甘肃地区鸡肉中四环素类药物残留量的分析研究(定稿)

1、ortd'west vmvcrsity for ationaiitie,本科学位论文甘肃地区鸡肉中四环素类药物残留量的分析研究学院：生命科学与工程学院 专业：09级食品科学与工程（1）班 姓名：褚宝磊学号:p0921143282013 年 4>j 27 f1甘肃地区鸡肉中四环素类药物残留量的分析研究专业：食品科学与工程姓名：褚宝磊指导教师：穆晓峰摘要四环素类药物其中包括土霉素、四环素和金霉素等，是 以四并苯为母核的一族抗生素，被广泛用于防治动物肠道感染和促进 畜禽生长，提高成活率和饲料转化率，但由于添加的数量、方式和方 法不当，如持续使用使病原菌容易诱导耐药菌株，损害肾功能和造血

2、 系统，为此我国对动物性食品中的抗生素药物残留进行了规定1。同 时也制定了相应的国家标准，但是目前对于一些散养鸡的监管还不到 位，为此本实验的主要目的就是对甘肃省部分地区的肉鸡中的四环素 类药物进行检测，以确保消费者食用鸡肉的安全性。实验组从兰州市张苏滩批发市场采集不同地区鸡肉样品24份，该 样品分别来自：永登、景泰、靖远、榆中、临夏、武威。将活鸡现宰 后取鸡胸部肌肉，采用酶联免疫法观察这6个地区鸡肉中四环素残留 情况，并进行逐步研究甘肃省各个不同地区鸡肉中四环素类药物残留 量所存在差异性的原关键词环素，鸡肉，elisa试剂盒，残留量，检测abstracttetracyclines oxyte

3、tracycline, tetracycline and chlortetracycline, andbenzene as the nucleus of a family of antibiotics are widely used to control the animal intestinal infection and promote animal growth, improve the survival rate and feed conversion ratio. however, due to improper add a number of ways and means，such

4、 as the continued use of easy pathogens resistant strains induced damage to the renal and hematopoietic system, this country the antibiotic drug residues in animal food，but also developed a corresponding national standards，but is not yet in place for the supervision of some scattered chicken, this e

5、xperiment in gansu province，parts of broiler tetracyclines detection.key words： tetracycline chicken elisa kit residues detect1弓i言11. 1 土霉素的理化性质31.2四环素类药物的药理作用及毒理作用41.3.四环素类药物在动物生产屮的应用41.4我国四环素类药物非法使用的综合治理情况51.5四环素类药物的检测方法51.5. 1酶联免疫一步法检测方法（elisa）61.5. 2高效液相色谱-串联质谱法（lc-ms/ms）61.5.3固相萃取-高效液相色谱法（spe-h

6、plc）61. 5. 4反向高效液相色谱法（rp-hplc） 72. 材料与方法72. 1材料72. 1. 1 试剂72. 1.2仪器设备72. 1. 3eltsa 试剂盒82.2工作液准备82.2.7 土霉素标准品配制方法82.2.8 3%三氯乙酸溶液的配制方法92.2.9 1m氢氧化钠溶液的配制方法92. 3样品预处理92.4酶免分析步骤103. 结果计算124.结论1416参考文献1、引言随着近年以来中国老百姓生活水平的不断提高，我国居民的饮 食习惯也逐渐从解决温饱问题转了以追求饮食的健康与均衡为目 的，老百姓越来越对优质、安全、卫生的食用农产品的需求量日趋增 加。然而一些不法的商贩为了

7、追求更高利益，以牺牲广大无辜群众的 健康为代价，来牟取暴利。随着“瘦肉精猪肉、三聚氰胺奶粉、苏丹 红鸭蛋、孔雀石绿多宝鱼、皮革奶”等各种产品中食品的质量安全问 题的连续不断的相继发生，人民群众对日常饮食的食品质量安全的疑 惑越来越多。为了保障本市广大人民群众的身体健康，加强食用畜产 品的卫生安全的监督势在必行。本次实验研究的内容可以大力推广动 物性食品从源产地生产到市场销售的全过程监管；同吋有利于监管部 门对于体系的构建和检测工作的顺利开展，有利于提高大型仪器设备 的利用率，特别是减少部分高端设备的重复投资，也便于对仪器进行 管理和维护，更进一步有利于提高畜产品质量安全监测工作的效率和 能力；

8、并且更进一步的有利于提高动物性食品质量安全监管工作的效 率和执行力；并且将有利于加强对动物性食品的生产和流通情况的监 督抽查，逐步完善动物性产品质量安全监管长效机制，积极探索有效 并且具有地方传统特色的监管措施，有利于提高畜产品的检验检测能 力，这样就能够从很大程度上降低和避免大规模的以及突发性的食品 质量安全事故的发生以及对人民所造成的不同程度的危害甚至是危 及生命。四环素类药物其中是以四并苯为主要母核的族抗生素类药物， 其中的四环素、土霉素、金霉素及多西环素等以其优良的抗菌性、稳 定的药物性质及其低廉的价格，在畜牧业生产中广泛应用于疾病的治 疗和预防以及促进生长，但是该类药物如果过量的使用

9、则会导致畜产 品中高浓度的药物含量残留，会直接影响到消费者的身体健康，导致 人体内的细菌耐药性增加，并且能够与骨骼中的钙相结合，引起骨骼 发育畸形和生长的抑制，并且很可能会造成肝肾损伤，引起变态反应， 如果长期使用四环素类抗生素，也可使动物体内致病菌产生了不同程 度的抗药性，而他们在动物体内的残留问题也日益突出，人们要是长 期食用了含有抗生素残留的动物性食品就有可能使人体产生耐药菌 株，就会给今后人群患病再次使用抗生素治疗带来不良影响，同时抗 生素过敏体质的人群也会出现不同程度的过敏反应，容易引起免疫性 溶血，危害生命健康1。最近几年在我们国内连续不断的曝光出各式 各样的食品安全问题，一个方面

10、的原因是由于我们国家监管部门的监 管与执行的力度加强了，另一个方面的原因也是因为企业老板为了追 求最大的利益不择手段，不顾人民的性命。我们所应该做的就是加强 检测技术的创新与开发，定期定时的进行抽样检测，并能够及时的将 不合格产品曝光，勒令厂家进行回收，保障广大人民的安全。当然最 重要的就是多为人民普及宣传一些关于食品安全的知识，让人民增强 自我保护意识。能够自主辨别一些有问题的商品，具有一定的自我防 护意识，并鼓励市民积极进行揭发检举，这样就可以起到一个共同监 督的作用。为了防止杜绝对人们造成健康危害，定期抽样检测甘肃各 地区样品，严格执行法律法规，保障人民群众的饮食安全，提供一个 健康、安

11、全卫生的饮食行业。四环素类药物酶联免疫试剂盒检测方法具右方便、快捷、灵敏 等特点，本方法适用于对大批量的样品进行检测。该试剂盒采用间接 竞争酶联免疫一步法进行检测，在很大的程度上缩短了检测的时间， 可以在儿十分钟之内同吋检测儿十个样品。更有利于全国广大基层实 验室广泛应用。本实验创新之处在于利用快速检测方法及时有效地控制和预防 各类食品的兽药残留和抗生素的检测，能在第一时间防范于未然，并能够从源头上杜绝各类安全事件的发生1.1 土霉素理化性质土霉素(teiramycin)，又称地霉素、氧四环素。是一种广谱型 的抗生素，具有黄色结晶性的粉末，气味无臭且微苦。并且具有两个 分子结晶水。熔点为181

12、182°c，微溶于水，溶于乙醇、丙酮和乙 二醇，不溶于氯仿和乙醚。在空气中稳定，遇强光颜色变深。化学结 构式如阁1-1。图1-1 土霉素化学结构式1.2环素类药物的药理作用及毒理作用四环素类药物是一类具有共同多环并四苯羧基酰胺母核的衍生 物，因分子结构屮具有共同的氢化骈四苯环而得名，高浓度时具有杀 菌作用，兽医临床上常用的有四环素、土霉素和金霉素等，它们对革 兰氏阳性菌、阴性菌、螺旋体、霉形体、衣原体、原虫等均可产生抑 制作用，故又称为广谱抗生素2。四环素的抗菌机制主要是由抑制菌体蛋白质合成。此类药物具有 酸碱两种性质，同时可以和酸或着碱生成盐。但是在碱性水溶液屮并 不稳定，故多制成

13、盐酸盐。该品作用机制在于药物能特异性地与细菌 核糖体30s亚基的a位置结合，阻止氨基酰一trna在该位上的联结， 从而能够抑制肽链的增长并且影响细菌中蛋白质的正常合成。多数药物较少在肝脏代谢，大部分原形经肾脏和胆汁排出，故尿 液和胆汁药物浓度较高，酸化尿液可增加四环素类对泌尿道感染的疗 效，细菌对本类药物耐药性产生较慢，但一旦产生则常持久不变，天然 四环素之间有交义耐药性，但与半合成品之间交义耐药性则不明显31.3四环素类药物在动物生产中的应用四环素类药物具有抗菌的范围性广泛、疗效显著、价格优廉等特 点。四环素的家族中主要包含有四环素、土霉素、二甲胺四环素等。 在治疗畜禽的传染病、原虫病及内外

14、科疾病方面都有非常良好的作用。其中土霉素的只要用途是用干治疗动物肠道感染，金霉索的用途则是用于饲料添加剂来保护动物的健康，可以促进动物的良好生长， 提高饲料的利用率。1.4四环素类药物非法使用的综合治理情况商家为y追求最大的经济效益，将禁用药物当作添加剂使用的现 象相当普遍,有些兽药企业为了逃避报批，在产品中添加一些化学物 质，但不在标签中进行说明，从而造成用户盲目用药,大量、频繁地 使用抗生素，人们食用了含有大量抗生素的动物性食品使人体内的细 菌产生耐药性，扰乱人体微生态而产生各种毒副作用4。我国农业部在2003年(265)号公告屮明文规定，不得使用不符合 兽药标签和说明书管理办法规定的兽药

15、产品，不得使用食品动 物禁用的曾药及其他化合物清单所列21类药物及未经农业部批准的 兽药，不得使用进口国明令禁用的兽药，畜禽产品中不得检出禁用药 物，同时兽药管理条例也明确规定：标签必须写明啓药的主要成 分及其含量等5。我国和欧盟等国际组织规定该类药物的最高残留限 量为:所有食用性动物肌iai组织中四环素、土霉素和金霉素的单个或 混合物含量不得超过100 ug/kg6。1.5四环素类药物的检测方法四环素类药物检测方法一般有：高效液相色谱-串联质谱法、固 相萃取-高效液相色谱法、酶联免疫一步法7。但是由于今年来频发 食品安全问题，经典的色谱法已经不能满足现如今大量的检测任务需 求，因此elisa

16、快速检测试剂盒由于其方便，快速和灵敏等特点而被 广泛应用在实际工作中8。本次所做实验就是应用酶联免疫一步法来 对鸡肉中土霉素的含量进行测定。1.5. 1酶联免疫一步法检测方法（elisa）样品屮游离四环素类药物与酶标板上固定的四环素类药物抗原 特异性竞争抗体，酶标ii抗可与抗体反应，然后洗掉游离的酶标ii抗 和抗体，再通过酶的专一性显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品 中叫环素类药物含量，具体的根据竞争性原理，如果样品中的游离叫 环素类药物量少，则酶标n抗结合多，显色深，反之，则显色浅，检 测时设置标准曲线，通过标准曲线测定样品屮四环素类药物的含量9本次实验方法具有方便、快捷、灵敏等特点，适用

17、于对大量的待 检样品进行快速检测。本试剂盒所应用的是制接竞争酶联免疫一步法 进行检测，很大程度上缩短了检测时间，可在几十分钟之内同时检测 大量的样品。1.5.2高效液相色谱-串联质谱法（lg-ms/ms）lc- ms /ms法由于其具有特异性强和灵敏度高的特点，常用于 兽药残留的结构确证分析，目前，国外已有不少用lc - ms /ms法测定 动物性食品中四环素类药物残留的报道，国内相对来说起步较晚w。 1.5.3固相萃取-高效液相色谱法（spe-hplc）该方法主要用于检测检测猪、鸡和牛等畜禽粪便、肌肉中土霉 素（otc ）、四环素（tc）和金霉素（ctc）等四环素类抗生素11。畜 禽粪便采用

18、edta-m cllvaine缓冲提取液提取，并用lc-18固相萃取 柱富集畜禽粪便样品中的抗生素，进行上机色谱检测，该方法灵敏度 较高12。1.5. 4反向高效液相色谱法(rp-hplc)该方法利用梯度洗脱模式能同时快速检测畜禽鸡肉中5种四环 素类药物残留13。2、材料与方法 2. 1材料2. 1. 1试剂去离子水实验室自制三氯乙酸分析纯氢氧化钠分析纯2. 1.2仪器设备101(x)0 p l不同规格的微量移液器brand50300 p l多通道微量移液器bi0hit微量振荡器mh-2 yp-19高速冷冻离心机sigma 3k15yp-16漩涡混合器 金坛市医疗仪器厂hx-c 上海医大仪器厂

19、xw-80a yp-6酶标分析仪(有450nm滤光片)北京普朗新技术有限公司dnm-9602g恒温干燥箱上海光地仪器设备有限公司 101-2型 组织粉碎器上海帅佳电子科技有限公司 sq2119n 电子天平梅特勒-托利多公司ab135-s d=0.01mg美国双杰兄弟有限公司jj20型d=0. lg优普超纯水制造机 uph-iv-20t lh-102. 1.3elisa 试剂盒酶标板：1块(12条x8孔，可以进行拆分)抗体工作液：1瓶(6ml)酶标二抗工作液：1瓶(6ml)样品稀释液10x: 1瓶(20ml)清洗液20x: 1瓶(25ml)显色剂：1瓶(13ml)终止液：1瓶(13ml)土霉素标

20、准品:0. 5ml/瓶(1000ng/ml)2.2工作液准备 2.2. 1抗体工作液：已备用 2. 2. 2酶标二抗工作液：已备用2. 2. 3样品稀释工作液：样品稀释液10x用去离子水h 10(1+9) 稀释，备用2. 2. 4清洗液：用去离子水按1: 20 (1+19)稀释2. 2. 5显色剂：己备用，避免光线直照2. 2. 6终止液：已备用2. 2. 7 土霉素标准品配制方法：配制27ng/ml标准品溶液：取4865 u l样品稀释工作液于试管 中，加入135ul 1000ng/ml 土霉素标准品，混匀配制9ng/ml标准品溶液：取2ml样品稀释工作液于试管中，加 入iml 27ng/m

21、l 土霉素标准品，混句配制3ng/ml标准品溶液：取2ml样品稀释工作液于试管中，加 入iml 9ng/ml 土霉素标准品，混匀配制lng/ml标准品溶液：取2ml样品稀释工作液于试管中，加 入iml 3ng/ml 土霉素标准品，混匀配制0. 3ng/ml标准品溶液:取2. iml样品稀释工作液于试管屮， 加入0. 9ml lng/ml 土霉素标准品，棍匀配制ong/ml标准品溶液：取3ml样品稀释工作液于试管中2.2.8 3%三氯乙酸溶液称取3g三氯乙酸粉末，用适量蒸馏水充分溶解，并用容量瓶定 容至100ml，混匀备用2.2.9 1m氢氧化钠溶液称取4g氢氧化钠粉末，用适量蒸馏水充分溶解，并

22、用容量瓶定 容至100ml,混匀备用2.3样品预处理2. 3. 1样品的采集从兰州市张苏滩批发市场采集来自：永登、景泰、靖远、榆中、 临夏、武威六个不同地区鸡肉样品24份，每个地区4份样品。样品的 采集必须有代表性而且范围广。2. 3. 2称样：将鸡肉的样品进行充分粉碎，称取l±0.05g均质化的 样品，盛放于离心管中。2.3.3震荡：加入4ml样品稀释工作液，在漩涡仪上剧烈震荡三十秒 2.3.4离心：将样品置于室温下使用5000rpm高速离心机充分离心5 分钟。2. 3. 5混合：从离心管中抽取300 ul的上清液，并同时加入6ul 样品稀释工作液，进行充分混匀。2.3.6检测：从

23、试管屮吸取50 p l的混合液用于检测。2. 3. 7阳添和空白取3份空白鸡肉样品（经实验室检测四环素类药物含量低于 0. 3ppb） l±0. 05g于10ml离心管中，分别向其中加入lug/ml的四 环素的标准品oul、20 ul、40 ul，作为空白对照和阳性对照组， 分别加入4ml样品稀释工作液，在游涡以上剧烈震荡30秒钟；室温 下5000rpm离心5分钟；取300ul上清液，加入600ul样品稀释工作 液，充分混匀，取50ul用于检测。2.4酶免分析步骤2. 4. 1实验须知1. 温度要求：实验开始之前将所有试剂放在盒子外面进行充分冋温恢 复至室内温度，时间大概12个小时，

24、并且一定保证回温要充分。 剩下的微孔要重新密封后立即放于28qc干燥保存。2. 保存方法：试剂使用之后应该立即将试剂放回到28°c保存。3. 注意事项：不要改变分析步骤 使用精确的移液器实验一旦开始进行，就不能在实验屮间停止任何程序 为了防止试剂交叉污染，每个标准品和样品都应该使用不同的吸头加样加样时切忌吸头接触微孔中的溶液或这微孔内层表面2. 4.2分析步骤1. 预先进行编号，标记b。、标准品和样品的位置2. 从板上取下所需要数量的微孔，将剩余的微孔重新密封起来并放回 到28°c保存3. 将样品稀释液（10x）、清洗液（20x）配制成工作液4. 在b孔中加入50 u lo

25、. ong/ml的标准品溶液5. 在每个标准孔屮加入50 u l的标准品溶液6. 在每个样品孔中加入50 ul的样品溶液7. 在所宥标板微孔中加入50 ul的酶标二抗工作液8. 在所有标板微孔中加入50 u l的抗体工作液9. 轻轻摇晃反映板几秒钟10. 室温下孵育30min （孵育过程不时轻拍震荡酶标板，可减少双孔 误差，提高检测准确性）2. 4. 3清洗步骤（34次）倒掉微孔中的液体在所宥微孔中加满清洗液（见2. 2. 4）重复上述步骤三遍以上将标板在吸水纸上倒过来进行拍打，彻底干净的清除微孔中的所存 残留液和气泡（拍打后没有被清棹的气泡可以使用吸头将其吹破）拍 干后必须马上进行下一步骤，

26、防止时叫过长使微孔变干燥了。2. 4.4显色步骤上一步的清洗程序进行之后，马上用微量移液枪在每一个微孔中都 加入100 u l显色剂，轻微震动反应板使之彻底混匀。室温下显色10分钟。在每个微孔中加入100 ul终止液充分混匀。在450nm下检测吸光度，实验结果在10分钟之内读取最佳，样品 在30分钟之内都有效，尽早进行检测读取。3、结果计算3.1分析计算每个标准品以及样品的平均吸光度根据eltsa计算软件的分析，测得四环素的标准曲线如图1。100t图1是根据叫环素的6个标准品（bi、b2、b3、b4、b5、b 6 ） 所测得的标准曲线。第1个点代表b2与b1的比值，第2个点代表 b3与b1的比

27、伉，依次类推，第5个点就是b6与b1的比值。表1四环素标准浓度及百分吸光率ser. no. concentrationabsorbanceb/bocalculateddeviationppb(mean) (cv)(%)ppb(%)10. 001.8440.5100.020. 3001. 7751.496. 30.3010.331.001. 5180.882. 30. 9970.343.000.9373.950.83.010.359.000. 52218.728.38.990. 1627.000. 16033. 18.727.000.0表2市售鸡肉中叫环素类药物检出情况采样地点靖远 临夏 榆中

28、永登 武j-ixjs采集样品数444444检出数000000检出率000000由表1可知根据酶联免疫试剂盒测出鸡肉屮四环素屮的含量均 0.3 g/ kg,其中最低含量为根裾表2可看出，5个地方四环素 的残留量并未超出最低的检出范围（100g/ kg），四环素的残留量在 这5个地方中的差异性都极显著（p 0.01）。所测出的含量水平存 在一定的差异性。4、结论由上述结果分析可知，甘肃各地区间的四环素残留量相互之间差 异极其显著。造成以及出现了这种不同残留量差异性很大的原因很可 能是由于不同地方所使用四环素的剂量不同以及使用四环素的用药 期与休药期不同等方面的原因所导致的。根据研究结果表明，不同地

29、方鸡肉屮四环素的残留量差异显著， 因为不同地区所使用四环素的用药期和休药期的不同，才会使得四环 素的残留量也因此不同。小剂量的使用四环素类药物可在动物体内迅 速排除，如果大剂量用药后立即上市，会使得动物产品屮检测出的四 环素类药物含量较高；如果用药后不立即进行宰杀，而是经过药品 的休药期，四环素就很有可能在鸡肉体内排出，那么在鸡肉屮检测出的四环素含量就较低或者为零。由此可见，对于表1中存在的差异 可能也与药品的用药期和休药期有一定关系。另外叫环素在不同地区 动物体a代谢的水平也存在差异。不同地方可能用药期不同而造成代 谢水平不同，因此，为y动物性食品安全起见，各级农牧部门应加强 监管力度，保证

30、出栏畜禽药物残留量尽可能过了休药期，并且进一步 的增强和提高对其它兽药添加剂的监管措施。只有从源头上做到了合格守法才能有一片健康的食品市场。让我 们从自身做起，遵纪守法，对得起自己的良心。对a己负责也对社会 负责。让我们共同努力为y祖国的米来一起创造一个美好的明天。参考文献1 叶树德.食品屮兽药残留卫生技术m.天津：天津科学技术出版社，1998: 第77-79页。2 李俊邱月明，王超.啓药残留分析m.上海：上海科学技术出版社， 2002:第 365 390 页。3 张洁，罗义，周启星，四环素类抗生素生态毒性研究进展j.农业环境 科学学报，2008, 27 (2):第 407- 413 页。4 中国啓药委员会.中平人民共和国啓药典啓药使用指南化学药品卷：2005年版 m.北京:中国农业出版社,2006:第3436页。5 屮华人民共和u农业部、卫生部、w家药品监督管理局.禁止在饲料和动物 饮用水中使用的药物品种目录j.农业部公告第176号。6 动物性食品屮兽药最高残留限量g 2002年12月24 tl以235号公告发 布。7 卢运战，祁克宗，朱良强.四环素类药物残留检测方法研究进展.家禽科学, 2006. 10:第36- 39页8 张素霞，李俊锁，钱传范.饲料巾四环素多残留分析方法研究-mspd-