天门冬氨酸生产工艺小总

1、天冬氨酸生产工艺的研究进展一、天冬氨酸简介天冬氨酸 (aspartic acid)又称氨基丁二酸，是构成机体蛋白质的主要氨基酸之一。结构式为： hoocch2 ch(nh2) cooh，分子量133.10。它有两种旋光异构体： d型和 l 型。通常所说的天冬氨酸是指等量的d型和 l 型的混合物，为无色单斜棱柱形结晶，溶于水，微溶于75%(w/w)乙醇，不溶于乙醚，熔点278280； l 型为无色菱形片状结晶， 溶于水， 微溶于醇，熔点 269271；d型溶于水、盐酸，不溶于乙醇及乙醚，熔点251。二、合成方法2.1 化学合成法化学法主要用于生产天冬氨酸的外消旋体dl-天冬氨酸。顺丁烯二酸酐和过

2、量氨水与nh4c反应，反应在一间歇反应釜中，于140、0.4mpa下反应 2.5h 。将得到的混合物冷却至70后用盐酸酸化至ph2.5，再冷却至室温，此时天冬氨酸沉淀析出，将沉淀过滤，4下水洗后得到产品，产率为 55% 。成都有机化学研究所的邓润华等采用微波法合成的收率为61.4%。该方法采用苯亚甲氨基乙酸乙酯为原料，在相转移催化剂（teba ）催化下进行卤化反应，经水解生成天冬氨酸外消旋体。2002年，浙江大学的邢亚军等在一钛材高压釜中，对顺丁烯二酸酐) 进行氨化反应合成了 dl-天冬氨酸。通过实验研究对原有合成工艺作出了改进，使产品收率提高到 70% 以上，并且对产品的分离提纯采用顺丁烯二

3、酸( 马来酸 )代替盐酸进行酸化结晶从而提高了反应物的利用和减少反应剩余物的污染。2003 年天津大学的王亚权等提出了一种简便的、不使用任何催化剂的化学合成法。实验在聚四氟衬里的250ml 高压釜中进行。实验步骤如下：将32.5g顺丁烯二酸酐 ( 分析纯 )溶于 70ml水中， 加入氨水 (分析纯 ) 至 ph8 ， 充 1mpa 氮气，然后在电磁搅拌下加热至453k，反应 6h，反应后冷却至室温，过滤后得无色晶体，收率 63.1%，熔点 338。产物的红外光谱与dl-天冬氨酸的标准谱图吻合，容量分析表明天冬氨酸含量98% 。2.2 生物酶法生物酶法ic 法（固定化细胞法或固定化酶法）1973

4、年，chibata i 等将大肠杆菌中提纯的天冬氨酸酶，包埋在交联聚丙烯酰胺中制成固定化酶， 富马酸和氨水由固定化天冬氨酸酶催化合成l- 天冬氨酸。1974年，chibata i 等进一步将高天门冬氨酸酶活力的大肠杆菌直接用聚丙烯酰胺包埋，制成固定化细胞。提高了酶的稳定性，避免了酶提取的复杂过程，首次实现了由富马酸转化为l-天冬氨酸的工业化生产， 转化率达到 99% ，开创了细胞固定化应用于工业生产的先例。1979 年，satot 等对固定化细胞的方法进行了改进，用天然产物- 角叉菜胶代替聚丙烯酰胺包埋大肠杆菌细胞，并用戊二醛、 戊二醛及环己二胺处理固定化细胞，以可溶性天冬氨酸酶为对照，研究了

5、这三种固定化细胞中酶的性质。三种固定化细胞的酶促反应的最适ph为 9，而可溶性天冬氨酸酶的最适反应ph为9.5 。固定化酶的最适温度比可溶性天冬氨酸酶高510。固定化细胞的表观 km值大约为可溶性天门冬氨酸酶的km值的 5 倍。细胞经固定化后， 热稳定性得到提高。固定化细胞柱在ph8.5 时比在天冬氨酸酶反应最适ph下操作稳定性高。1981 年1983 年居乃琥等利用大肠杆菌菌株，制备固定化大肠杆菌细胞，用于连续生产天冬氨酸，小试每g 湿细胞的天冬氨酸的产量最高可达1007g（30天） 。中试每 g 湿细胞的天冬氨酸产量为722g（25 天） 。该法所用的戊二醛的浓度和添加量，比一般方法的低。

6、由于戊二醛用量少，交联不充分，所以固定化细胞酶活力的回收率高，成本低，但稳定性较差，使用寿命短，所以要适当增加戊二醛的用量。1995 年胡永红，欧阳平凯建立了固定化细胞分离l 一苹果酸生产中残留富马酸并将其转化成l-天门冬氨酸的新方法。对生成l-天门冬氨酸的工艺条件进行优化 , 结果表明 , 当 l- 苹果酸反应液ph 调至 89,l- 天门冬氨酸添加量为6-8g/l, 碳酸铵加量为 15-20g/l,mg2+、 mn2+、 ca2+等二价阳离子加量为1mmol/l 时,固定化细胞可将 l一苹果酸反应液中残留的20% 左右的富马酸几乎全部转化成l-天门冬氨酸 , 且 l 一苹果酸含量的损失小于

7、5% 。1996 年张波采用三种不同发酵培养基，经过不同发酵时间取样测定酶活(ea)、ph、生物量 (biomass) ，确定选用培养基a；经不同底物浓度、不同金属离子对固定化细胞转化率的影响的实验，确定使用较高浓度底物及含mg2+ 的底物为佳，经实验测得固定化细胞的使用寿命为3 个月，即 3 个月之内能保持转化率在 85% 以上，固定化细胞的转化时间为3.5h 。1997年石屹峰等 21 设计了用于固定游离细胞生物转化的反冲式膜反应器（图1） ，利用膜将游离细胞阻挡于反应器内，同样达到固定化目的而又不损伤细胞(酶)。菌种采用研究者自己选育的含高活力天冬氨酸酶的escherichia coli

8、 sf-d4,培养基为 1% 反丁烯二酸胺 ,1%玉米浆 ,0.7%蛋白胨,0.1%kh2po4,0.5%(nh4)2so4,0.02%mg2so4。ph 7.2,37 , 摇床培养 24 h。细胞离心10,000 r/min 、10 min收集, 用生理盐水洗 2次。选择 0.22lm微滤膜，最佳细胞浓度为 35 mg/ml。张今等围绕天冬氨酸酶的活性部位、末端缺失突变、 蛋白质工程菌的固定化等方面进行了研究。将突变菌株用琼脂凝胶包埋法进行固定，固定菌量为95% ，表观酶活力为82000 单位，半衰期184d。实验表明， 1kg 固定化细胞，每24h约得 l- 天冬氨酸 30kg，日本三菱石

9、化公司已用黄色短杆菌(brevibacteriumflavum)发酵法生产l-天门冬氨酸。以往常用的细菌是大肠杆菌(e.coli),因它的细胞壁脆弱 , 要循环使用必须将菌固定化于载体上, 而该公司所用黄色短杆菌有坚韧的细胞壁, 故无需用昂贵的固定化方法 , 经离心分离反复可供反应使用。 所以, 用这种制造方法生产成本下降。fwc 法（游离细胞法或游离酶法）1996 年，南京化工大学徐虹等使用发酵培养基：富马酸2% ， , 玉米浆4%,kh2po4;0.2%,mgso4,0.025%, 用氨水调节 ph至 7.27.5 。培养温度为 37c ，培养时间为 26h 左右。以大肠杆菌培养液作酶源，

10、 采用游离酶法由富马酸转氨生成天冬氨酸。取培养26h 左右的培养液， 37酶反应 6d，可转化富马酸 9kg/l 。2000年， 王雪根、徐虹等又实现了游离整体细胞法工业化生产l-天冬氨酸，发酵培养基 : 富马酸铵 0.4%,富马酸钠2.0%,蛋白胨 0.9%,牛肉膏 0.4%,玉米浆1.4%,kh2po40.05%,mgso4#7h2o 0.05%泡敌 0.01%;ph 7.07.5 。发酵工艺：在摇床上培养 5-10 l 种子, 接种于 800 l 气升式发酵罐。发酵条件 : 初始 ph 6.5-7.0,风量 0.6 vvm,温度 37, 装液量 500-550 l 。l-天冬氨酸的生产流

11、程见下图。游离整体细胞可以在较短的时间内转化为较多的富马酸，且转化较为彻底， 转化率平均在 99以上，有的接近l00 。2003 年北京化工大学唐芳等利用较为便宜的水解棉籽蛋白代替蛋白胨作为氮源，用葡萄糖部分代替富马酸作为复合碳源，培养产天冬氨酸酶的大肠杆菌。结果表明，改变培养基配比后， 对菌体的总体酶活力 ( 即对底物转化能力 ) 影响不大，转化率可达 99% 以上，通过上罐发酵初步估算可以节约培养基碳氮源成本大约 60% 2.3 生物拆分法生物拆分法主要用来合成d-天冬氨酸利用 l-asp- - 脱羧酶进行拆分自然界中含高活性l-asp- - 脱羧酶的微生物较多。该酶能专一催化l-asp

12、脱除位羧基生成 l- 丙氨酸 (l-ala) ，因此可以利用该酶把 dl-asp中的 l-asp 转化成 l-ala ，而获得 d-asp。利用 l-asp- -脱羧酶进行的拆分是目前研究较为成熟的一种方法。2008 年韩铭海等提出了一种利用l- 天冬氨酸 -脱羧酶生物转化拆分dl-天冬氨酸得到 d-天冬氨酸的方法。当牛肉膏浓度为0.2%、玉米浆为 1.0%、蛋白胨为 1.0%时，发酵液酶活力可以达到最高。 转化过程最适 ph值为 67，转化过程最适温度 50， 浓度 6.0%以上的丙氨酸能显著提高转化过程中酶的热稳定性。利用 d-天冬氨酸和 l- 丙氨酸的等电点的差异来分离提取d-天冬氨酸的