人乳头瘤病毒16型E7蛋白的生物信息学分析

1、人乳头瘤病毒16型e7蛋白的生物信息 学分析丛盛日林晓瑞任雪文王雪莲中国医科大学临床三系中国医科大学基础医学院病 原生物学教研室摘要：目的 应用生物信息学预测分析人乳头瘤16型病毒（human papillomavirus type 16, hpve7蛋白的结构特征与抗原表位。方法 自ncbi gene bank获 取hpv16e7蛋白的基因信息，应用protparam分析其编码的e7蛋白理化性质和 一级结构;利用sopma分析e7蛋白的二级结构;应用swiss model的automated mode预测e7蛋白的三维空间结构;使用netnglyc 1. 0server>netphos

2、3. lserver> motifyscan> signalp 及 tmhmm 预测蛋白质的翻译后修饰位 点、信号肽切割位点和跨膜区；利用clustalx将hpv16e7蛋白同其他高危型hpv e7蛋白进行同源性对比;应用abcpred、bepipred、iedb、syfpettht和 netmilciipan 3. iserver预测e7蛋白的优势抗原表位。结果生物信息学预测e7 蛋口无规卷曲占52. 04%,结构较松散，为不稳定性蛋口。该蛋口存在多个磷酸 化位点。利用序列匹配度为46%的hpv45e7蛋白为模板得到同型二聚体三级预测 结构。e7蛋白高度保守，冃.具有潜在的b细胞

3、抗原表位1-8.15-22.33-46, cd8+t 细胞抗原表位82-90. 11-19. 7_11、85-9313-21和cd4+t细胞抗原表位9-23、 73-87、10-24、7-2k 21-35。结论hpv16e7蛋白为不稳定蛋白。该蛋白高度保 守，且具有潜在的b、t细胞抗原表位。关键词：人乳头瘤病毒;e7蛋白;抗原表位;生物信息学;作者简介：王雪莲，e-mail : wxl cmuhotniai 1. com作者简介：从盛口（1996-）,女，山东烟台人，七年制本科在读，临床医学专 业（英语班）o e-mail :1579528953qq. com收稿日期：2017-05-11 基

4、金:国家自然科学基金项目（no. 81472439, 81101989）bioinformatic analysis of the e7 protein of human papillomavirus type 16cong sheng-ri lin xiao-rui ren xue-wen wangxuetianthird department of clinical medicine 100 k,chirm medical university; department of microbiology and parasi to logy, college of basic medical

5、sciences, chirm medical university;abstract：objective to use bioinformatics to prcdict the struetural features and epitopes of the e7 protein of human papillomavirus (hpv) type 16. methods genetic information on the e7 protein was obtained from the ncbi gen bank database. the hydrophily, isoelectric

6、 point, and primary st rue ture of the e7 prolein were analyzed with protparam. the secondary structure of the e7 protein was dnalyzed with sopma and its three-dimensional structure was analyzed with swissmodel in automated mode. netnglyc 1. oscrver, netphos3.1 server, motifyscan, signalp, and tmhmm

7、 were used to predict the existence of post-translational modification sites, signal peptide cleavage sites, and transmembrane regions of the e7 protein. clustalx was used to compare the homology of the e7 protein from i1pv16 and other high-risk hpvs. abcprcd, bepiprcd, iedb, syfpeithi and netmhciip

8、an 3. 1 server were used to predict dominant epitopes of the e7 protein. results bioinformatic analysis revealed that random coils accounted for 52. 4% of the secondary structure of the e7 protein, indicating that the protein has a loose st rue tu re. the e7 prot ein meiy be un stable, with an ins t

9、abi lity index of 63%. multiple phosphorylation sites were found in the e7 protein, including three serine phosphorylation sites, six threonine phosphorylation sites, and one tyrosine phosphorylation site. hpv45 with an amino acid sequenee that matched 46% of the sequenee of hpv 16 was used as a tem

10、plate to obtain homo-dimer to predict the tertiary structure of the protein. the e7 protein is highly conserved and it possesses potentialb cell epitopes at or near amino acids 1-8, 15-22, and 33-46;the protein has cd8 t cell epitopes at or near amino acids 82-90, 11-19, 7-11, 85-93, and 13-21 and c

11、d4*t cell epitopes at or near amino acids 9-23, 73-87, 10-24, 721, and 21-35.conclusion the hpv16e7 protein is unstable and highly conserved. it possesses potential b cell epitopes and t cell epitopes.keyword：human papillomavirus; e7protein; epitope; bioinformatics;received： 2017-05-11宫颈癌是由人乳头瘤病毒(hu

12、man papillomavirus, hpv)引起的恶性肿瘤。根 据世界卫生组织(wii0)发布的全球癌症报告2014，世界范围内宫颈癌的发 病率占女性恶性肿瘤的第二位，仅次于乳腺癌。我国每年约有13万新发宫颈癌 病例，占世界宫颈癌新发病例总数的28%,且近年来宫颈癌发病有年轻化趋势 hlo宫颈癌的治疗方法主要有手术、放疗及化疗図，这些治疗方法对患者创伤 大，治疗后复发率高，可能剥夺患者的生育能力。目前针对hpv16型与hpv18 型所致宫颈癌的预防疫苗已经上市，无性经验的女童接种后，可获得较好的预 防效果回_。但该疫苗对已经发生hpv感染的个体及宫颈癌患者无治疗作用。因 此，研发副作用小、

13、疗效好的宫颈癌治疗疫苗势在必行。hpv的基因组包括早期基因区el、e2、e4、e5、e6和e7,晚期基因区l1和l2, 以及一个被称为长控制区域(lcr)的非编码区域。早期转录区(e区)主要编 码e1-e7早期蛋口，涉及病毒的dna复制，转录，翻译以及细胞转化等重要过程 4-5 o高危型hpv的癌蛋白e5、e6和e7是宫颈癌发生和发展的主耍病毒因素, 主要通过克服宿主细胞蛋白调控的负增长以及诱导基因组的不稳定而起作用， 是hpv相关癌症的特征蛋白回。e7蛋白作为重要的细胞转化蛋白，是导致宫颈 癌的关键因素，在hpv相关肿瘤发生发展中起重要作用口1。e7蛋白无任何内在 的酶活性或者结合dna的能

14、力，而是通过结合少数细胞周期调控因子发挥作用。 其中较为成熟的机制是e7蛋白能够结合rb家族，使prb降解进而导致e2f转录 因子的释放，使细胞由g1期进入dna合成的s期，造成细胞异常增殖。除此之 外，e7蛋白还与细胞中心体的超常复制有关在转基因小鼠模型，e7蛋白单 独就可以诱导细胞恶性转化，e6蛋白的加入则可加剧这-进程，提示两者具有 协同促进癌变作用昼1。除了使未分化与分化的基底上层细胞增殖，e7蛋口还能 与e6蛋白协同抑制细胞凋亡，激活端粒酶使细胞永生化回。e7蛋白作为导致 宫颈癌的重要细胞转化因子，仅在人宫颈癌细胞中表达，而正常的细胞和组织 不表达该蛋白10。因此以e7蛋白为靶点的宫

15、颈癌治疗性疫苗能最大程度减轻 因治疗对机体正常组织造成的损害。利用生物信息学技术预测和筛选表位，从而使表位的筛选更容易。己有文献报道 通过生物信息学技术开展靶抗原蛋白分子的b抗原表位预测，获得了 ebv lmp211和沙眼衣原体12的b表位等的预测结果，并通过实验进一步证实了 生物信息学技术的可靠性。本研究利用生物信息学软件对e7蛋白进行同源性分析及抗原表位预测，并通过 对其结构与理化性质的分析，验证预测结果的可行性，为宫颈癌治疗性疫苗的 研制奠定基础。材料与方法1 hpv16e7基因及其编码蛋白e7蛋白基因locus tag为hpv16gp2,基因id为1489079。自美国国立生物技术 信

16、息中心 dna 数据库 ncbi gen bank (/genebank/)获取 hpv16e7全基因组相关信息。其编码的e7蛋h在蛋白质库中的登录号为 np_ 041326. k其他高危型hpv株的e7蛋口氨基酸序列来自ncbi数据库。2 hpv16e7蛋白生物信息学分析2.1 hpv16e7蛋白一级结构及亲水性分析应用expasy提供的在线工具protparam13(http:/predietprotein, org. vl ib. muc. edu. cn/)分析 e7 蛋白的一级结构和 理化性质。利用proscalc(http:/web. ex

17、pasy org vlib muc edu. cn/protscale/) 分析 e7 蛋白的亲疏 水性。2.2 hpv16e7蛋白质二级结构分析应用sop-ma(http:/hs npsa-prabi. ibep fr. vlib muc edu. cn/cgi-bin/npsa_automat p l?page=/npsa/npsa sopma. html) 14在线分析 hpv16e7 蛋白的二级结构。2.3 hpv 16 e7蛋白质三级结构同源建模将hpv16的e7蛋白序列提交到swiss model的automated mode进行同源自动建 模(http:/swissmodel.

18、expasy. org. vlib. muc. edu. cn/),预测 e7 蛋白的三维 空间结构。2.4 hpv16e7蛋白的翻译后修饰位点、跨膜区域及信号肽切割位点分析应用糖基化netnglyc 1. oserver软件分析e7蛋白的糖基化位点15;应用 netphos3. 1 server软件分析e7蛋白的磷酸化位点应用motifyscan (http:/, myhi ts. isb-sib. ch/cgi-bin/motif_scan)预测 e7 蛋白翻译后修饰位 点17;应用 signalp 4. iscrvcr(http:/www. cbs. dtu. dk. vlib. muc

19、. edu. cn/services/signalp-4. 0/) 预测信 号肽切割位点18;应用tmhmm server v. 2. 0工具(http:/www. cbs. dtu. dk. vlib. muc. edu. cn/services/tmhmm/)分析蛋白跨膜 区域。2. 5同源性及分子进化分析应用在线服务器blast及软件clustalx 2. 1分析高危型iipv e7蛋口氨基酸序列 的同源性;利用 mega 7. 0. 20 中 phylogeny 的 construct neighbor-joining tree, 用bootstrap method推算分析e7的进化关

20、系。2.6 hpv16e7蛋白抗原表位的分析应用 ab-cpred(http:/www. imtech. res. in. vlib. muc. edu. cn/raghava/abcpred/abc_submiss ion. html) 19, bepipred 1.ob server(http:/www. cbs dtu. dk. vlib muc edu. cn/scrviccs/bcpiprcd/) 20以及免 疫表位数据库和资源(1edb)的 bepipred linear epitope prediction (http:/tools. iedb. org. vlib. muc.

21、edu. cn/main/)预测 e7 蛋白的 b 细胞抗原 表位；应用syfpettht(http:/www. syfpeithi. de. vlib muc edu. cn/bin/mll-cserver dll/epitopepr ediction. htm)和 netmhcii-pan 3.lscrvcr21(http:/qqv. cbs dtu. dk. vlib muc edu. cn/services/netmhcllpan/) 以及 iedb预测e7蛋白潜在的cd8和cd4t细胞抗原表位。在iedb预测中，cd8t细胞 表位使用 tedb analysis resource c

22、onsensus tool 22并结合 ann aka netmhc (4. 0) , smm和combi ib多种方法进行预测,cd4t细胞表位使用iedb analysis resource consensus tool预测。然后结合同源性分析得岀b细胞和t细胞的优 势抗原表位。结果1 hpv16e7基因的基本信息genbank中显示，hpv16e7基因全长297bp,位于hpv全基因组7 6047 900, gc 含量为43.10%。在病毒基因组复制中，可驱动休眠细胞进入细胞周期。该基因 编码98个氨基酸，起始密码子为aug,终止密码子为uaa。编码hpv16e7蛋白的 蛋白质库登录号为

23、np.041326. 1,在uniprot的登陆号为p03129。2 hpv16e7蛋白的一级结构及基本理化性质e7蛋白共有98个氨基酸。通过expasy中protparam预测分析，该蛋白理论分 子质量单位(mr)为10. 995 30x 10，理论等电点为4.20,带负电荷氨基酸残基 (asp+glu) 19个，带正电荷氨基酸残基(arg+lys) 5个。含量最多的氨基酸是 leu、asp、glu和thr,分别占11.2%、10. 2%、9. 2%和9.2%。预估的半衰期在哺 乳动物网织红细胞为30h。不稳定指数为63. 00%,为不稳定蛋口。脂肪族氨基酸 指数为78. 57%o利用pro

24、tscale中hphob. /kyte&doolittle预测e7蛋白的亲疏水性，结果见图1。该图横坐标为氨基酸位点，纵坐标为其亲水性分数。1-53 为亲水区，54-98为疏水区，亲水性平均系数为-0. 405o e7蛋白可能为亲水性蛋 白。pratfieale output fersequencepos it ion图1 hpv16e7蛋白质的亲疏水性分析fig. 1 affinity analysis of hpv16e7protein下载原图3 hpv16e7蛋白二级结构利用在线分析s0pma服务器得到e7蛋白的二级结构，结果见图2。其屮h表示 螺旋，约占23. 47%;c表示b

25、-折叠片，约占21.43%;t表示b转角，约占3.06%;c表示无规则卷曲，约占52.04%。提示e7蛋白无规则卷曲含量较高，结 构较松散。无规则卷曲区域为1-5、29-51、60-64、71-75及91一98。图 2 sopma 预测的 hpv16e7 蛋白二级结构 fig. 2 tertiary structure of hpv16e7homology modeling下载原图4 hpv16e7蛋白的三级结构同源建模利用 swiss model (http:/hs. swi ssmodel. expasy. org. vl ib. muc. edu. on/) 的automated mod

26、e预测hpv16e7蛋白的三级结构o hpv16e7蛋白的46-97位氨 基酸与序列相似度为46%的hpv45e7蛋白能够进行同源建模，结果见图3。其匹 配预测的 oligomeric state 为 homo-dimer (同型二聚体)。ii | iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii102930405860alpha helixbeta turn图 3 hpv16e7 蛋白三级结构同源建模 fig. 3 prediction of secondary structure of hpv16e7protein下载原图5 hpv16e7蛋白的翻译后修饰位点、膜区域及信号肽切割位点利用糖基

27、化netnglycl. oserver软件分析e7蛋白潜在的糖基化位点。signalp4. oserver及tm-hmm server分析hpv16e7蛋白不存在信号肽切割位点及跨膜区 域。提示e7蛋口不能参与糖基化，可能不存在糖基化位点且不是分泌蛋口或膜 蛋白。磷酸化netophos3. iserver软件分析其可能的3个丝氨酸磷酸化位点分别 为31、32、95, 6个苏氨酸磷酸化位点分别为5、19、20、56、64、7& 1个酪 氨酸磷酸化位点为52 （图4）。其中超过阈值0.5判定为潜在的磷酸化位点。motif scan分析得到相似结果:e7蛋白存在4个ck2磷酸化位点，分别为7

28、-10. 32-34、72-75、78-81; 2 个 pkc 磷酸化位点，分别为 65-67、95-97。netphos 3.1a： predicted phosphorylation si"405060sequence position图 4 netophos 5. iserver 预测 hpv16e7 蛋白磷酸化位点 fig. 4 prediction of phosphorylation sites of hpv16e7protein下载原图6 hpv16e7蛋白分子进化及同源性分析e7蛋白在人乳头瘤病毒中普遍表达，其中hpv16、18、31、33、35、45、52、56、

29、58、61等属于高危型hpv23o推测高危型hpv的e7蛋白含有高度同源的基因 序列。在ncbi屮得到相关e7蛋口的氨基酸序列，blast保守区为3-94oclustalx 2.0分析这些蛋白几乎全部氨基酸序列高度保守，即e7结构域（图5）,其中 hpv16e7 蛋白的相对保守区为 1-17、18-39、52-70 和 76-95。利用 mega 7. 0. 20 构建分子进化树，结果见图6o hpv16e7蛋白与hpv31e7蛋白进化关系紧密，而 与i1pv45和i1pv18的e7蛋白进化关系较远。人乳头焉病奇45型 人乳头韶病壽"t诬 人乳头冠病構亍連 人乳头瘤疝毒3虺人乳头拓摘

30、痔16型 人乳头病綱再33型 人乳头痫摘構58型 人乳头篇病帝52单人乳头疝病濡61型 人？i头倉病宙51型 人乳头症病击56型图 5 hpv16e7 蛋白多重序列比对分析 fig. 5 the result of multiple sequence alignment下载原图700.0498950.070.09人乳头瘤病毒330.11人乳头瘤病岂0>17人乳头瘤病毒0.1s550.030j10.39960.120<14人乳头瘤病岂人乳头瘤齐人乳头瘤系740.060.26人乳头瘤病壽51型0.25人乳头瘤病毒56型0.321000.13人乳头瘤弔人乳头瘤病着0.10图 6 iipv

31、 e7 蛋白分子进化分析 fig. 6 i1pv e7protcin molecular phylogenetic analysis下载原图7 hpv16e7蛋白质抗原表位分析由于大约20%的宫颈癌病人为hla-drb 1*0401阳性，所以等位基因选择 hla-drb 1*0401。人类编码hpv16e6和e7蛋白抗体的等位基因为hla-a*02:01, 所以选择i1la-a*o2:o1。利用abcpred预测b细胞抗原表位，利用iedb analysis resource和syfpe1th1预测cd4t细胞与cd8t细胞抗原表位，结果见表1。结合 bepipredl. 0server>

32、; netmhllpan 3. lserver 和 iedb analysis resource 预测的b细胞、cd4t细胞和cd8t细胞表位预测结果和保守区分析结果，预测优 势b细胞抗原表位为1-8、15-22、33-46, cd8t细胞表位为82-90 > 11-19、7-11、 85-93> 13-2k 优势 cd4t 细胞表位为 9-23> 73-87、10-24、7-2k 21-35。表1 hpv16e7蛋白的优势抗原表位预测table 1 the prediction results of hpv16e7protein dominant epi topes 下载原

33、表e细胞表位cd4+t细胞表位b cell epitopescd4+ t cell epitopesabcpredsyfpeithiiedb26 368-229-2353-6320-3473-8730-4049 6370-849-199-2310-2419-2912-2676 9014 2473-8775-8948-5876 9011-2539-4984-985 193-1356 708-22讨论hpv16e7蛋白含有98个氨基酸,其预测分子质量单位(mr)为10. 995 30x10, 大于10x10,推测其具有较强的免疫原性oiipv16e7为不稳定蛋口，而不稳定蛋 白易发生脱酰胺、氧化等

34、反应，致使其抗原性增强23-24。三级结构预测显示 e7蛋白为同型二聚体，有利于被抗体识别。研究表明，表位富含带电荷的极性 氨基酸25 ° e7蛋白含有许多极性氨基酸，且都落在预测的优势抗原表位之内。 在机体内，蛋白质的亲水性残基一般位于蛋白质表面，而疏水性残基一般包埋 于蛋口质内部，亲水区易与抗体结合成为抗原表位型1。本研究预测e7蛋口的 全部b细胞抗原表位和大部分t细胞抗原表位都落在亲水区内。无规则卷曲结构 松散，易与抗体结合，成为抗原表位可能性大27 ° e7蛋白无规则卷曲含量高, 且无规则卷曲区域与抗原表位预测结果基本相符。磷酸化可增加蛋白质的亲水性, 而抗体更易与

35、磷酸化蛋白结合。木研究预测e7蛋白的抗原表位和磷酸化表位基 本重合。蛋白保守区不易发生变异，以保守区内的抗原表位为靶点的疫苗具有高度稳定 性。hpv16e7蛋口高度保守，与其他高危型hpv e7蛋白有相对保守区。hpv16e7 蛋白仅在hpv感染细胞或病毒转化的肿瘤细胞中表达，而止常的组织和细胞不 表达该蛋白28,因此其可作为hpv治疗性疫苗的理想靶抗原。木研究利用多个 表位预测软件筛选出落在相对保守区内的优势抗原表位，其中优势cd4t细胞抗 原表位为9-23、73-87、10-24、7-21、21-35,优势cd8t细胞抗原表位为82-92、 11 -19、7-lk 85-93、13-21,

36、优势 b 细胞抗原表位为 1-8、15-22、33-46。这 些表位可能成为宫颈癌治疗性疫苗的靶点。蛋白在进化树中遗传距离越近同源性 越高，存在交叉免疫的可能性越大。e7蛋白在高危型hpv中存在交叉抗原，可 激发机体的交叉免疫。交叉抗原的存在使得以hpv16e7蛋白为靶点的疫苗有望用 于其他高危型iipv引起的宫颈癌的免疫治疗。荧光显微分析e7蛋白存在两个新型的核定位信号(nls)和一个核输出信号 (nes),表明hpv16e7蛋白可在细胞质和细胞核中穿梭必1。本研究预测e7蛋 白不存在信号肽切割位点及跨膜区域，提示e7蛋白属于胞内蛋白。蛋白存在t 细胞抗原表位，能与mhc i/h类分子整合，

37、呈递给t细胞，从而激发以细胞免 疫为主的免疫应答。目前宫颈癌治疗性疫苗研究多以e6或e7蛋白为靶点，并已研制出活载体疫苗、 多肽类/蛋白疫苗、dna疫苗及树突状细胞疫苗，但安全有效的治疗性疫苗仍未 上市30。木硏究采用牛物信息学方法预测e7蛋白含有b、t细胞抗原表位，为 治疗性多肽疫苗的研制及优化提供了依据。在后续研究中，我们计划通过进一步 的实验验证预测的表位。参考文献1 li s, hu t, lv w, et al. changes in prevalence and clinical characteristics of cervical cancer in the people&qu

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