κ-阿片受体兴奋抗低氧性肺高压的作用及其机制

1、-阿片受体兴奋抗低氧性肺高压的作用及其机制背景: 低氧性肺高压 (hypoxicpulmonaryhypertension,HPH) 是肺高压的主要 临床类型 ,它是临床众多心、 肺疾病发生、发展过程中重要的病理生理环节 ,其特 征主要表现为肺血管收缩和肺血管重构 ,但其发生机制尚不完全清楚 , 并且仍缺 乏较为理想的治疗方法。因此，阐明HPH的发病机制和积极寻找有效的防治措施 一直是医学界面临的重大课题。研究表明 , 缺血或低氧可促进心脏合成和释放内源性阿片肽 , 从而对缺血心肌产生保护作用。我们前期研究发现，缺血后处理可促进K-阿片受体(kappa-opioidreceptor,k -OR

2、)内源性激动剂强啡肽(Dynorphin)的释放,并起到保护缺血心肌的作用。但Dynorphin对HPH的作用尚不清楚。另外，k -OR外源性激动剂U50,488H 可通过兴奋k -OR舒张肺动脉、抑制肺血管重构从而起到抗HPH的作用。且前期研究表明低氧可上调K -OR的表达,其潜在机制是否由于低氧促进K -OR内源性激动剂Dynorphin的释放？及其在HPF中的作用及机制等问题尚不清 楚。近年来研究发现，钙敏感受体(calciumsensingreceptor,CaSR) 在HPH形成过 程中发挥了重要作用，可能会成为防治HPH的重要靶点。研究表明 , 肺动脉平滑肌细胞 (pulmonar

3、yarterysmoothmusclecells,PASMCs) 可表达CaSR低氧可促进其表达，后者通过信号传导介导了肺血管收缩与 PASMCs 增殖重构,最终导致HPH的发生。本室前期实验表明兴奋 k -OR可显著抑制低氧 诱导的肺血管重构和PASMC的增殖，从而缓解HPH的形成，同时预实验意外发现， k -OR对CaSFg白具有负性调节作用。但兴奋k -OR抗HPH的作用是否通过抑制CaSR言号实现的尚不清楚。另外, 在低氧诱导的肺血管收缩反应、肺血管重构的过程中 , 往往伴随着炎症反应。我们前期的研究证实了兴奋k -OR可以显著抑制心肌缺血导致的炎症反应， 但是兴奋k -OR是否可以抑

4、制低氧诱导的肺动脉的炎症反应也未见报道。基于以上存在问题，本论文拟在前期研究结果的基础上，进一步研究(1) K -OR内源性激 动剂DynorphinA在抗HPH中的作用；(2)兴奋k -OR是否可通过调节CaSR的作用 进而发挥抗HPH勺作用;(3)初步探讨k -OR兴奋在低氧诱导的肺动脉炎症反应中 的作用。通过以上研究以期深入阐明k -OR介导的抗HPH勺作用及其机制,并为临床 应用阿片类药物防治HPH提供新的实验依据。目的：1.探讨k-OR内源性激动剂 Dynorphin在HPH中的作用。2. 探讨k -OR对CaSR的调节作用以及CaSF在 k -OR兴奋抗HPH中的作用。3. 探讨k

5、 -OR兴奋在低氧诱导的炎症反应中的作用。方法:1.将SD雄性大鼠置于低氧舱中模拟高原约 5500m高度的气压环境，大 气压约50kPa,氧浓度约10%每日进行8h低氧处理,分别进行低氧1、2和4周。 在整体水平,观察k -OR激动剂DynorphinA、U50,488H和k -OR阻断剂nor-BNI 对HPH大鼠的平均肺动脉压力(meanpulmonaryarterialpressure,mPAP) 的影响， 检测CaSR激动剂新霉素和CaSR阻断剂NPS2143对HPH的血流动力学的影响。2. ELISA试剂盒检测HPH大鼠血和肺组织中DynorphinA、ET-1和AngU等因 子水平

6、的变化。3.血管张力测定实验检测 DynorphinAI-13、U50,488H和nor-BNI 对HPH大鼠的肺动脉张力的影响，检测CaSR!动剂Spermine和NPS2143对HPH 的肺动脉张力的影响。检测U50,488H和NPS2143预先处理后的低氧组大鼠肺动脉对 ACh的反应。4. MTT试剂盒和BrdU试剂盒检测DynorphinA1-13对低氧诱导的PASMC增殖的 作用,采用CCK-8试剂盒检测Spermine对常氧和低氧时PASMC增殖的影响。5. 免疫荧光组织化学法检测k -OR与CaSF在低氧时PASMC的表达变化及定位情况。6.免疫共沉淀法检测k -OR与CaSF在

7、 PASMC的相互作用关系。7. Western-blot 法检测U50,488H对HPH大鼠肺动脉CaSR的蛋白表达的影响；检测Spermine对正常和低氧时PASMC的增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)、Erk 和 p-Erk 等蛋白表达的影响。8. 透射电镜检测U50,488H和NPS2143对HPH大鼠的肺血管内皮和右心室的超微 结构的影响。9. 液相微珠悬浮芯片检测血清细胞介素 -6(interleukin-6,IL-6) 、细胞介素 -10(interleukin-10,IL-10) 和单核细胞趋化蛋白-1(monocytec

8、hemoattractantprotein-1,MCP-1)等含量的测定结果：第一部分 k-OR内源性激动剂Dynorphin在HPH中的作用1.低氧2周和4周可显著升高雄性SD大鼠的mPAI和右心室内压(rightventricularpressure,RVP)并超过诊断标准,说明低氧2周即可形成稳定的HPH大鼠模型。2.低氧1周和低氧2周可促进SD 大鼠血浆和肺组织中的 Dynorphin 水平的增加 ,而随着低氧时间延长至 4周时, 其水平已经回降；但ET-1和AngH的水平在低氧1周、2周和4周均随时间的推 进而不断显著增加。3. 与低氧2周组相比,低氧前预先给予nor-BNI可进一步

9、上调SD大鼠的mPAPDynorphinA可显著降低低氧2周组和低氧4周组大鼠的mPAP,U50,488F也可显 著抑制低氧4周组大鼠的mPAPQynorphinA的作用弱于U50,488H的作用。4. 在离体血管水平，DynorphinA和U50,488H均可舒张常氧组和低氧组大鼠 的肺动脉 , 且两者的舒血管效应均可被 nor-BNI 所阻断 , 另外 ,DynorphinA 的舒血 管效应弱于U50,488H的舒血管效应。5.在细胞水平，DynorphinA可抑制低氧诱 导的PASMC的增殖效应,且这一效应可被nor-BNI所阻断。低氧可促进PASMC内 k -OR的蛋白表达，而Dyno

10、rphinA可进一步促进其表达,DynorphinA的这一效应可被nor-BNI所阻断。第二部分k -OR对CaSR的调节作用以及CaSF在k -OR兴奋抗HPH中的作用1.在常氧状态下,k -OR和CaSF在 PASMC均有显著表达，并且以上两个受体存在共定位关系。低氧可上调以上两个受体的表达 , 并且共定位情况较常氧组相比更为明显。CaSR激动剂Spermine可上调两受体的蛋白表达，但以CaSR的表达增加更为明显, 而U50,488H则在上调k -OR的表达的同时下调CaSR的表达。IP 结果提示两受体之间存在相互作用关系。 2. 在常氧状态下 ,Spermine 可收 缩SD大鼠的肺动

11、脉。Spermine对HPF大鼠肺动脉的收缩效应较正常时显著增加，而且作用持续的 时间也显著增长。U50,488H可显著抑制Spermine对正常和低氧组SD大鼠肺动 脉的收缩效应。另外发现,p38抑制剂SB203580JNK抑制剂SP600125Erk抑制剂Sch772984 和ME!抑制剂U0126等均可显著抑制Spermine的收缩效应。常氧状态下,NPS2143 预处理后 ,U50,488H 的舒张肺动脉的效应明显降低。3.静脉给予CaSF另一激动剂新霉素可上调常氧组 SD大鼠的RVP新霉素还 可显著上调低氧组大鼠的RVP且较常氧组升高的更为明显，持续时间更长。而预 先给予U50,48

12、8H处理可抑制新霉素的这一作用。低氧前给予U50,488H和CaSR阻断剂NPS2143均可显著下调低氧诱导的SD 大鼠的RVP和mPAP而U50,488H的这一作用可被nor-BNI所阻断。此外,电镜结 果显示,提前给予U50,488H和NPS2143匀可显著改善低氧诱导的肺血管内皮结构 紊乱和心脏结构紊乱。4.与常氧组相比，低氧3周组SD大鼠对内皮依赖性舒张剂 ACh的反应性显著 下降,而低氧前给予U50,488H和NPS2143匀可显著增加肺血管对 ACh的反应性。5. 在细胞水平，Spermine处理24h可显著促进正常PASMC的 0D值（CCK-8测定试 剂盒），而兴奋k -OR可

13、显著抑制Spermine的这一作用。此外,Spermine的作用还可被P38抑制制SB203580 JNK抑制制SP600125 Erk抑制制Sch772984和MEK卬制剂U0126所抑制。与常氧组相比，低氧组CCK-8 的OD值显著上调,而Spermine可进一步上调该ODfi,NPS2143和U50,488H均可 显著降低低氧时PASMC的ODfi。6. 在细胞水平,Spermine可显著促进正常PASMC的 PCNA和 P-Erk的蛋白表 达,提前给予U50,488H可显著抑制该作用，而U50,488H的这一作用又可被 nor-BNI所阻断。此外,Spermine可进一步促进低氧时的

14、PASMC的 PCNA和 P-Erk 的蛋白表达。而U50,488H及NPS2143匀可显著降低低氧诱导的 PASMC的 PCNA和 P-Erk 的蛋白表达。第三部分k -OR兴奋在低氧诱导的炎症反应中的作用大鼠在低氧3周后,血清中炎症因子IL-6和MCP-1均可显著上调，而IL-10的表达没有显著变 化,k -OR兴奋可显著抑制低氧诱导的IL-6和MCP-啲表达,同时可显著上调 IL-10 的表达,以上效应均可被 nor-BNI 所阻断。结论:1.DynorphinA作为k -OR内源性的激动剂，其与k -OR外源性的激动剂 U50,488H-样,通过扩张肺动脉、抑制平滑肌细胞增殖等具有抗HPH的作用。内源性Dynorphin在低氧早期1-2周分泌释放增加可能通过兴奋k