PCR技术及其发展和应用页

1、1会计学PCR技术及其发展和应用页技术及其发展和应用页一、PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugDNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/LPCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点天马行空官方博客：http:/ ;QQ:13182411891234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DN

2、A双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍MOVIE1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95天马行空官方博客：http:/ ;QQ:131824118950引物1引物2DNA引物引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第1轮结束95第2轮开始50TaqTaqTaqTaq72第2轮结束天马行空官方博客：http:/ ;QQ:1318241189模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第

3、5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 重复30轮后230=1,073,741,8241.8530=103,550,417PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善n1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。n但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善n1985年，美国PE-Cetu

4、s公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）n基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制n然而，采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善n1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 n1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 n耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后P

5、E-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪（1）在0.5ml PCR管内配置20ul反应体系： CK(ul)1#(ul)模板01引物10.50.5引物20.50.510 PCR Buffer22Taq酶0.20.2dNTPs0.50.5ddH2O16.315.3Total2020（2）PCR反应程序PCR结果：1、对照(无模板)；26、PCR产物（5ul样品）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点n灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细

6、菌n简便、快速1.一次性加好反应液，14 小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析n对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNALambda DNA，模板量分别为100 pg, 10pg, 1pg, 100fg , 10fg n序列的查找可在相关的网址，如/pubmed 查找各种目的序列。n同源性比较可以在www.ncbi.nih/blast.cgi进行在线比较或通过OMIGA、Clustal X等软件进行两两或多序列的比较。引物序列同源性比对3引物设计常用软件主要有：nPrimer Premier 5.0 n

7、Oligo 6nprimer 3nThe Primer GeneratornNet Primer 1. 将序列输入软件中（2）在表中粘贴序列（1）新序列两个方法选择序列文选择序列文件所在位置件所在位置（2）打开原有的序列文件 在对话框中输入待扩增序列 点击左上角的“Primer”按钮2. 设置相关参数Hairpin: 引物自身是否会形成发夹结构引物自身是否会形成发夹结构Dimer: 同一种引物是否会形成二聚体同一种引物是否会形成二聚体False primiring: 引物在待扩增序列中其他位置是否有配对引物在待扩增序列中其他位置是否有配对Cross Dimer: 正向与反向引物间是否会形成二聚

8、体正向与反向引物间是否会形成二聚体正向和正向和反向引反向引物的互物的互换换正向和反向正向和反向引物的评价引物的评价正向和反向正向和反向引物的信息引物的信息每点击左每点击左边红色的边红色的按钮，就按钮，就出现相应出现相应的内容的内容对正向和反向引物进行编辑对正向和反向引物进行编辑可对引物进行增加或减少碱基用键盘输入5个碱基引物的信息引物的信息改动后引物的信息重新回到双引物的界面“Edit”“Copy”“Sense Primer”5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 34. 输出引物序列 合成内容合成内容产量产量(OD)发货时间发货时间(工作工作日日)纯化方式纯化方式价

9、格价格(￥)普通引物合成(60 base)23PAGE1.60/base253OPC1.30/base5105PAGE2.20/base3OPC1.80/base205PAGE4.00/base3OPC3.20/base305PAGE5.80/base3OPC4.60/base506PAGE10.00/base4OPC8.00/base1007PAGE询价5OPC询价长链合成(6090 base)25PAGE3.50/base长链合成(90120 base)25PAGE5.00/base*生物科技有限公司的引物合成服务 逆转录酶DNA聚合酶活性mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增 电泳结

10、果用软件Quantity-one 3.2进行半定量比较，结果进行配对t检验分析00.40.501020Time after CSP added(min)EB density of PsaA/16S22d16S(463bp)PsaA(254bp)图2， 2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaA mRNA的表达。 1 2 3 4 5 6 7图1， 2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaA 的RT-PCR电泳图。line1: Marker2. line2-4: 0min, 10min, 20min after S.pneumoniae No.2 wa

11、s added CSP. line5-7: 0min, 10min, 20min after S.pneumoniae No.2d was added CSP. *转化到大肠杆菌后，提取质粒，采用质粒引物即可直接对X片断进行扩增后测序，得到X基因序列信息。（10/64）EGFPXdw序列序列Xdw序列序列质粒引物质粒引物质粒引物质粒引物质粒引物质粒引物例子：S.pn体内诱导基因序列的获得 图1 第1、2、3组引物多重PCR电泳图 1：正常对照；2：DL2000 marker；310：检出的缺失型患者 杜氏/贝克型肌营养不良症 一种常见的致死性神经-肌肉系统的X连锁隐性遗传病，其基因突变中缺失最

12、常见，约占55%65%，缺失分布的位点较多，随地域及民族的差异而有不同特点 （A）为5端引入突变 （B）为单碱基突变 S.Pn的ply为一细胞毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大减弱。构建突变体作为疫苗： 首先设计4个引物：（M1和M2完全重叠）P1: 5-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3 BamH IP2: 5-CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3 Xho IM1: 5-GGTCAATAATGTCCCA-AGAATGCAGTATG-3 M2: 5-CATACTGCATTCT-TGGGACATTATTGACC-3 突变位点M2M1

13、P2P1555335为酶切位点序列1. 以基因组DNA 为模板，以P1和M1为引物扩增出ply上游片断，以P2和M2为引物扩增出ply下游片断2. 以上下游片断为模板，以P1和P2为引物，扩出全长3. 酶切后克隆到质粒中保存A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达三、实时荧光PCR技术Ct值的定义：PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。 实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。 荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(

14、T)循环数标准曲线循环数标准曲线10410310610510210定量原理q初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少（Ct值）qLog浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量确定初始模板的浓度 I5353SGExcitationSGSGSGSGEmission 5353SGSGSGSGSGExcitationEmission 图图1 comE基因荧光定量基因荧光定量PCR扩增曲线扩增曲线图图2 comE基因荧光定量基因荧光定量PCR融解曲线融解曲线 表1 D39菌株在CSP诱导后不同时间的comE基因mRNA表达批次comE/16

15、SrRNA0min10min*20min10.03410.95200.040220.19741.20470.111230.01240.40730.0160*：p0.05，CSP诱导10min时comE的表达量较0min和20min时显著增高实验结果：Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer荧光共振能量传递（荧光共振能量传递（FRET Probe）双标记探针（双标记探针（Taqman Probe）TACCGGGGGTTACGAACG GTAATG A T C C T A C CG A T C C C A C

16、 CSNP检测RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标分子信标（Molecular Beacon Probe）535353533RQ5RQRQ35QRRREmissionExcitationQR引物特异性探针（引物特异性探针（Amplifluor Probe）灵敏度高 灵敏的荧光检测较电泳检测灵敏度高特异性高 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性定量准确 全程监控，准确的算法进行定量无需跑胶，自动化程度高4通道实时荧光定量通道实时荧光定量PCR仪仪3、荧光定量 PCR仪PCR技术的应用 研究与生产基因克隆，DNA测序，分析突变 诊

17、断细菌、病毒、寄生虫检测，肿瘤诊断 法医犯罪现场标本分析 其他 + 我国已批准生产的部分生物技术药物名称 作 用 rhu EPOrhu EPO 产生红细胞rhu IFN1b (外用) 病毒性角膜炎rhu IFN1brhu IFN1b 乙肝、丙肝rhu IFN2a 乙肝、丙肝、疱疹等rhu IFN2a (酵母) 乙肝、丙肝rhu IFN2brhu IFN2b 乙肝、丙肝白血病等rhu IFN2a (栓剂) 妇科病rhu IFN2b (凝胶剂) 疱疹等rhu IFN 类风湿人胰岛素 糖尿病rhu GCSF 刺激产生白细胞rhu GMCSF 刺激产生白细胞、骨髓移植rhu GH 矮小病乙肝疫苗 预防

18、乙肝rhu EGF(外用) 烧伤、创伤EGF 衍生物 烧伤、创伤rhu IL2 癌症辅助治疗rhu IL2 125Ser 癌症辅助治疗bFGF(外用) 创伤、烧伤RSK 溶血栓(心梗) 抗IL28 单 抗乳膏剂 银屑病痢疾疫苗 预防痢疾dioldiol1st cycle denaturation1st cycle annealingdioldioln=35total1st cycle extensiondioldioldioldiol2nd cycle denaturation2nd cycle annealingdioldioldioldioldioldiol2nd cycle extens

19、ionA正常人A病 人外源性基因正常人 (-)病 人 (+)-地中海贫血症地中海贫血症 扩增阻滞突变系统（ amplification refractory mutation system，ARMS）进行检测300bp1000bp800bp图1，珠蛋白ARMS检测结果11、2分别为正常样本的N产物和M产物，3、5、7为检测样本的N产物, 4、6、8为相应M产物。图2，珠蛋白ARMS检测结果2 1为N产物，2为M产物对照产物861bp囊性纤维化病囊性纤维化病(CF)(CF) 镰刀型细胞贫血症镰刀型细胞贫血症 HBV感染的传统诊断主要采用免疫测定法检测血清标本中的HBSAg，HbeAg，抗-Hbs

20、，抗-HBc和抗-Hbe（两对半），免疫学方法虽然比较简单，但只能提供血清中的HBV间接证据，无法证明是否具有传染性，且敏感性较低。目前的荧光定量PCR方法多采用TaqMan探针，一般根据HBV基因中的高度保守序列来设计，能够检测少至10拷贝/mL的HBV DNA。检测限范围宽为2502.5109拷贝/mL，是传统方法的良好补充。乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBV）的）的PCR检测检测 普遍认为HBeAg阳性者具有较强的传染性，而HBeAb的出现说明病情好转或稳定，其传染性弱。这113例HBeAg阴性患者检出42例HBV-DNA阳性，阳性率37.2%，具有传染性。 A组(HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均阳性)，B组(HBsAg、抗-HBc均阳性)，C组（抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc均阳性），D组（抗-HBc 阳性）， E组（抗-HBe、抗HBc阳性）血清学模式 例数阳性数阳性率A组622845.2B组16637.2C组12433.2D组15212.5E组8117.2合计11342