nrf2信号通路在铅致shsy5y细胞氧化应激中的作用

1、本课题受如下基金资助nrf2信号通路在铅神经毒性中的保护作用研究（国家自然科学面上项目，项目编号：81072265 ）独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个入在导师的指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除文中已标明引用的内容外，本论文不包含任何其他 人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有尖保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有尖部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和

2、 借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有尖数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密口。（请在以上方框内打”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期： 年 月 日日期： 年 月 日英文缩写词汇表1摘 要3abstract11材料与方法23 26 30参考文献31综 述35致 谢45英文缩写词汇表(list of abbreviation )英文缩写英文名称中文名称anovaanalysis of varianee单因素方差分析areantioxidant response element抗氧

3、化反应元件bsabovine serum albumin牛血清白蛋白bzipbasic leucine zipper碱性亮氨酸拉链catcatalase过氧化氢酶ckhcasein kinase 2酪氨酸激酶2dcfh-da2/,7-dichlorofluoresci n di acetate2；八二氯荧光黄双乙酸盐dmemdulbecco's modified eagle5 medium改良的eagle培养基dmsodimathyl sulfoxide二甲基亚砌dntbdithiothymi ne double-nitrobe nzonic acid二硫代双硝基苯甲酸dttdithi

4、othreitol二硫苏糖醇fbsfetal bovine serum胎牛血清gapdhglyseraldehyde-3-phosphatedehydrogenase甘油醛3 磷酸脱氢酶gclcglutamate-cysteine ligase catalytic subunit谷氨酰半脐氨酸连接酶gshglutathi one谷胱甘肽gsh-pxglutathione peroxidase谷胱甘肽过氧化物酶gstsglutathione-s-transferases谷胱甘肽s 转移酶hbsshanks balanced salt solutionhanks平衡盐溶液4-(2-hydroxye

5、thyl)-piperazineethanesulhepesfonic acid4 轻乙基哌嗪乙磺酸ho-1hemeoxyge nase 1血红素加氧醜1中 ke-lik 技 cfso 觀 ed 硕）teinhlpolipid peroxides脂质过氧化物lsdleast significant d iff ere nee最小显著差法ltplong term potentiation长时程增强效应mrnamessenger rna信使核糖核酸nadphreduced form of nicotinamide-adenine还原型辅酶口nmdan-methyl-d-aspartaten 甲基q

6、 天冬氨酸nq01nad(p)h:quini ne oxidoreductase 1苯醍氧化还原酶ncnitrocellulose membrane硝酸纤维素膜nrf2nuclear factor erythroid 2-related factor 2核因子e2相尖因子2pbsphosphate buffer solution磷酸盐缓冲液pkcprotein kinase c蛋白激酶cpmsfphenyimethanesulfonyl fluoride苯甲基磺酰氟rosreaetive oxygen species活性氧sdssodium dodeeyl sulfonates十二烷基磺酸钠s

7、odsuperoxide dismutas超氧化物歧化酶tbstris-hci buffer solutiontris-hci缓冲盐溶液temedtetramethyl-ethylenediamine四甲基乙二胺tristrihydroxymethyl aminomethane三羟甲基氨基甲烷tris basetrihydroxymethyl amino methane base三轻甲基氨基甲烷盐nrf2信号通路在铅致sh-sy5y细胞氧化应激中的作用硕士研究生：李平导师：陈军副教授摘 要目的铅作为环境中广泛存在的重金属污染物，对人体神经、肾脏、内分泌、免 疫、全身血液等各系统产生毒性作用，其

8、毒性作用广泛且缺乏特异性。长时期低水 平的铅暴露对儿童智能发育和体格生长的影响更加显著。本实验研究神经细胞内nrf2 信号通路是否对铅暴露所致的氧化应激产生应答及其可能的机制。方法 本实验以人神经母细胞瘤细胞(sh-sy5y细胞)为靶细胞。设一个对照组和 三个铅染毒组-三个剂量组分别为低剂量组(5 pmol/l )、中剂量组(25 pmol/l )和高剂 量组(125 pmol/l ) 对体外生长的sh-sy5y细胞进行染毒。通过2穿二氯荧光黄双乙 酸盐(2,7,-dichlorofluorescin diacetate - dcfh-da )荧光探针检测染毒 2 h 后细胞内 活性氧(rea

9、etive oxygen species - ros )含量；通过二硫代双硝基苯甲酸(dithiothymine double-nitrobenzonic acid dtnb )比色法检测染毒 24 h 后细胞内谷胱 甘肽(glutathione * gsh )含量;通过蛋白印迹(western blot)法检测细胞中蛋白激酶 c-6 ( protein kinase c-6 - pkc-6 )、酪氨酸激酶 2 ( casein kinase 2 * ckd )的表达水平 以及胞浆和胞核中核因子 e2 相尖因子 2( nuclear factor erythroid 2-related fac

10、tor 2 nrf2 ) 的表达水平。结果细胞内ros含量按对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组顺序表现出逐 渐增加的趋势与对照组相比-中剂量组和高剂量组表现出明显增高且差异有统计 学差异(衣0.05)；而gsh含量则表现出逐渐降低的趋势，与对照组相比各染毒组 细胞内gsh含量均表现为显著降低(氏0.05)。与对照组相比，染毒组胞浆中nrf2蛋白表达明显降低，差异有统计学意义 (r0.05 )，而各染毒组之间的差异不明显；与对照组相比，高剂量组细胞胞核中 nrf2 蛋白表达明显增高，差异有统计学意义(/k0.05 )，而低剂量组和中剂量组与对照组相 比胞核中nrf2蛋白表达无明显差异。高剂量组

11、细胞染毒6h、12h和24h后，胞浆中nrf2蛋白表达均明显降低，与对照 组相比差异有统计学意义（圧0.05 ）。而胞核nrf2表达中仅有染毒24h后呈现明显增 高差异有统计学意义（7k0.05），而染毒6h和染毒12h后胞核nrf2表达与对照组的 差异并不明显。与对照组相出，染毒组细胞pkc-6蛋白表达明显升高且差异有统计学意义 （r0.05 ），各染毒组之间的差异却并不明显；与对照组相比，高剂量组细胞ckii蛋 白表达明显增高，差异有统计学意义（r0.05 ），而低剂量组和中剂量组与对照组相比表 达无明显差异。结论铅激发神经细胞的氧化应激反应，同时激活细胞胞浆中nrf2转移入核内进 而发挥

12、抗氧化作用抵抗氧化损伤。另外本实验提示蛋白激酶pkc-6、ckii在铅致 nrf2激活过程中具有一定作用。尖键词：铅；人神经母细胞瘤细胞；活性氧；谷胱甘肽；核因子e2相尖因子2 ; 蛋白激kc-6 ;酪氨酸激醃2the role of nrf2 signal pathw町 in lead induced oxidativestress in sh-sy5y cellsauthor: ping litutor: ass.prol jun chenabstractobjective lead, a heavy metal environmental pollutant exisiting wide

13、ly, has an extensive and non-specific toxicity to human body and systems, such as the blood system, the immune system, the nervous system, the endocrine system and the kidney. as to the children, lead can hinder intellectual development and physical growth apparently after a long-time and low-level

14、exposure of lead. the purpose of the research is to investigate the role of nrf2 signal pathway in lead induced oxidative stress in sh-sy5y cells as well as the possible mechanism underlinedmethods the sh-sy5y cells was used as target cells which were treated with 0, 5, 25 and 125 pmol/l lead acetat

15、e exposure after harvesting the cells, the levels of ros were measured by the method of dcfh-da, and gsh were tested by dtnb method. western blot was used to detect the levels of pkc-6、cku and nrf2 (cytoplasm and nucleus).results the level of ros shows an increased tendency while the level of gsh a

16、decreased tendency as a result of lead increasing. compared with the control group the level of ros were obviously increased in the middle and high dose group (/k0.05 ) , while the level of gsh of all exposure groups were significant decreased (r0.05 )compared with the control group the protein expr

17、ession levels of nrf2 in cytoplasm were significantly decreased； ro.05 ), but no statistically significant difference can be found among the exposure groups meanwhile the protein expression levels of nrf2 in the nuclear of the high dose group shows a distinet elevatation, which was remarkbly differe

18、nt from the control group (/k0.05 ). and there are no significant differenee among other groups.among the high dose group, compared with the control group, the protein expresssion levels of nrf2 in the cytoplasm were remarkbly decreased( /k0.05 ). on the other hand, only the protein expresssion leve

19、ls of nrf2 in the nuclear of cells exposed for 24 h can show an significantdifferenee (bc0.05 ).compared with the control group，the protein expression levels of pkc-6 were significantly increased r0.05). compared with the control group no obviously significant increase in the protein expression leve

20、ls of ckiiwas observed in the exposure groups, except for the highest concentration of 125 pmol/l of lead (/k0.05 )conclusion these findings demonstrate that lead can induce a nuclear accumulation of the transcription factor nrf2, which indicates the mediation of nrf2 in the cellular response agains

21、t the oxidative stress caused by lead we have also shown that pkc-6 and ckiimight play certain role in the nrf2 activation through the increasing expression levels of these two proteins stimulated by lead.key words: lead; sh-sy5y cells; ros; gsh; nrf2; pkc-6; ckh月i s铅作为环境中广泛存在的重金属污染物-其毒性作用广泛且缺乏特异性可对

22、全 身血液、神经、肾脏、内分泌和免疫等各系统产生毒性作用。环境中铅暴露一般为慢 性低水平暴露其过程隐匿不容易发觉。对儿童而言铅暴露可引起智能发育障碍和 体格生长迟缓，尤其在生长发育尖键时期造成损害其后果将是无法弥补的。全世界每 年消耗铅量约为400万吨，其中仅有约1/4回收利用其余大部分以不同形式污染环境。 铅污染来源广泛，主要来自汽车废气和冶炼、制造以及使用铅制品的工矿企业。进入 体内的铅有9095%形成难溶性的磷酸铅，沉积于骨骼当中。以往研究认为铅主要是 损害骨髓造血系统和神经系统，近年来发现铅对各种软组织均有不同程度的毒性效应。流 行病学资料表明慢性低水平的铅暴露不但影响儿童的智力发育还

23、影响行为能力 和听觉等多方面的神经系统发育过程其影响长远而严重。综合现有研究结果铅的 神经毒性作用机制与以下几方面因素有尖孵】：(1 )谷氨酸兴奋性毒性和n甲基d天 冬氨酸(n-methyl-d-aspartate * nmda )受体改变;(2 ) pkc的激活和钙通道的抑制;(3 )铅可增加诱导长时程增强(long term potentiation ltp )的阈值使诱导产生的 ltp幅度下降和持续时间缩短，从而影响学习记忆功能；(4 )ros的生成和dna损伤；(5 )神经细胞凋亡。以上几方面机制存在着相互交叉和尖联，更是体现了铅神经毒作用的复 杂性。研究表明，铅可致发育中和成年大鼠海

24、马和大脑皮层神经元的细胞凋亡【34体外 试验也发现铅所致的包括星形胶质细胞海马神经元细胞和神经母细胞瘤等在内的多种 神经来源细胞的凋亡发生。铅暴露所致神经细胞凋亡是铅神经毒性的重要表现之一，特 别是对于正处于发育中的中枢神经系统而言，异常增加的细胞凋亡不可避免地会对脑正 常结构和功能带来不可逆转的严重损伤。但迄今为止，对于铅所致包括神经细胞凋亡在 内的神经毒性作用的确切机制以及可能的干预位点仍未完全明了。人类疾病大都是环境 与机体交互作用的结果。环境因素对机体的作用表现在各个不同水平的损伤效应从基 因、蛋白质到细胞、组织结构损伤和功能紊乱。而机体在对抗环境因素的作用方面表现 为机体防御功能的增

25、强如环境化学物的代谢解毒、抗氧化、dna和细胞损伤的修复、细胞周期的核查控制以及机体免疫功能的增强。在众多机体防御机制当中，nrf2信号通路是其中非常重要的一项防御系统。nrf2是具有碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper bzip )结构的转录因子cap 'n' collar 家族的员。与nrf2对应的顺式转录调控元件是位于某些基因匡动子区域的抗氧化反应元件(antioxidant response element are )。在正常情况下 kelch样环氧氯丙烷相尖蛋白1 (kelch-like ech-associated protein-1 keapl

26、 )作为 nrf2 的负调控因子与 nrf2 结合- 同时又与肌动蛋白细胞骨架结合被锚定于胞浆，并驱动nrf2经泛素蛋白酶小体水解。在 氧化应激源和外源性有毒物质刺激下，经相尖蛋白激酶如pkc或ckii介导，nrf2 被磷酸化并与keapl解离后进入细胞核。在核内nrf2与小分子蛋白maf形成异源二聚 体并与下游基因肓动子上的are结合，从而激活多种基因的转录。已经发现的受nrf2 调控的基因产物有两类，一类是ii相代谢解毒酶类如谷胱甘肽s转移酶(glutathione-s-transferases，gsts )和 nad(p)h:苯醍氧化还原酶nad(p)h:quinine oxidored

27、uctase 1 nqo1;另一类是抗氧化酶如血红素加氧酶1 ( hemeoxygenase 1 h0-1 )、谷氨酰半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit gclc )° 这两类基因产物的功能与解毒和抗氧化密切相尖从而对细胞产生保护作用以对抗外源 刺激所产生的细胞不良效应。研究发现，在多种组织和器官中*nrf2信号系统均可通过上调are驱动基因或者 是某些细胞特异性基因的表达对抗多种外源化合物所引起的氧化应激和其他毒性效 应。对于铅这种神经毒物而言，它对nrf2信号系统的影响怎样？换言之，在铅神经 毒作用过程中，nrf

28、2是否能对铅毒性产生应答？到目前为止，几乎没有直接相尖的研 究报道，因此，这个问题迄今仍不清楚。不过，已有的一些研究结果和证据表明，铅 与nrf2信号系统是有明显尖联的。首先，已有研究发现，镉和鉛均能降低胞浆中的 nrf2经泛素蛋白酶小体的水解而导致nrf2的活化，并进入核内启动下游基因转录&创。 与镉和铸同为重金属的铅对nrf2的转录活性有怎样的影响仍不明了，值得进行开拓性 研究加以揭示。其次，无论是在体内还是体外条件下，铅被证实能够引起细胞内ros 水平升高何-而ros虽然不是导致nrf2活化的充分必要条件，但在很多情形下是其 活化的因素之一m。再次研究表明铅可影响某些基因的表达水

29、平，例如，铅可诱导 hepa1c1c7细胞nqo1 mrna水平升高问;急性铅染毒导致大鼠肾脏hcm mrna水氣化应激外来化学物平上升数倍g;大鼠染铅后，小脑、海马、大脑皮层和脑干等脑区均出现gst活性上 升网。上述基因有一个共同特征 > 即如前所述都是受nrf2调控的下游基因。因此，这 些证据强烈提示铅与nrf2信号系统的尖联。nrctkeapl sh sh解板应 免疫反应dna损伤條复 awss龄发育sh-sysy细胞是人神经母细胞瘤细胞株，呈锥形而且具有明显的轴突，是一种分化 程度较低的肿瘤细胞。该细胞繁殖快细胞形态、生理和生化功能与正常神经细胞 相似。sh-sysy细胞具有多巴

30、胺b轻基酶、乙酰胆碱酯酶、谷氨酸脫浚酶以及酪氨酸激 醜活性表面有许多受体如&阿片受体、c評通道、腺苗受体、毒蕈碱m3受体、缓 激肽b2受体和5轻色胺受体等，参与细胞生理功能，能广泛应用于包括神经细胞凋亡、 神经细胞氧化应激等神经系统退行性病变的发病机制和防治措施的研究中，是国际上 目前研究神经细胞功能较好的一种细胞模型【。本实验以sh-sy5y细胞为靶细胞采用体外染毒sh-sy5丫细胞的方法，选择氧 化应激的最直接指标ros作为氧化应激指标，另外选择主要抗氧化物质还原性gsh 作为氧化应激指标。用western blot技术检测细胞胞浆及胞核中nrf2蛋白表达水平变 化来观察铅所致sh

31、-sy5丫细胞氧化应激反应同时用western blot方法检测细胞中蛋 白激酶pkc-6和ckii表达水平变化来探讨铅致nrf2氧化应激信号通路激活的可能 机制。材料与方法1材料sh-sy5y细胞株：王爰国教授惠赠醋酸铅：美国sigma公司蛋白酶抑制剂：美国罗氏公司二甲基亚砚(dimathyl sulfoxide dmso ):美国 amresco 公司高糖型改良的 eagle 培养基(dulbecco's modified eagle' medium «dmem ):美国 gibco 公司胎牛血清(fetal bovine serum，fbs ):美国gibco公

32、司胰蛋白酶：美国gibco公司dcfh-da :美国sigma公司微量还原性谷胱甘肽(gsh )试剂盒：南京建成生物研究所bca蛋白浓度测定试剂盒：江苏海门碧云天生物技术研究所western及ip细胞裂解液：江苏海门碧云天生物技术研究所supersignal west pico化学发光底物试剂盒：美国thermo公司nrf2兔抗人单克隆抗体：美国santacruz公司pkc-6兔抗人单克隆抗体：美国santa cruz公司ckii羊抗人单克隆抗体：美国santa cruz公司甘油醛3磷酸脫氢酶(glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase - gapdh )

33、小鼠抗人 单克隆抗体：北京中杉金桥公司辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase - hrp )标记的 羊抗兔抗体：武汉博士德生物工程有限公司hrp 标记的兔抗羊抗体：武汉博士德生物工程有限公司hrp 标记的羊抗小鼠抗体：武汉博士德生物工程有限公司其他试剂：均为国产分析纯2主要仪器与设备细胞培养瓶：美国greiner公司96孔细胞培养板：美国costar公司mc0-15ac型细胞培养箱：日本sanyo公司ckx41型倒置显微镜：日本olympus公司yx4000ih型全自动控制立式电热蒸汽消毒器：上海三申公司model680型酶标仪：美国bio-rad公司mini p4型电泳仪

34、：北京凯元信瑞仪器有限公司超净工作台：苏州净化设备有限公司delta320-s型ph计：瑞士mettlertoledo公司恒温振荡培养箱：哈尔滨东联电子技术开发有限公司台式低速离心机：上海手术器械厂tgl-16g 型高速台式冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂5804r型低温高速离心机：德国eppendorf公司恒温水浴箱：北京医疗设备厂水平摇床：江苏海门其林贝尔仪器制造公司干式恒温器：江苏海门其林贝尔仪器制造公司gene-gnome hr 55000型荧光化学发光凝胶分析系统：美国synoptics公司移液 器：德国eppendorf公司自动加样器:德国eppendorf公司电加热搅拌器：江苏江阴

35、科研器械厂过滤器：美国millipore公司电子天平：德国satorius公司3主要试剂的配制3.1 磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，pbs )的配制(ph7.2 )称取 0.2 g kci、8.0 g naci，0.2 g kh2po4 3.5 g na2hpo4*12h2o，加 900 ml 蒸帼水搅拌溶解定容至1 l。用1 mol/l的naoh溶液或1 mol/l盐酸溶液调节ph至7.2 分装后高压蒸汽灭菌 4°c保存备用。3.2 hanks 平衡盐溶液（hanks balanced salt solution hbss ）的配制（ph7.2

36、）称取 0.4 g kci 0.054 g kh2po4 0.11 g na2hpo4-12h2o * 0.35 g nahco3 0.19 g caci2-2h2o，0.10 g mgci2-6h2o，0.15 g mgso4*7h2o，8.01 g naci，1 g d葡萄糖，加 900 ml蒸f留水搅拌溶解定容至1 l。用1 mol/l的naoh溶液或1 mol/l盐酸溶液调 节ph至7.2。用滤器（0.22 pm ）于超净台中过滤灭菌，分装，保存于4°c。3.3 0.25%胰蛋白酶的配制称取0.25 g胰蛋白酶粉末，加灭菌后的pbs溶液搅拌溶解，定容至100 ml。用滤 器（

37、0.22 pm ）于超净台中过滤灭菌，分装， 20°c保存备用。3.4 dmem的配制将dmem干粉溶于900 ml蒸憎水中da 1.8g nahco3，定容至1l。用1 mol/l 的naoh溶液或1 mol/l盐酸溶液调节ph至6.8左右。用滤器（0.22 pm ）于超净台中 过滤灭菌，分装，4°c保存备用。临用前加10%fbs，1%青/链霉素，混勻成完全培养基。3.5 醋酸铅储存液的配制（10 mmol/l ）称取0.325g醋酸铅，加蒸憎水搅拌溶解，定容至100ml。用滤器（0.22pm）于 超净台中过滤灭菌，分装，4°c保存备用。临用前用培养基稀释成不同

38、浓度的醋酸铅染 毒 应用液。4 sh-sy5y细胞的培养、染毒和收获4.1 sh-sy5y细胞的培养将王爱国教授馈赠的sh-sy5y细胞接种于高糖型dmem培养液中（含10%fbs 1 %青/链霉素），于37°c、5%co2培养箱培养，在sh-sy5y细胞処于生长对数期时 弃去陈旧培养基，用hbss液洗涤2次，用0.25%胰蛋白酶消化，计数调整细 胞浓度为1.5x104个/ml，加入新鲜的dmem（含10%fbs青/链霉素），置于37°c、 5%co2培养箱继续培养。23天传代一次，使细胞保持在生长对数期。4.2 细胞染毒及分组処理细胞培养48 h后，弃去旧培养基用pbs液

39、洗涤2次后按不同剂量分组染毒。实 验分为4组：低剂量组用5 pmol/l醋酸铅溶液染毒、中剂量组用25 pmol/l醋酸铅溶 液染毒、高剂量组用125|jmol/l醋酸铅溶液染毒以及继续用完全培养基培养的未染毒 的对照组。4.3细胞收获醋酸铅对细胞染毒24 h后，弃去染毒液用pbs液轻柔洗涤细胞2次，用0.25% 胰蛋白酶消化12min后加等量胎牛血清终止消化，加入适量pbs液轻柔吹打细胞成 细胞悬液，1000r/min，离心5min，收获细胞于ep管中。5细胞内活性氧(ros )的检测口5.1基本原理本实验的荧光探针二氯荧光黄双乙酸盐(27-dichlorofluorescin diacet

40、ate， dcfh-da )可以自由的穿透细胞膜的脂质双分子层从而进入到细胞。在细胞内酯酶的 作用下发生酯键的断裂生成h2dcf。h2dcf具有相对极性不能穿透细胞膜蓄积 于细胞内。随之便可被ros氧化生成高度荧光产物dcf。dcf可被485nm左右波长 的光激发在约525nm波长处发射出荧光。通过测定荧光强度即可检测出细胞内ros 含量。而荧光探针dcfh-da也被认为是当今检测ros最为敏感和可靠的方法之一。 5.2相尖试剂的配制5.2.1 dcfhda储备液(50mmol/l )取 dcfh-da 50 mg 溶解于 2 mldmso 中配置成 50 mmol/l 的 dcfh-da 储

41、备 液20°c避光储存备用。5.2.2 dcfh-da应用液(10pmol/l )取dcfh-da储备液15|jl，加入14.985 mlpbs缓冲液，即终浓度lopmol/l的 dcfh-da应用液现配现用。5.3细胞接种将処于对数期生长的sh-sy5y细胞去除旧的培养液用hbss液轻柔洗涤2次后， 加入0.25%的胰蛋白酶消化12 mirr待细胞变圆变钝后用新鲜dmem吹打细胞成悬 液。细胞计数后，接种于96孔细胞培养板，1j04个/孔补加培养基至200 pl 96 孔细胞培养板周围孔用pbs填充，于37°c、5%c0?细胞培养箱中培养12 h至细胞贴壁o5.4细胞染毒

42、吸去正常培养基，用pbs轻柔冲洗1次，依次加入200 pl不同浓度的铅染毒培养 基，各剂量组均设置6个平行样-放置于37°c、5%co2细胞培养箱染毒2h。5.5孵育探针吸弃染毒液用pbs轻柔冲洗1次，加入200 pl dcfh-da应用液（10 pmol/l ） 放置于37°c、5%co2细胞培养箱，避光静置30 min。5.6检测于激发波长485nm 逸出波长525nm检测各孔荧光强度。只加pbs的孔设置为 空白孔各孔荧光强度分别扣除空白孔荧光强度即为染毒2 h后细胞内ros含量。 6细胞内还原性谷胱甘肽（gsh ）的测定6.1基本原理还原性谷胱甘肽（gsh ）可与二硫

43、代二硝基苯甲酸（dtnb ）反应生成一种黄色化 合物可在405nm下进行比色定量测定还原性谷胱甘肽（gsh ）含量。6.2细胞染毒（同上）6.3细胞收获（同上）6.4上清液制备取收获的细胞加入0.3 0.5 mlpbs悬浮细胞超声或手动研磨破碎细胞后待测。 取破碎后的细胞悬液0.1 ml，加0.1 ml试剂一混匀*3500-4000转/min 离心10 min， 取上清液待测。6.5标准系列配制取一定量的1 mmol/lgsh标准品用pbs稀释成不同浓度的gsh标准系列：100pmol/l、50pmol/l、20pmol/l、10pmol/l、5pmol/l、opmol/l。6.6显色反应依照

44、顺序对应分别加入100 |jl各个浓度标准品和待测样品于96孔板的空白孔中， 设置6个平行样分别标记标准品和样本编号。在上述孔中分别加入100 pl试剂二、 25 pl试剂三轻轻摇动孔板，静置5 min °于405 nm波长下用酶标仪测定吸光度值(30 min内完成比色)。6.7浓度测定用标准曲线确定所得样本溶液的gsh浓度将所得样本溶液的gsh浓度除以其 样本的总蛋白含量对结果进行校正。7蛋白质表达水平的检测用western blot方法检测nrf2、pkc-5和cki蛋白的表达，方法如下:7.1相尖试剂的配制：7.1.1母液的配制：(1 ) 1.0mol/ltris-hci 的配

45、制称取三轻甲基氨基甲烷盐(trihydroxymethyl aminomethane base，tris base ) 30.29 g溶解于200 ml蒸憎水中，于通风橱内用浓盐酸调ph至所需点，最后用蒸馅水定容至 250 ml，高温灭菌后室温下保存。(2) 1.5 mol/ltris-hci 的配制(ph8.8 )称取tris base 45.43 g溶解于200 ml蒸丫留水中于通风橱内用浓盐酸调ph至8.8， 最后用蒸馆水定容至250 ml，高温灭菌后室温下保存。(3 ) 0.5mol/l tris-hci 的配制(ph6.8 )称取tris base 15.14g溶解于200 ml蒸f

46、留水中于通风橱内用浓盐酸调ph至6.8 最后用蒸馆水定容至250 ml，高温灭菌后室温下保存。(4 ) 1.74mg/ml( 10mmol/l )苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，pmsf )的 配制称取pmsf 0.174 g溶解于100 ml异丙醇中，分装， 20°c保存。(5 )100 mmol/l 二硫苏糖醇(dithiothreitol dtt )的配制称取dtt0.0154g 充分溶解于1 ml蒸丫留水中，即配制成100mmol/ldtt。20°c 保存。(6 ) 10%十二烷基磺酸钠(sodium dodeeyl su

47、lfonates sds )的配制称取sds 10 g 加蒸f留水定容至100 ml，50°c水浴中溶解后室温保存。(7) 10%过硫酸钱的配制称取过硫酸镀0.1 g，用1.0 ml超纯水溶解后4°c保存，保存时间为1周。(8 ) 30%丙烯酰胺的配制称取丙烯酰胺29 g，甲叉双丙烯酰胺1 g，加入60 ml蒸憎水充分搅拌溶解，定容 至100ml 滤去杂质后于棕色瓶中4°c保存。(9) 20%tween20 的配制量取20 ml tween20 加蒸憎水定容至100 ml，混勻后保存于4°c。7.1.2使用液的配制(1 ) 0.15mol/lnaci 溶

48、液的配制称取naci 0.877 g，加蒸馆水定容至100 ml，高温灭菌后，室温保存。(2 ) 100 mg/ml 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa )的配制称取 bsa 0.1 g 溶解于 1.0 ml 0.15 mol/l naci 溶液中，-20°c保存 0.5 mg/ml bsa 可用 0.15 mol/l naci 溶液将 100 mg/ml bsa 稀释 200 倍-20°c保存。(3 )胞浆蛋白裂解液(a液)及胞核蛋白裂解液(b液)的配制称取 4羟乙基哌嗪乙磺酸4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineeth

49、anesulfonic acid，hepes 0.2383 g，kci 0.0745 g edta-na20.0336 g，溶解于 80 ml 蒸馅水中，用 naoh 溶液调ph至8.0，加蒸馅水定容至100 ml，此为胞浆蛋白裂解液(a液)。称取hepes 0.4766 g，naci 2.475 g edta-na20.0336 g，溶解于 80 ml 蒸催水中，用 naoh 溶液 调ph至8.0，加蒸憾水定容至100 ml，此为胞核蛋白裂解液(b液)。4工保存。于使 用前加入dtt和蛋白酶抑制剂，使其最终浓度分别达到1 mmol/l和10% (v/v)。(4 ) 4xtris-ci/sds

50、 的配制(ph6.8 )称取tris base 6.05 g溶解于90 ml蒸丫留水中用1 mol/l盐酸调ph至6.8 -加蒸馆 水定容至100 ml 用0.45 pm滤膜过滤溶液再加入0.4 g sds0.4%(w/v) 于4°c可 保存1月。(5 ) 6xsds-page上样缓冲液的配制量取 4xtris-ci/sds( ph6.8 )7 ml，甘油 3 ml，混勻后，加入 1 g sds -0.93 g dtt 1.2 mg漠酚蓝溶解后定容至10 ml 4°c保存。(6 ) 5xsds-page电泳缓冲液的配制称取tris base 15.1 g 甘氨酸94 g 量

51、取50 ml10%sds -加入约900 ml蒸憎水 充分搅拌溶解，定容至1 l，室温保存。电泳时，量取100ml5xsds-page电泳缓冲 液加入400 ml蒸憎水可得到5电泳缓冲液。(7) 1 xtris 甘氨酸转移缓冲液的配制称取tris base 3.0 g，甘氨酸14.4 g，量取200 ml甲醇，加入约700 ml蒸f留水充 分搅拌溶解定容至1 l 临用前配制，4°c保存可回收利用1次。(8 ) tris-hci 缓冲盐溶液(tris-hci buffer solution，tbs )的配制称取 naci 8.8 g 量取 10 ml 1.0 mol/l tris-hc

52、i ( ph7.5 )，加入约 900 ml 蒸帽水 充分搅拌溶解，定容至1 l，室温保存。(9) tbst缓冲液的配制量取700 mltbs缓冲液-1.65 ml20% tween20，混匀后即可使用，临用前配制,现 配现用。(10) 封闭液(含5%脱脂奶粉的tbst缓冲液)的配制称取脫脂奶粉1 g，溶解于20 ml tbst缓冲液中，混匀后即可使用，临用前配制， 现配现用。(11 ) sds-page浓缩胶的配制(5% )取 3.4 ml 蒸f留水，0.83 ml30%丙烯酰胺 0.63 ml1.0 mol/l tris-hci( ph6.8 ) >0.05 ml 10%sds -0

53、.05 ml 10%过硫酸镀0005 mltemed，混勻后即可，避免产生气泡 临用前配制。(12) sds-page分离胶的配制(10% )取 5.9 ml 蒸 f 留水，5.0 ml 30% 丙烯酰胺 3.8 ml 1.5 mol/l tris-hci ( ph8.8 )>0.15 ml 10%sds *0.15 ml 10%过硫酸镀-0.006 ml temed，混勻后即可，避免产生气泡， 临用前配制。7.2收获细胞、裂解细胞及蛋白质定量7.2.1细胞收获(同上)7.2.2提取总蛋白、胞浆蛋白及胞核蛋白提取总蛋白融化westem及ip细胞裂解液(江苏海门碧云天生物技术

54、研究所)混勻。取适量 的裂解液于使用前加入pmsf，使pmsf的最终浓度为1 rnrriol/l。将收获得到的细胞加 入预冷的上述细胞裂解液约0.5ml，于冰上悬浮混勻裂解30 45min。4弋*10000转 /min 离心10min 上清即为细胞总蛋白样品°7.222提取胞浆蛋白及胞核蛋白融化dtt及蛋白酶抑制剂，取适量a液及b液，于使用前分别加入dtt及蛋白 酶抑制剂，使dtt最终浓度为1 mmol/l，蛋白酶抑制剂最终浓度为10% ( v/v )。将收 获细胞加入预冷的a液0.5 ml，于冰上充分混勻裂解约30 min。4°c * 14000转/min， 离心10 m

55、in，取上清即为胞浆蛋白样品。离心后的沉淀物中加入b液0.1 ml 冰上重 悬混勻裂解约30min °4°c 12000转/min，离心10min，再得上清即为胞核蛋白样品。 7.2.3蛋白质定量按bca蛋白质定量试剂盒说明书(江苏海门碧云天生物技术研究所)所述方法进 行：(1 )将bca蛋白质定量试剂盒中的试剂a和试剂b按50:1比例配制成bcat作液 充分混勻(室温下可保存24h);(2)溶解100mg/ml蛋白质标准品bsa，取适量用0.15 mol/lnaci溶液稀释200倍使 最终浓度为0.5mg/ml ;(3 )将稀释后的标准品溶液按0,l,2,4,8,12,1

56、6,20 pl加到96孔板的标准品 孔中，加标准品稀释液到20 pl ；(4 )取待测样品适量稀释一定倍数取20 pl加到96孔板中标准品孔和样品孔均 设置一个复孔；(5 )各孔加入200 plbca工作液 37°c 静置30 min。(6 )酶标仪于562nm波长处测定各孔吸光度，根据标准曲线计算样品的蛋白质浓度。 7.3蛋白质样品処理用pbs调整蛋白质浓度至一致，将蛋白质样品溶液与6xsds-page上样缓冲液按 1:5比例充分混勻 95100°c变性10 min，4°c保存备用。7.4电泳7.4.1制胶将一厚一薄两块干燥洁净的玻璃平板和灌胶胶垫组装成灌胶装置

57、固定于制胶支架 上。按前述要求配制分离胶-混勻立即用吸管将分离胶沿两波板夹层一侧边缘缓缓加 入至玻璃平板夹层中至凝胶距样品梳下缘约1cm左右。加入凝胶时务必平稳以防止 其与空气混合。立即以蒸憎水覆盖凝胶表面静置30 45 min待凝胶聚合缓缓倒出 顶层覆盖的蒸憎水并用吸水纸尽量吸干凝胶上部的水。按前述要求配制浓缩胶，混合 均勻后用吸管沿夹层一侧缓缓加入直至与短波板平齐。将样品梳插入夹层的浓缩胶中 直至背脊与短波板对齐，放置30-45 min使浓缩胶聚合。轻轻取出梳子并以蒸t留水或 缓冲液彻底清洗凝胶表面。7.4.2上样将凝胶三明治板以短波板向内方式放置于凝胶支撑架上，小心将绿色夹胶框夹合 拢在胶板上，使其锁定到位。向组件（上极槽）中注入电泳缓冲液直至外玻璃板上 沿之下，使电泳缓冲液淹没凝胶的加样孔。将变性后的蛋白质样品用加样枪加入至样 品孔中，对照孔加人蛋白质分子量标准样品，空置的加样孔则加等体积的1xsds-page± 样缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散，最边缘的孔建议最好不加样品以防止边缘效 应。再往上