人参果胶与半乳凝素

1、人参果胶与半乳凝素 -8 相互作用的构效关系研究果胶是一类存在于植物细胞壁中的酸性杂多糖 , 具有抗肿瘤、抗病毒、免疫 调节等生物活性 , 但其活性机理并不十分明确。近年来的研究发现果胶能够结合 半乳凝素 , 为果胶活性机理的研究开辟了新的领域。半乳凝素是一类具有高度保守的糖基识别结构域 (CRD)、并且能特异性结合B -半乳糖苷的凝集素。半乳凝素家族中的半乳凝素-8(GAL8),作为一种调节细胞 粘附性的因子参与多种生理和病理过程。GAL8的过量表达会引起一些疾病。例如,在某些癌症中高表达的GAL8可以 促进肿瘤细胞的增殖和血管的生成。但目前关于GAL8的抑制剂/调节剂的研究较少，果胶是否具

2、有抑制或调节GAL8的功能至今未见报道。因此,本论文以人参果胶为研究对象,探究了果胶与GAL8的相互作用及其构效关系。具体研究内容及结果如下 : 一、不同结构的人参果胶级分及其片段的制备和 结构分析。 (1) 人参果胶经过离子交换层析、凝胶过滤层析、果胶酶酶解等方法 处理,得到了 4个RG-I型果胶级分和4个HG型果胶级分。对RG-I型果胶级分2A-Dp进行部分酸水解,制备了含有不同侧链结构的3个RG-I果胶片段。(3)采用高效液相和二维核磁等技术分析了 2A-Dp及其片段 的结构，结果表明，2A-Dp中的Ara主要以a -1,5糖苷键连接，部分Ara的C3位带 有分支,Gal以B -1,4糖

3、苷键连接。结构片段2A-Dp-4和2A-Dp-12只含有B -1,4-Gal侧链。二、果胶类寡糖的制备和结构分析。(1)为了获得寡聚的B -1,4-Gal侧链结构,以富含B -1,4-Gal的土豆半乳聚 糖为原料 ,通过部分酸水解和凝胶过滤层析 ,制备了聚合度从 2 到 15 的高纯度系 列寡聚半乳糖 , 并利用质谱和二维核磁鉴定了其结构。 根据二维核磁结果 , 总结了 峰面积随聚合度变化的规律。为了获得同聚半乳糖醛酸片段,以富含a -1,4-GalA的向日葵果胶为原 料,通过酶解和凝胶过滤层析 ,制备了聚合度从 2到6的系列寡聚半乳糖醛酸。 三、 不同结构的人参果胶与 GAL8的相互作用的比

4、较。利用红细胞凝集阻抑方法分析了各种果胶级分与GAL8的相互作用，发现人参果胶级分可以抑制GAL8与红细胞间的作用。并利用生物膜干涉技术测定了其 结合的亲合力,发现果胶能与GAL8结合,且RG-I型果胶级分与GAL8作用较强。四、RG-I型果胶与GAL8互作的构效关系。本论文分别从果胶结构和蛋白结 构的角度分别进行了研究。从果胶结构的角度：(1)RG-I型果胶级分2A-Dp及其三个结构片段与GAL8的相互作用的研究结果显示,Ara在RG-I与GAL8相互作用中几乎不发挥作用,Gal 侧链是RG-I与GAL8结合所必须的结构。分析了 RG-I果胶的侧链一一系列寡 聚半乳糖与GAL8的亲和力,结果

5、表明寡聚半乳糖结合 GAL8的亲和力与LacNAc 相当,RG-I型果胶与GAL8的高亲和力是多条寡聚半乳糖侧链共同作用的结果。(3)研究了 RG-I主链在互作中的作用，发现RG-I的主链不能与GAL8直接结 合,主链起骨架支撑的作用。从蛋白结构的角度,对GAL8的截短蛋白和突变体分 别与RG-I果胶级分2A-Dp的相互作用进行了比较研究。(1)乳糖抑制实验结果显示,乳糖能够抑制RG-I果胶与全长GAL8的结合,说 明二者结合利用经典的 CRD吉构域。(2)2A-Dp与GAL8的两个截短蛋白(N-CRD C-CRD和两个突变体(R69H R233H)的结合亲和力分析结果显示，RG-I型果胶既可

6、以结合在GAL8的N-CRD也可以结合在C-CRD且结合在N-CRD勺亲和力稍强。乳糖抑制结果表明,RG-I果胶结合在GAL8两端CRD中乳糖结合位点。五、 RG-I型果胶侧链结构与GAL8互作的晶体学研究。本论文通过对共结晶条件的筛选和优化,成功获得了 GAL8与寡聚半乳糖的 共晶体。利用 X 射线衍射晶体衍射技术对共晶体结构解析 , 发现寡聚半乳糖稳定 地结合在经典的乳糖结合位点。寡聚半乳糖的非还原端 Gal和非还原端第二个Gal与GAL8的45位Arg,69 位Arg和89位Glu形成了稳定的氢键。此外,本论文还发现GAL8的N端结构 (GAL8N,1-186aa)在结合半乳4糖时,N端前导序列形成了新的B折叠结构,被命 名为 F-1 。综上所述 , 本论文以人参果胶作为研究对象 , 研究了果胶与半乳凝素 -8 相互 作用及其构效关系。首次报道果胶能结合并且抑制GAL8;RG-I(而非HG)吉构域是 果胶的活性成分 ,RG