番茄和胡萝卜中类胡萝卜素的C30与C18HPLC分离

1、论 著 番茄和胡萝 卜中类胡萝 卜 素的 c 0 与 c 1 8 h p l c分离 惠伯棣 李 京 孙拿拿 裴凌鹏 廖萍泰 ( 1 北京联合大学应用文理学院 ， 北京 1 0 0 0 8 3 ； 2 首都师范大学生命科学院， 北京 1 0 0 0 3 7 ； 3 中国中医科 学院， 北京 1 0 0 0 0 9 ； 4 兰州医学院公共卫生学院， 甘肃 兰州 7 3 0 0 0 0 ) 摘要 ： 为提 高胡萝 卜 素 的分 离水平 ， 在相 同的 h p l c条件 下比较 了 c 与 c 。 。 柱对番茄和胡 萝 卜中类胡萝 卜素的分 离情 况。比较 的 色谱 条 件 为： c 3 0固定

2、相 ： y mc m c a r o t e n o i d s一5柱 ( y mc ， 2 5 0 m m4 6 m m， 5 t t 1 ) ； c l 8固定相 ： d i a m o n s i 柱( d i k m a t e c h n o l o g i e s ， 2 5 0 n ln l 4 6 n l n l ， 5 ) ； 流动相 a： 乙腈 +水 = 9 +l ； 流动相 b ： 乙酸 乙酯； 线性梯 度 洗脱 ： 在 前 1 5 m i n内， b由 0 增为 1 0 0 ， 随后 ， b保持 1 0 0 ， 流速为 1 0 m l mi n ， 检 测波长为 4 5

3、 0 n m， 进样量为 2 0 ，室温。从二者 色谱 图的比较可以看 出， c 柱反相 高效液相 色谱在 分 离几何异构体 上显示 出明显 的优 势 ， 可有效 分 离成分复 杂、 多样 、 结构 相似 的不合氧类胡 萝 卜素顺反异 构体。可以认为 ， c 柱在分析食品 中类胡萝 卜素组分 的 领域 中具有 良好 的应 用前景。 关键词 ： 色谱法 ， 高压 液相 ；类胡萝 卜 素 ； 叶黄 素 c3 0 a n d cl 8 hplc s e p a r a tio n o f ca r o t e n o i d s f r o m pl a n t fo o d s hui bo -

4、d i ，l i j i n g，s un na - n a，pe i l i n g - p e n g，l i ao pi n g - t a i ( c o l l e g e o f a p p l i e d a r t s a n d s c i e n c e ， b e i j i n g u n i o n u n i v e r s i t y ， b e i j i n g 1 0 0 0 8 3 ，c h i n a ) abs t r a c t：f o r t h e p u r p o s e o f i mp r o v e me n t i n t he s

5、e p a r a t i o n o f c a r o t e n o i d s，a c o mp a r i s o n o f hpl c s e p a r a t i o n o f c a o r e t no i d s f r o m c a r r o t a n d t o ma t o b y c a n d c l 8 c o l u mn w a s m a d e u n d e r i d e n ti c a l c h r o ma t o g r a p h ic c o n d i t i o n s as：c 3 0 s t a t i o n a

6、r y p h a s e：ymc m c a r o t e n o i d s - 5 c o l u mn( y mc，2 5 0 mm4 6 ton i ，5 ta)；cl8 s t a ti o n a r y p h a s e ：di amon s i l m c o l u m n ( d i k ma t e c h n o l o g i e s ， 2 5 0 mm4 6 mm， 5 ) mo b i l e p h a s e a：a c e ton i t r i l e w a t e r( 9+1 ) mo b i l e p h ase b：e t h y l

7、a c e t a t e ；l i n e a r l y b i n a r y g r a d i e n t ： b i n c r e a s e d f r o m 0t o 1 0 0i n t h e fir s t 1 5 mi n u t e s a n d t he n k e p t c o n s t an t l y a t t h e fl o w r a t e o f 1 0 n fl min：mo ni t o rin g wa v e l e n g t h：4 5 0 mn；s a mp l e v o l um e：2 0 c o mp a rison

8、 o f c h r o ma t o g r a ms b y t h o s e t wo s t a t i o n a r y ph a s e s s u g g e s t e d tha t c3 0 一 hpl c e x h i b i t e d a s i g n i fic a n t b e n e fit f o r t he s e p a r a t i o n o f v a ri o u s c a r ot e n e s whic h a r e s i mi l a r i n s t r u c t u r e a n d t he i r g e

9、o me t ric a l i som e i t c an the re re b e c o n s i d e red t h a t c 3 0 c o l u m n h a s a b r i ght f u t u r e i n t h e a n a l y s i s o f c a r o t e n o i d s f r o m f o o d s t u ff s ke y wo r d：ch r o ma t o g r a p h y，hig h p r e u re l i qu i d；ca r o t e n o ids ；xan t h o p h y

10、 l l 类 胡萝 卜 素 ( c a r o t e n o i d ) 是 一类 天然产物 的总 称。根据其含氧与否 ， 类胡萝 卜 素可分为含氧的叶 黄素( x a n t h o p h y l l s ) 和不含氧的胡萝 卜素( c a r o t e n e ) 。 二者极性差异显著 ， 前者强 ， 后者弱 。所 以， 在吸附 型 h p l c中， 比较 容易将 它们分开。在胡 萝 卜素 中 存在众多的几何 ( e z ) 异构体 ， 在 自然界 中， 它们的 生物学功能也不 同，利用 吸附型 h p l c将其分离相 对 困难得 多 。 反相 c 。 是分 离类 胡 萝 卜素

11、时最 常用 的 h p l c 固定相。配合这种相固定相， 应用 的流动相 主要有 2类 ： 一 类 是 含 水 的 ( a r p) ， 另 一 类 是 无 水 的 ( n a r p ) 。其 中， 乙腈 +水( 9+1 ) 、 乙酸 乙酯组合是 应用得最广泛的一种流动相组合。无论应用哪种流 动相 ， c 固定相分离极性较强的叶黄素均是 比较成 基金项 目： 国家“ 十五 科技重大专项 ( 2 0 0 1 b a 8 0 4 a 2 1 ) 作者简介 ： 惠伯棣 男 副教授博士 功的， 但对结构类似的胡萝 卜 素及其异构体的分离 是困难的 “ 。c 加固定相是上个世纪 9 o年代才研 发成

12、 功 的一 种 反 相 吸 附 固定 相 。 由于 c 烷 基 的 链长大致与胡萝 卜素分子的长度相 当， 因而二者的 相互作用得到了增强。因此 ， 人们 期望胡萝 卜素及 其异构体在 c ， 。 固定相上可以得到更好的分离。 番茄和胡萝 卜中含有丰富的类胡萝 卜 素类化合 物， 主要为胡萝 卜 素 ， 是我国消费者饮食结构中重要 的类胡萝 卜 素营养成分源。本项研究在相 同的 a r p 流动相组合条件下 ， 对 c 与 c 。 。 固定相分离番茄 和 胡萝 卜中类 胡 萝 卜素 及其 异构 体 的情 况进 行 了 比较 。 1 材料 与 方法 1 1 材料 wa t e rs高 压液相 色

13、谱 仪 ，主要包 括 ： wm e rs 2 9 9 6二极 管阵列 检测器及 wa t e rs 6 0 0 e溶剂 番茄和胡萝 卜中类胡萝 卜 素 的 c 3 0 与 c 。 。 h p l c分离 惠伯棣李京孙拿拿等 - 2 8 9 - 维普资讯 http:/ 输送系统。 用于类胡萝 卜 素组分萃取的二氯甲烷 、 丙酮 、 石 油醚( b p ： 3 06 0) 均为分析纯试剂 ， 购 白北 京化 工厂。用于 h p l c流动相 的乙腈 、 乙酸 乙酯 均为色 谱级试剂 ， 购 白迪 马公 司( d i k m a t e c h n o l o g i e s ) 。a一 胡萝 卜

14、素、 口 一胡萝 卜 素及番茄红素全反式异构体参 比样品购 白s i g m a 公司。 1 2 样品的选择与制备将 a 一胡萝 卜 素 、 8 一胡萝 卜 素及番茄红素全反式异构体 参 比样 品用丙 酮定 容。分别取 1 g 新鲜番茄果实和胡萝 卜 组织 于研钵 中 ， 每次加入 4 m l 的丙酮 ， 重复研磨萃取至残渣 和 萃取液无色 。之后 ， 收集 、 合 并萃取液 ， 移 至分液漏 斗中， 加入等体积的石油醚及水 ， 使之分层 ， 弃去下 相 ， 反复加入与 上相等体积 的水洗涤上相 ， 收集上 相 ， 在4 5、 一0 0 6 m p a 条件下减压蒸馏 ， 除去部分 石油醚 ，

15、 使残 留液定容至1 m l ， 一2 0充氮保存 。 1 3 色谱条件 c 固定相 ： y mc tm c a r o t e n o i d s一5 柱 ( y m c ， 2 5 0 m m 4 6 m m，5 ) ； c l 8固 定 相 ： d i a m o n s i l tm柱 ( d i k m a t e c h n o l o gi e s ， 2 5 0 m m 4 6 m m， 5 ) ； 流动相 a ： 乙腈 +水 =9 +1 ； 流动相 b： 乙 酸 乙酯 ； 线 性梯 度洗 脱 ： 在前 1 5 m i n内 ， 流动 相 b由 0 增为 1 0 0 ， 随后

16、， 流动相 b保持 1 0 0 ， 流速为 1 0 m l m i n ， 检测 器 波长设 定范 围为 2 6 0 6 0 0 a m， 检 测波长为4 5 0 a m， 进样量为2 0 ； 柱温： 室温； 组分鉴 定方 法： 根 据 其 色 谱 行 为 ( 如保 留 时 间) 和 光 谱 特征 。 2 结 果与讨 论 2 1 胡萝 卜中类胡萝 卜 素的分离 a一及 一胡萝 卜素互为端基几何异构体 。二者参比样品的保 留时 间在 c 柱上相同， 电子吸收光谱见图 1 。胡萝 卜的 组织细胞 中含有 丰富 的 a一及 一胡萝 卜素 ， 图 2 为胡萝 卜 组织丙酮萃取物 c 。 柱 的分离色谱

17、图。显 然 ， 萃取物中二者的分离效果不够理想。 图 1 n一及 卢一胡萝 卜 素参 比样 品的的电子 吸收光谱 从 图 2可 见 组 分 i的 色 谱 峰 保 留 时 间 为 1 5 6 5 m i n 。图 3为 从 p d a检 测 器 上 收集 的 该 色 谱 遥 鬟 螫 i 色谱 条件 ： 见 1 3 。组分鉴定 ： i=混合物 图 2 胡萝 卜 石油醚萃取物 的 c 一h p l c色谱 图 峰左肩 ( 1 5 5 2 m i n ) 和 右 肩 ( 1 5 7 7 m i n ) 的 电 子 吸 收 光谱图。峰的左肩光谱与 a一胡萝 卜 素参 比样品的 光谱( 见图 1 ) 特征

18、相符合 ， 右肩光谱与 口一胡萝 卜 素 参比样 品的光谱 ( 见图 1 ) 特 征相符合 。同时 ， 右肩 光谱中还出现一最大吸收峰为 3 5 0 a m的组分信号。 该组分的光谱与六氢番茄红素( p h y t o fl u e n e ) 的光谱 特征相符合。因此， 可以认 为该色谱峰含有多种组 分。根据所得到的光谱信 息， 该峰可 以被认 为 由 a 一胡萝 卜 素 、 口一胡萝 卜 素和六氢番茄红素 3种组分 组 成 。 遥 鬟 螫 溶剂 ： h p l c流动相 图 3组分 i的 电子吸收光谱 图 4为胡萝 卜 组织丙酮萃取物 c 柱 的分离色 谱 图。图中峰 i和 的保 留时间与

19、 a一胡萝 卜 素和 卢一胡萝 卜 素参 比样品的保 留时间一致。其 电子吸 收光谱如图 5所示 ， 并 与参比样 品的光谱 ( 见 图 1 ) 特征一致。因此 ， 组分 工和 被分别鉴定为 a一胡 萝 卜素和 p一胡萝 卜素。比较 图 2和 4 ， 可以看出， 在相同的条件下 ， c 。 柱对 a一和 一胡萝 卜 素的分 离不及 c 柱 。 i l 0 0 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 00 0 2 5 0 0 保留时间( rai n ) 色谱条件 i 见 1 3 。组分鉴定 i i=n一胡萝 h素 ； ii=口一胡萝 h素 图 4 胡 萝 卜 石油醚萃取物 的 c h

20、 p l c色谱图 2 2番茄中类胡萝 卜 素 的分离 番茄红素全反式 c hi ne s e j中ou国r食na品l卫of生f杂oo志d h y g i e n e 2 0 0 6年第 1 1 5 卷第 4 期 z u u o平弗琶昂 4 朋 踟 如 5 4 3 2o o 一 督 o o o o o o o o o o o 一 维普资讯 http:/ 捌 呆 督 图 5 组分 i和 的电子 吸收光谱 异构体参比样品在 c 。 。 柱上进行色谱分离时 ， 其电子 吸收光谱 见图 6 。番茄果 实 中含有 丰富 的番茄红 素 ， 并还含有一定量的 口一胡 萝 b素。图 7为番茄 果实组织丙酮萃取

21、 物的 c 。 。h p l c色谱 图。图中峰 i和 的保留时间分别与番茄红素和 一胡萝 卜素 参比样品的保留时间一致 。二者的电子吸收光谱 图 见图 8 ， 并与参比样品吸收光谱( 图 1 及图 6 ) 特征相 符合 。可见 ， 二者可以在 c 。 。 柱上获得 良好的分离 。 趔 鬟 趔 荣 督 图 6 番茄红素全反式异构体参 比样 品电子吸收光谱 i：番茄红素 ； ：口一胡 萝 b素 图 7 番茄石油醚萃取物 的 c ， 。 柱 高压液相色谱图组分鉴定 图 9为番茄果实组织丙酮萃取 物 c 柱 的分离 色谱图。图中峰 i和 的保 留时间分别 与 口一胡萝 b 素和番茄红素参比样品的保留

22、时间一致。二者的 电子吸收光谱图见图 1 0 ， 并与参 比样品吸收光谱特 征相符合。显然 ， 二者亦可在 c 柱上获得 良好的分 离 。但洗脱顺序发生 了变化 ， p一胡萝 b 素先 于番 茄红素被洗脱出来 。这种现象的发生是因固定相表 面上烷基链 的增长导致其对胡萝 卜素的吸附选择性 发 生改 变所 致 。 除了分离不同种类 的胡萝 卜素外 ， c 柱显示 出 捌 呆 督 图 8 组分 i和 的电子吸收光谱 色谱条件 ： 见 1 3节。组分鉴定 ： i：口一胡萝 b素 ； ：全反式 番茄红 素； ：1 31 3 顺式 番茄红 素 ； i v：1 1 1 1 顺式 番茄红 素 ： v = 9

23、9 顺式番茄红素 图 9 番茄石油醚萃取 物的 c 柱高压液 相色谱图 图 l 0 组分 i和 的电子吸收光谱 有效分离番茄红素几何异构体 的能力。图 1 1为组 分 、 、 及 v的电子吸收光谱图比较 。与全反式 异构体 ( 组分 ) 相 比， 番茄红素顺式异构体 ( 组分 、 和v) 在其电子吸收光谱 的 3 6 3 n m处会 出现 趔 鬟 图 1 1 番茄红素几何异构体的 电子 吸收光谱 特征 比较 番茄 和胡萝 b中类胡萝 卜 素的 c 与 c ， 。 h p l c分离 惠伯棣李京孙拿拿等 加 如 加 m n o o o n 维普资讯 http:/ 论 著 总黄曲霉毒素 e l i

24、 s a定量检测方法的研制 江 涛 柳桢 郑 佳 李 敏计 融 ( 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所， 北京 1 0 0 0 2 1 ) 摘要 ： 为敏 感、 特异和快速地检 测食 品中总黄曲霉毒素的污 染水 平 ， 在抗 总黄 曲霉毒素单 克隆抗体 的基础 上， 研 制 了间接竞争 e l i s a检 测方法 ， 包被抗原 为 a f b 。 一b s a， 包被 量为0 0 6 2 5 g ， m l ， 抗体 工作 浓度 为 1 ： 1 61 0 6 。该 方 法时黄 曲霉毒 素 b+g标 准品的最低检 出浓度为0 1 3 n 异 f i i l ， 对样 品的最低检 出量为 1

25、5 0 t , e c k s 。 校正 曲线 的线性 范 围为 0 2 6 2 0 0 0 n g ， r i i l ， 线性方程 y：一0 4 4 6 3 x+0 3 5 3 2 ( r =0 9 9 1 5 ) ； 时黄 曲霉毒素 b+g 5 0 的抑 制浓度为 2 0 8 n g , m l ； 时玉米 2个加标水平 的平均 回收率分别为 9 4 5 6 和 1 1 2 0 5 ， 时花 生 2个加标水平的平均 回收率分 别 为 8 7 5 0 和 8 5 6 0 。该方法所用抗总黄 曲霉毒素单 克隆抗 体对黄 曲霉毒 素 b ， 、 b 2 、 g ， 、 的 交叉反应 率分别 为

26、 1 0 0 、 5 7 5 、 1 0 4 和 1 9 ， 与其 它真 菌毒 素无交叉反 应。 关键 词 ： 黄 曲霉毒素 类；抗体 ， 单 克隆 ； 酶联免 疫吸 附测 定 一特征吸收峰 ， 并且发生顺式异构的位 置越靠近分 子中部该特征 吸收峰越高 。根据已有文献 8 ， 9 的报 道 以及 图 9所显 示 的各组 分光 谱特 征 ， 鉴定 ： 组 分 为 1 3 ， 1 3 顺式番茄红素 ； 组分为 1 1 ， 1 1 顺式 番茄 红 素 ； 组 分 v为 9 ， 9 顺 式 番茄红 素 。 从 图 7和 图 9的 比较 可 以看 出 ， 在 相 同洗 脱 条 件下 ， c 柱 与 c

27、 柱 比较 ， 番 茄 红 素 顺 式 异 构 体 在 c 柱子上不再与全反式异构体存在于一个组分 中， 而得 到 了分 离 。达 到这 种 分 离 效 果 的 主 要 原 因是 c 固定 相 具有更 长 的烷基 链 ， 导 致 固定 相 的疏 水性 增加 ， 从而使番茄红素 的保留时间延长 ， 进而提高了 柱效 ， 最终能够较好地将顺 、 反式异构体分离。 4 5 6 7 8 参 考 文献 1 y o u n g a j ，b fi t t o n g，e d s c a r o t e n o i d s i n p h o t o s y n th e s i s m l o n d o

28、 n ： c h a p m a n a n d h a ll ， 1 9 9 3 4 1 ) 9 4 1 6 q 2 b r i t t o n g，l i a a e n j e n s e n s ，p f a n d e r h，e d s c a r o t e n o i d s ( 1 a)b a s e l m b o s to n a n d b e r l i n ：b i r k h a u s e r ，1 9 9 5 1 6 9 28 4 3 惠伯棣 ， 文镜 ， 裴凌鹏 ， 主编 类胡萝 卜 素化学 及生物化 学 m 北京 ： 中国轻工 出版社 ， 2 0 0 5

29、1 1 7 1 2 9 惠伯棣 ， 欧 阳清波 ， 曾悦 植物 食 品中类 胡萝 卜素 的高 压液 相色 谱 检测 j 中 国食 品 添加 剂 ， 2 0 0 2 ， ( 5 ) ： 7 2 8 2 ri e me r s ma r a，wo o d d a，ma c i n t y r e c c，e t a 1ri s k o f a n g i n a p e c t o r i s a n d p l a s ma c o n c e n t r a t i o n s o f v i t a mi n s a，c， e a n d c a r o t e n e j l a n c

30、e r ，1 9 9 1 ， ( 3 3 7 ) ：1 - 5 ts u k i d a k， s a i k i k， ta k i i ， e t a 1 s e p a r a t i o n a n d d e t e r mi n a t i o n o f c i s t r a n s - c a r o t e n e s b y hi s h p e r f o rm a n c e h q u i d c h r o m a t o g r a p h y j j c h r o m a t o g r ， 1 9 8 2 ， ( 2 4 5 ) ： 3 5 9 3 6 4 li n c h，ch e n b hde t e rm i n a t i o n o f c a r o t e n o i d s i n t o ma t o j u i c e b y l i q u i d c h rom a t o g r