在10支装有5m

53、l同样发酵的试管中，各加入10ml水样，混匀。将上述各发酵管（瓶） 置36±tc温箱内，培养24±2小吋，观察结果。如所有发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。3. 3.2分离培养：将产气的发酵管用接种环分别以划线法转接于伊红美兰琼脂平板上，置36 ±1°c温箱内，培养1824小时，取出观察菌落形态。3. 3.3证实试验：在每个平板上，挑取可疑菌落（紫黑色或淡紫红色，冇或略冇或没冇金屈光 泽的菌落）12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1°c培养24土2小时进行复 发酵试验，观察产气情况。凡

54、乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的芽他杆菌即可报告为大肠菌 群阳性。4报告每毫升自来水所含菌落数以个/inl表示；根据证实为大肠菌群阳性的管数，查大肠菌群 检索表，报告每升水样的大肠菌群的最可能数。注：木文参照gb5750-85生活饮用水标准检验方法（十二）食品接触面的微生物检验1原理食品接触面分为人员手、设备、器具等食詁直接接触，其表面存在有微生物，为更好控 制微生物生长繁殖，以大肠菌群为主耍检测指标，检测结果应基木呈阴性（其中人员手需做 菌落总数检测）。2检验材料乳糖胆盐发酵培养基、emb、乳糖复发酵培养基、人肠菌群检测纸片、无菌棉球、无菌水、 酒精棉球、酒精灯、银子3检验方法3.1人员手检验

55、（发酵法）3.1.1样品釆集被检人双手五指并拢，用一浸湿生理盐水的棉签在右手指曲而，从指尖到指端来回涂擦 10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10ml灭菌生理盐水的采样管内。3.1.2细菌菌落总数的检测将已采集的样品在6h内送实验室，每支采样管充分混匀后取lml样液，放入灭菌平皿内， 倾注营养琼脂培养基，每个样品平行接种两块平皿，置36±1°c培养48小时，计数平板上细 菌菌落数。y=a*10 （y为工人手表面细菌菌落总数，cfu/只手；a为平板上平均细菌菌落数） 3.1.3大肠菌群的检测每支采样管充分混匀后取lml样液，分别放入10迅乳糖胆盐发酵管中，每个样品平行接 种3管，置36±1°c培养24小时。如所有发酵管都不产气，则可报