保定市绝经女性载脂蛋白E基因多态性与冠心病合并脑梗死遗传易感性的关系研究

1、保定市绝经女性载脂蛋白e基因多态性与冠心病合并脑梗死遗传易感性的关系研究程华1顾莹辉2王秀娟1(1河北保定市第三医院071000; 2河北保定市第二医院神经内科071000)【摘要】i；的检测并分析保定市绝经女性屮载脂蛋白e(apoe)棊因多态性与冠 心病合并脑梗死遗传易感性的关系。方法采用聚合酶链反应一限制性片段长度 多态性(pcr-rflp)法，分析96例绝经女性冠心病合并脑梗死患者和86例绝经女 性的健康对照者的apoe的3种等位基因ε2、ε3、ε4，做 基因频率和基因型多态性分析。结果健康人群组apoe基因呈多态性

2、，有6种 基因型，即 3 种纯合子(ε2/2、ε3/3、ε4/4)； 3 种杂合子 为(ε2/3、ε3/4、ε2/4)。与绝经女性的健康人群组比较， 绝经女性冠心病合并脑梗死组ε3/3基因型频率较健康人组明显降低，差 异有统计学意义(p<0.05)，ε4/4、ε3/4基因型频率较健康组明 显升高，差异有统计学意义(p<0.05)： &epsilo

3、n;2等位棊因频率较健康组差异无 统计学意义(p>0.05)。结论保定市绝经女性的健康人群组apoeε3基 因出现率最高，ε2和ε4频率较低，ε3/3基因型最多，而 ε2/2、ε4/4相对较少，绝经女性的冠心病合并脑梗死患者屮 ε3/3、ε2/3基因型频率较低，ε4等位基因频率在绝经女 性的冠心病合并脑梗死患者屮增高，ε4可能是冠心病、脑梗死的

4、遗传易 患因子之一，ε3等位棊因是冠心病和脑梗塞的保护因子。【关键词】绝经女性冠心病合并脑梗死载脂蛋ae类多态性疾病遗传易 感性心脑血管疾病是目前死亡率位居首位、严重危害人类健康的疾病，其屮 冠心病和脑梗死的发病率较高。女性在绝经后失去丫雌激素对心脑血管的保护, 导致动脉粥样硬化进展迅速，患冠心病、脑梗死的风险显著增加。冠心病和脑梗死，二者共同的病理基础和主要发病因素之一是动脉粥样硬化。动脉粥样硬化形 成受多种因素的影响，其中脂质沉积发挥重要作用。载脂蛋白e （apoe）是血浆 中主要载脂蛋白之一，具有多态性，参与机体脂质代谢及调节胆固醇平衡。冇关 apoe基因多态性与

5、冠心病和脑梗死的研究较多，结果不-致。为此我们采用聚 合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术，结合dna银染技术检测apoe基因 多态性，研究保定市绝经女性人群中apoe基因型的频率及分布，探讨保定市绝 经女性人群apoe基因多态性与冠心病合并脑梗死发病风险的关系。一、资料与方法1、临床资料：所有资料均选自2007年3月至2009年2月在保定市第 三医院体检的健康绝经女性及冠心病合并脑梗死的绝经女性患者182例，均为无 血缘关系且在保定市生活30年以上的汉族人。（1）健康人群组：从健康体检者 中随机抽取86例，均为绝经女性，平均年龄（57±10）岁：入选标准： 既往身体健

6、康、排除有阿尔茨海默病、脑血管病、心肝肾疾病、糖尿病、血液病、 自身免疫性疾病、甲状腺疾病。（2）冠心病合并脑梗死组：在保定市第三医院就 诊的经临床诊断为冠心病合并脑梗死的住院患者96例，均为绝经女性，平均年 龄（58±10）岁；冠心病入选标准：符合1979年who的冠心病诊断标 准1】，并排除糖尿病、肝肾疾病、老年性痴呆症等。脑梗死入选标准：符合1995 年全国第四届脑血管病学术会议的诊断标准2,并经头颅ct或mri确诊；排除 心源性、动脉炎、脂肪栓子、药物、肿瘤等引起的脑梗死。以上两组年龄、性别 差异无统计学意义（p0.05）。2、采血：全部为抽取晨起空腹12-14小

7、时抗凝静脉血3ml。采用naci 盐析法提取基因组dna, -20°c保存。3、试剂配置及来源：抗凝剂，dna提取试剂，红细胞裂解液（军事医 学科学研究室提供），te缓冲液，储存液sds,蛋白酶k （sigma公司提供），pcr 试剂:4种dntps （sigma公司提供），引物：上游引物序列s-aacaactgaccccggtggcgd和下游弓|物序歹lj 5'-atggcgctgaggccgc gctc -3* 反应引物按文献3】设计，由中山医科人学基因中心合成。10%二甲基亚砜，taqdna 聚合酶（sigma公司提供），10倍pcr缓冲液。电泳试剂：2%琼脂糖凝

8、胶、限制 性内切酶hhal （sigma公司提供）、限制性内切酶缓冲液。4、apoe基因的pcr扩增：扩增apoe基因第四外显子中含多态性位点 的dna片段，扩增产物长度299bp。pcr反应体系50vl，包括0.5vg基因组dna,4种dntps终浓度200vmol/l,引物终浓度0.2vmol/l，10%二甲基亚砜，taqdna 聚合酶2.5u, 10倍pcr缓冲液5ul。反应体系用50vl石蜡油覆盖，94°c预变性 4min,然后按 94°c变性 lmin→65°c退火 lmin→72°c延伸 lmin 进行 3

9、5 个 循环，最后72°c再延伸7min。pcr产物经2%琼脂糖凝胶电泳，电泳吋间lh。 溴化乙啶染色，在uv灯下发橘红色荧光，检测扩增结果呈现299bp的扩增产物。5、apoe基因rflp分析:取扩增产物5vl，加入6uhhal内切酶及缓冲液， 加双蒸水（ddh2o）使总体积达20vl,37°c消化4-5h。酶切产物经5%聚丙烯酰胺 凝胶电泳，溴乙啶室温染色40min，水洗，uv灯下观察dna带型并照相。按照 hixson等4的方法进行apoe基因分型，根据3种等位基因特异性片段的不同， 可在电泳图谱上鉴定apoe基因不同的基因型。6、基因型和等位基因频率计算方法：基因型

10、频率=基因型频数/总例数； 等位基因频率=（纯合子基因型频率+杂合子基因型频率）/2。7、统计学处理：应用spss10.0统计软件进行分析，两组间计数资料的 比较采用x2检验，检验标准a=0.05。二、结果1、apoe的pcr扩增产物：apoe经pcr扩增后为299bp的特异性条带。2、健康人群apoe基因型：pcr-rflp检验结果显示，健康人群组的apoe 基因呈多态性，有6种基因型，即3种纯合子（ε2/2、ε3/3、 ε4/4）； 3 种杂合子为ε2/3、ε3/4、&a

11、mp;epsilon;2/4）全部检 出，通过与分子量标准物marker比较读出基因型如下：ε2/2基因型存 91bp、83 bp、61bp3 个条带，ε3/3 基因型有 91bp、61 bp、48 bp、35bp4 个条带，ε4/4 基因型有 72bp、61bp、48 bp、35bp4 个条带，ε2/3 基因型有 91bp、83bp、61bp、48bp、35bp5 个条带，ε3/4 基因型有 91bp、72bp、61bp、48bp、35bp5 个条带，&epsilo

12、n;2/4 基因型有 91bp、83bp、72bp、 61bp、48bp、35bp6 个条带。3、两组apoe基因型频率和等位基因频率：结果显示两组apoe基因型 分布以&epsilon;3/3多见，分别在健康组为75.5%,冠心病合并脑梗死组为39.5%, 经x2检验，&epsilon;3/3、&epsilon;3/4和&epsilon;4/4基因型频率在健康组与冠 心病合并脑梗死组之间差异冇统计学意义（p<0.05），&epsilon;2/2、&epsilon;2/3 和&epsilon;2/4基因型频率在两组间分布差异均无统计

13、学意义（p>0.05）； &epsilon;3、&epsilon;4等位基因频率在两组间分布差异有统计学意义（p<0.05）， &epsilon;2等位基因频率在两组间分布差异无统计学意义（p0.05）。表1冠心病与健康人群apoe等位基因及基因型频率的比较%（频数）三、讨论冠心病和脑梗死的发病具有众多而复杂的遗传和环境因素但二者共同 的病理基础和主要发病因素之一是动脉粥样硬化。已冇研究表明雌激素是重要的 血管保护因子，具有改善脂质代谢、防止内皮损伤、扩张小血管、抑制血小板聚 集等多种积极作用，女性绝经后雌激素分泌明显减少，使雌激素对心脑血管的保 护作用大大

14、减弱，导致绝经后的女性脂质代谢异常，动脉粥样硬化加速，患冠心 病、脑梗死等心脑血管风险较绝经前明显增加。本研宄结果显示，保定市绝经女性人群apoe基因呈多态性，存在6种 不同 apoe 表型：&epsilon;2/2、&epsilon;3/3、&epsilon;4/4、&epsilon;2/3> &epsilon;2/4、&epsilon;3/4。保定市健康的绝经女性人群组apoe&epsilon;3基因 出现频率最高，&epsilon;2、&epsilon;4频率较低，以&epsilon;3/3基因型最多，

15、 而&epsilon;2/2、&epsilon;4/4> &epsilon;2/4 相对较少，结果与我国对汉族人 apoe 等位基因频率研究结果基本一致5-6。&epsilon;3被认为是“野生基因”， &epsilon;2和&epsilon;4是由其变异得来。我们的研充结果显示：绝经女性的冠 心病合并脑梗死患者中&epsilon;2等位基因频率最低，&epsilon;4等位基因频率 增高，显著高于健康的绝经女性人群组(x2=16.84、p<0.05)； &epsilon;3等位 基因频率较健康的绝经女性人群组

16、明显降低(x2=12.47、p<0.05)。&epsilon;4 等位基因频率与绝经女性的冠心病、脑梗死发病危险性冇关，提示&epsilon;4等 位基因是绝经女性冠心病、脑梗死的遗俾易感因子，与chowdhury7等及夏s8 等研宄结果相一致。&epsilon;3等位基因是保护性基因，与沈丽华9等报道相一 致。本研宄以保定市绝经女性的汉族人群为背景，发现&epsilon;3/3、 &epsilon;4/4、&epsilon;3/4基因型在健康人群和冠心病合并脑梗死组之间差异宵 统计学意义，同时发现等位基因&epsilon;3、&a

17、mp;印silon;4在组间的差异也冇统计学 意义，这提示apoe基因多态性与绝经女性患冠心病合并脑梗死之间右直接关系。 总之，绝经后女性由于雌激素水平明显下降，对心脑血管的保护作用明显降低, 导致患心脑血管疾病的风险大大增加，但在本研究中表明，虽均为绝经后女性, 但由于参与脂代谢的apoe基因多态性，导致是否患奋冠心病、脑梗死等疾病的 结果不同，这给我们在预防及治疗女性以及绝经女性冠心病、脑梗死方面提供了 一种新的研究方向。当然，国内外有关apoe基因多态性与冠心病、脑梗死的相 关性研究较多，il研究结果不一致，可能与选择的样本例数、病例、种族、生活 环境与方式和家族遗传背景等许多因素有关，

18、有待我们以后再做进一步研宄。参考文献1 国际心脏病学会及世界卫生组织临床命名标准化专题组.缺血性心脏病的命名 及诊断标准j.中华内科学杂志1981,20 (4)： 254.2 中华神经科学会，中华神经外科学会.各类脑血管病诊断要点.中华神经科杂 志，1996,29 (6)： 379-380.3 时宝庆，吕全军，李文杰等，载脂蛋白e基因多态性与老年人血脂、血压的 相关性研究.中国老年学杂志，2006,26 (1)： 19-21.4 hixson,je,vestriction isotyping of human apolipoprotein eby gene amplification and cleavage with hha i.jlipid res, 1990,31(3):545-548.5 郭阳，郭津津等.载脂蛋白e基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗塞的关系.中 华神经科杂志，1997,30 (4)： 236-239.6 陈峰，薛雅丽，黄承滨等.载脂蛋白e基因多态性在中国4个民族中的分布.人类学学报，1999,18 (4) 311-315.7 chowdhury