枸杞多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠肾脏保护作用及其机制研究

1、枸杞多糖对ii型糖尿病大鼠肾脏保护作用及其机制研究孙桂菊，张勇，黄杰1，王少康，孙子林2,黄培林3(尔南大学公井卫生学院营养与食品卫生系，1南京市卫生监督所，2尔南大学附属中大医院内分泌科，3东南人学基础医学院病理学与病理生理学系，南京210009)【摘要】h的：观察枸杞多糖(lbp)对ii型糖鉍病人鼠杼脏的保护作川及机制。方法：川 链脲佐菌素(stz)结合高脂饲料建立ii型糖尿病大鼠模型，根据胰岛素敏感指数、糖耐s 曲线下而积分为模型组，lbp低、中、高剂fi组120、40、80 mg/ (kgbw?d) j,同时设立正 常对照及正常高剂景对照组，试验期1个月。检测lbp对ii型糖以病人鼠血

2、淸糖基化终产 物-肽(ages-p)、糖基化血红蛋a (hbalc)及肾脏a介素-8(il-8)含解:、1抒脏痫理变化的 影响。结果：lbp讨降低11型糖尿病模型大鼠血清ages-p及血浆hbalc与肾脏中il-8含肾脏病变明显改善。结论：lbp可降低模型大鼠糖基化终产物的产生，减少肾脏il-8 的分泌，从而预防糖尿病肾病的发生。营养学报，2006, 28 (1)： 47-50j 关键同：枸杞多糖；糖以病肾病；糖基化终产物；tl细胞介素-8糖w肉肾祸(diabetic nephropathy,dn)足糖以炳慢性ifll管并发症之-，其发牛.机制尚无定 论，h前研究较多的足组织非酶糖菇化终产物(

3、advanced glycosylation endproducts,ages)嘗积 1、醛糖还原酶(aldose reductase, ar)活性改变2等。近年来又发现il-8与dn发病有 关l3j。枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides, lbp)是枸杞子有效成分之一。我们矜 报道lbp具有降血糖作用，并nj提高模型大鼠的胰岛素敏感桁数(isi)。本研究主耍观察 lbp对ii型糖尿病人鼠肾脏保护作用及k机制。1材料与方法1.1样品lbp按相关文献进行提取。1.2主要试剂、仪器链脈佐菌素(streptozotocin，stz), sigma公司产dna自动扩

4、增仪，techne incorporated； eps 604稳压穂流电泳仪，南;科宝仪器研究所；岛津-10a命效液相色谱仪， 日本岛津公司；is-1001凝胶成像系统，上海复u科技有限公司。i.3 n型糖尿病大鼠模型的建立据文献h建立n型糖鉍病动物模型，其条件为：(丨)胰岛索敏感指数isi=lnl/(空腹血 糖值x血清胰岛素水平)，isis正常大鼠isi的均值减1个标准差；(2)葡萄糖耐量实验曲 线下側积26; (3)空腹胰岛素不小于正常大鼠的均值减一个标准差。1.4动物分组将糖尿病模型大鼠随机分为4组，分别为模型组(model)，继续给予高脂饲料，灌胃蒸 馏水；lbp低、小、高剂景组，在给

5、予高脂饲料的同吋湘胃给予lbp 20、40、80 mg/kg bwo 同时设正常对照组和正常lbp菇剂朵组，喂普通饲料，p者灌胃给予lbp8()mg/kgbw。持 续灌胃1个月沿，动物断尾取血测定hbalc、血清ages-p含s,处死后取肾脏进行病理学 检査和用免疫组化及逆转录聚合酶链式反成(rt-pcr)进行肾脏il-8 mrna含景测定。1.5指标测定1.5.1大鼠肾脏il-8含量的测定：免疫组化法：试剂盒购tl福州迈新生物制剂公操作少骤按试剂盒说明书进行。人鼠 竹脏组织50100 mg,川异丙醇-乙醇-步法离心提取rna,使川晶芙生物工稈公司的试剂 盘，采用rt-pcr技术对肾脏组织屮的

6、mrna进行逆转录扩增，以p -actin作为内参对照， pcr反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，在图像扫描仪k观察并扫描入电脑，用统计软件处理， 得出h的条带与内参照条带的光密度比值。1.5.2血清ages-p的测定：流动注射分析法6。1.5.3血浆hbalc的测定：采川德国拜耳公司的dca2000型糖化血红蛋白分析仪测定。1.6统计方法数裾以x土s表示，采用sas 6.12统汁软件对数裾进行统计分析。 2结果2.1 lbf对血清ages和hbalc含量的影响(表1)table 1 the effect of lbp on ages level in serum andhbalc level in

7、 plasma in typeii diabetic rats ( t 土 j )group-bp (mg/kg bw)nhbalc in plasma (%)ages-p in serum (pg/ml)model77.7±1.35.22 ±0.80low lbp2086.3 士 1.3b3.07 ±0.45"med lbp4075.8±1 jb3.01 ±0.84mhigh lbp8085.2±0.9b2.73 土 0.84nh8073.8 ±0.9"2.84±0.80wnc0103.8&#

8、177;o.7m2.87 ±0.56"low=low dosc med=medium dose>high=high dosenh=high dose oflbp in normoh nc=normalcontrol：4>=15.89,<0.001： v=12.69./ko.ool: a: compared with the model group (/k0.05)b: compared with the model group and the normal group (zko.05) , the same in belowlbp低、屮、高剂撒组hbalc

9、水平明显低于模型组，但仍m于正常对照组，差异有显 著性(p<0.05)。各实验组大鼠血清中age-p的水平，模型对照组，显著高于其它各组 (f= 12.69, pc0.05)。2.2 lbp对肾脏病理学改变的影响(图ia-e)a： normal control: b: model： c： lbp low dose group d s lbp medium dose group： e： lbp high dosse groupfig. 1 the histopathological observation of kidney undera：microscope (he staining)d

10、:实验结束吋模型组光镜下可见肾小球明敁增大，肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚、系膜区増宽，近端肾小管上皮细胞呈现大s空泡变性。lbp低、中、高剂g组与模型组相比,忖小球系膜区增宽、基底膜增厚均较轻，行小管空泡变性较少。2.3 lbp对模型大鼠肾脏il-8含量影响(图2 a-e)a: normal control： b: model： c: lbp low dose group：d： lbp medium dose group： e： lbp high dose groupfig. 2 the histopathological observation of kidney undermicrosc

11、ope (immune histochemistry staining)2.3.1免疫组化法检测：模型纟ii的肾小球®底膜和內皮细胞的胞浆中冇il-8免疫阳性物质沉积，lbpg各剂s组 的免疫阳性物质沉积率明显降低，肾小球基底膜上的显色降低，正常对照组不显色。2.3.2 rt-pcr：实验结來时lbp各剂量组肾脏皮质il-8 mrna含量明显低于模型组，差异显著(p<0.05),低、屮剂量组仍高于正常对照组(p<0.05),而高剂贤组与正常对照组比，差异不显著(p0.05,图3,表2)。3讨论dn是糖尿病特别是非胰岛素依赖型糖尿病的严重并发症之一。ages是由蛋白质的游

12、离氨基端与还原糖(如葡萄糖)经过一系列非酶促反应形成的结构多样的不可逆聚合物，研究 发现小分子糖基化终产物-肽(age-p)可与靶组织或蛋白(如胶原、低密度脂®白)再次共价联 结形成第二代ages,从而在糖尿病、尿毒症等慢性血管并发症中发挥更重要的作用7。肾 脏对小分子ages-p清除能力下降可明显加重糖尿痫患者血管病变的发生和程度8。糖尿病 人血清ages水平明高于正常人，动物实验或临床试验证明，运用ages抑制剂-氨基胍 等可预防或延缓dn等并发症的发生9, 10。另外tashiro等11报道dn患者尿中il-8含 量明显升高，可通过鉍中il-8含m评估dn病人肾脏受损程度。il

13、-8分泌上调可使肾小管 上皮细胞和间质细胞向肌纤维母细胞的表型转化，雉质产生增多，加速肾小管间质病变病理 过程。1234567450bp <-270bp3.lbp medium dose group; 4. lbp low dose group; 5.diabetic model group; 6.normal groupfig. 3 the comparison of il -8 mrna expression in the renal cortexgroupnlbpsupplement (mg/kg bw)il-8mrna rt-pcr dec trap ho rc sis(gray

14、 sc ale)m odd70.80 士 0.22low lbp8200.52±0.18med lbp7400.41 ±0.1 2：lhigh lbp8800.29 ±0.04"high in normal rats7800.23 士 0.03"nc1000.24 士 0.05mtable 2 the effect of lbp on il-8mrna expression inthe renal cortexf=78.42，/<0.0001 a! dunnetts t-test， compared with the modelgroup

15、 (/k0.05)本研究表明，各实验组大鼠血清中ages-f以枚型对照组最高，与我们以往报道的fflm li2j,也与孙子林等的结果-致。lbp各剂量组大鼠血清ages-p与肾脏1l-8含量均明品 低于梭型对照纟ll(p<0.05)，说明lbp可降低糖鉍痫人&糖基化终产物的产生，进而降低体内il-8的分泌，从而减轻糖尿病所引起的肾脏损害，从肾脏病理组织学的改变也可得到证 实。故lbp作为降血糖，预防dn的保健食品与药品具有广阔的开发前景。i参考文献j11孙子林，刘乃丰，孙桂菊，等.糖尿病小鼠血清糖基化终产物水平增高m.中国糖尿病杂 志，2000, 8： 315316.2 汽玛莉，

16、贾力莉，武玉鹏，等.岌枯草醇提物对实验性糖以病竹脏病变的作川j.山西屮 医学院学报，2000, 1： 7-10.3 付搏，陈香美.细胞因子与肾脏疾病j.中华医学杂志,1998,12： 1 18.4j张勇，孙桂菊，孙子林，等.枸杞多糖降血糖及预防糖鉍病行病作川的实验研究uj.江苏咝 药，2003, 29： 157-160.5 何进，张声平.枸杞多糖研究j.食品科学，1995, 16： 14-21.6 wrobcl k，wr6bel k.garay-scvilla me，et al.novcl analytical approach to monitoring advanced glycation

17、 end products in human serum withon-line spectrophotometric and spectrofluoro-metric detection in a flow systemj.clin chem 1997,43： 15631569.17 jgugliucci a，menini t.circulating advanced glycation peptides in streptozotocin-induceddiabetic rats:evidence for preferential modi-fication of igg light ch

18、ainsj.life sci,l998,62： 21412150.l8j沈克勤，杨俊伟.糖基化终产物与血管病变及糖尿病肾病llj.肾脏柄与透析肾移植杂志， 1996, 5： 51-58.9li ym,steffes mdonnelly t，et al.preventionof cardiovascular and renal pathology of aging bythc advanced glycation inhibitor aminoguani-dincj.proc natl acad sci usa, 1996,93： 3902 -3907.10wolffenbuttel-bh，boulanger-cm，crijns-fr，etal.breakers of advanced glycation end productsrestore large artery properties in experimentaldiabetesljj.proc natl acad sci usa 1998,95： 4630-46