分子生物学实验理论及操作答案

1、实验答案1、 基本原理题1、 限制性内切酶有那些特点？能识别双链分子的某种特定核苷酸序列使每条DNA链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开2、限制性内切酶有那些类型，我们DNA重组时常用的是哪类？答：限制性内切酶主要分成三大类。第一类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中没有多大用处，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。第二类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割

2、的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合DNA分子。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、9个、10个和11个核苷酸的。第二类限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式。一是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。第三类限制性内切酶也有专一的识别顺序

3、，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。这对于克隆基因或克隆DNA片段没有多大用处。3、 何为细菌的限制修饰系统？是一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可保护个体免于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统，主要有限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。细菌的限制修饰系统包含三个连锁基因：（1）hsd R：编码限制性核酸内切酶（2）hsd M：编码限制性甲基化酶（3）hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达大多数限制性内切酶常常伴随有12种修饰酶（DNA甲基化酶），

4、后者能保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏。修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同，它们的作用是甲基化每条链中的一个碱基，而不是切开DNA链。甲基化所形成的甲基基团能伸入到限制性内切酶识别位点的双螺旋大沟中，阻碍限制性内切酶发挥作用。这样，限制性内切酶和它的“搭档”修饰酶一起组成R-M系统。在某些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，它们各自独立行使自己的功能；另一些R-M系统本身就是一种大的限制-修饰复合酶，由不同亚基或同一种亚基的不同结构域来分别执行限制或修饰的功能。4、 说说热激转化法和电击转化法的区别。电击法：使用瞬时高压电（数千伏特）处理细胞悬液，微生物细胞膜在高

5、压电的作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的孔洞进入细胞内部。化学法：使用低渗溶液处理细胞悬液（0.1M CaCl2），微生物细胞膜结构会发生一些变化，使得细胞在热激时（42度90秒）变得很容易从溶液中摄取DNA。具体机理目前仍然不是十分清楚，但是很有效。做电击转化时，悬液中有近70%的细胞会因电击而死亡，但是这种方法很直接，转化效率很高。当需要高的转化效率时，比如制作基因文库，可以采用电击转化，另外，做酵母等真核生物转化时一般都是电击。化学转化法操作简单，不需要特殊设备，转化效率足以满足一般克隆实验的需要，故使用范围非常广。5、 碱裂解法提取质粒的基本原理是什么？在碱

6、性条件下，染色体DNA和质粒DNA的氢键断裂，致使宿主染色体DNA变性，但闭合环状的质粒DNA由于拓扑缠绕而不能彼此分开。当以pH 4.0的NaAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，质粒DNA迅速恢复原有的构型，重新形成超螺旋分子，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 6、 CsCl密度梯度离心的原理是什么？将质量差异微小的分子分开。用氯化铯浓盐液，以105g以上的强大离心力的作用，盐的分子被甩到离心管的底部。同时，扩散作用使溶液中Cs和Cl离子呈分散状态，与离心力的方向相反，经过长时间的离心，溶液达到一种平

7、衡状态。反向扩散力与沉降力之间的平衡作用，产生了一个连续的CsCl浓度梯度。离心管底部溶液的密度最大，上部最小。DNA分子溶于CsCl溶液中，经过离心，将逐渐集中在一条狭窄的带上。带上的DNA分子密度与该处CsCl相等。7、质粒载体具备的基本要素是什么？是染色质外的双链共价闭合环形DNA、能自主复制，是能独立复制的复制子、质粒对宿主生存并不是必需的。必须包括三部分：遗传标记基因，复制区，目的基因。8、 质粒图谱上的MCS指的是什么？MCS多克隆位点（multiple cloning site）:是包含多个（最多20个）限制性酶切位点（restriction site）的一段很短的DNA序列。也

8、称为多位点接头（polylinker），是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列.MCS中，每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。9、 按拷贝数，质粒有哪些基本类型？我们使用的pUC19和pBS属于哪种类型？高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。适合大量增殖克隆基因，或需要大量表达的基因产物。低拷贝数的质粒载体由 pSC101派生来的载体特点是分子量小的拷贝数。它有特殊的用途：当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌的死亡时，就需要低拷贝的载体。pUC19载体,高达500700个以高效克隆的pB

9、S-T为载体,其目的基因拷贝数可等同pUC19载体,高达500700个10、 氯霉素提高质粒拷贝数的原理是什么？氯霉素是一种蛋白质合成抑制剂，能够抑制染色体的复制，而不影响质粒pBR322的复制。这样经过氯霉素处理使得细胞内pBR322得到高拷贝。11、 蓝白斑筛选的基本原理是什么？蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖

10、苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补。由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37温箱倒置

11、培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。12、 作为受体的大肠杆菌应该具有什么特性？遗传背景清楚 ;目标基因表达水平高;表达系统成熟完善;易于培养（培养方法简单、生长快、培养周期短、抗污染能力强）、成本低;被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。缺点：表达产物缺少饭以后的修饰（如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等）；同时高表达时易折叠错误导致表达产物没有活性，而且大肠杆菌本身含有内毒素和有毒蛋白，可能混在产物里，应用受限。真核基因在大肠杆菌中表达：1，真核生物的启动子不能被原核细胞（大肠杆菌）的RNA聚合酶识别；2，真核生物的mRNA上没有SD序列，因此不能被原核细胞

12、核糖体结合；3，真核生物的基因含有内含子，原核细胞缺乏见他们的转录物进行拼接加工的机制；4，真核细胞的基因产物，往往需要翻译后加工，真核细胞缺乏翻译后加工有关的酶；5，真核生物基因表达的蛋白质易被原核细胞蛋白酶所降解。13、 转化的概念，转化有哪些方法？转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。该现象首先发现于细菌。质粒转化方法主要有：高压电穿孔法转化大肠杆菌（电转化法），氯化钙法制备感受态细胞的大肠杆菌转化法14、 CaCl2制备感受态细胞的基本原理？目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2

13、处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。转化效率可达106107转化子/微克DNA。本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在低温下进行。15、 热激转化法的基本原理是什么？其原理是细菌处于0，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，

14、球状细胞复原并分裂增值。被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。16、 影响感受态细胞效率的因素有哪些？1细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 × 107/ml ）；2所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3经 CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加， 24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属

15、离子（如 Mn2+或 Co2+）、 DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍）；5所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 DNA ；7一定范围内，转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比；17、 利用分光光度计测定DNA浓度的基本原理是什么？1OD值相当于多大浓度的双链DNA？单链DNA？单链RNA？DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸 收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。

16、对标准样品来说，浓度为1g / ml时，DNA钠盐的OD2600.02当OD2601时， dsDNA浓度约为50g / ml ssDNA浓度约为37g / ml RNA浓度约为40g / ml寡核苷酸浓度约为30g / ml（youyu底物不同有差异）当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。 经验值：纯DNA：OD260/OD2801.8(1.9,表明有RNA污染；1。6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7 OD260/OD2802.0（1.7时表明有蛋白质

17、或酚污染；2.0时表明可能有异硫氰酸残存）若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量18、 核酸的定性测定中，OD268/OD280比值大小说明什么问题？符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。要纠正一下，纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0，样品中如果含有蛋白质及苯酚，A260/A280比值会明显下降。对于纯的样品，只要读出260nm的A值即可以算出含量。通常以A值为1相当于50微克/ml双螺旋DNA，或者40微克/ml单链DNA（RNA），或者20微

18、克/ml寡核苷酸计算。OD260OD280 1.9-2.0 RNA居多 纯度已经很高了纯DNA：OD260/OD2801.8(1.9,表明有RNA污染；1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7 OD260/OD2802.0（1.7时表明有蛋白质或酚污染；2.0时表明可能有异硫氰酸残存）OD是optical density（光密度）的缩写， OD1og（1trans），其中trans为检测物的透光值。 吸光度 吸光度,absorbance,是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度 与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等 吸光系数与入射光的波长以

19、及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。 当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。吸光度用A表示， Aabc，其中a为吸光系数，单位L/(gcm),b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm ，c为溶液浓度，单位g/L 影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量，温度通过影响c，而影响A。一般来说OD260代表核酸的吸光度,OD280代表蛋白质的吸光度,OD230代表其他杂质(多糖等)的吸光度。 A260/A280与OD260/OD280的意思是一样的。A代表吸光值，而OD是

20、光密度值，一个意思。A260/280比值一度成为判断核酸纯度的唯一通用标准，纯的DNA一般在1.8-2.0之间；后来发现在抽提过程中使用的许多试剂影响 A260 和 A280 读数；同时，对同一样品 10 倍数量级稀释后测定吸光值发现，分光光度计的吸光值仅在一定的区域是线性的。结论是：当 A260 读数处在 0.1-0.5 之间，A200 到 A320 之间的数值构成一条光滑的曲线时，少量苯酚 (30 ul/ml) 残留使 A230，A260，A280 均变大 (差不多增加一倍)，但 A260/A280 和 A260/A230 均在 2 左右。少量异硫氰酸胍 (132 uM) 残留使 A230

21、 变大，但 A260，A280 几乎不变，所以 A260/A280 仍在 2 左右，而 A260/A230 大大低于 2。大量异硫氰酸胍 (2.4 M) 残留使 A230，A260，A280 均变大，根本就没有办法测定了。PEG (6.25%) 残留使 A230，A260，A280 均变大，但对 A230，A260 影响更大，所以 A260/A280 比 2 大不少，而 A260/A230 仍在 2 左右。核酸抽提中常用的试剂，如 Phenol，Guanidine Isothiocyanate，PEG 都能使 A260 和A280 的值变大，但是却可能使二者的比值与高纯度核酸的比值一致。因为

22、A260 值几乎是峰值，所以有必要在其两边各取一个：A280 和 A230。干净的核酸 A260/A230 应该在 2 左右。如果有在230nm处的强吸收提示污染有酚盐离子等有机化合物1.蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。3.多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD26

23、0/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。4.设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。比值低可能有蛋白污染，高了可能有DNA污染，建议你抽提的RNA分三管，两管保存，另一管用来跑胶和测定OD，跑胶是最直观的，1%的胶就可以，抽提后马上跑，一般不会降解很多，所以设备材料不需要去酶处理不会有影响的。你的od比低可能是溶解时用的水的PH值偏酸。可以试着调到8.0左右再测，这样就会上来了。1

24、9、 普通琼脂糖凝胶电泳分离DNA的范围是多少？普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb。20、 聚丙烯酰胺凝胶分离DNA的范围是多少？丙烯酰胺(%)有效分离范围(bp)溴酚兰*二甲苯青*3.510020001004605.080500652608.0604004516012.040200307015.025150156020.010100124521、 分离大片段DNA，比如50kb以上，一般采取什么形式的电泳？介绍基本原理。大分子DNA(一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb)在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而

25、才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”)，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在102000kb 之间的DNA 片段。这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE)。通过把一个在不同电场

26、方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE)设备能把大小范围在102000kb 的DNA 片段分开。FIGE也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb。22、 检测DNA时，有哪些些形式的染色方式？原理是什么，各有何特点。聚丙烯酰胺凝胶-银染、琼脂糖电泳-SYBR GreenI染色及EB染色方法银染的原理：一、银离子（一般是AgNO3)和DNA结合;二、还原剂甲醛把Ag+还原成银颗粒，最终DNA呈现为黑褐色。SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Gree

27、n I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，在紫外线激发下，未与核酸结合的溴化乙锭可被激发出橙红色萤光。在与DNA或双股RNA结合时，萤光强度会增强20倍，使得核酸电泳后的胶片可以辨识核酸的相对位置。在核酸分子中，EB分子插入到两层碱基对之间，发出红色荧光。在凝胶中加入终浓度为0.5g/ml的EB，可以在电泳过程中随时观察核酸的

28、迁移情况，这种方法使用于一般性的核酸检测。23、 PCR的基本原理是什么？包括哪三个基本步骤？PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性低温退火引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。模板DNA的变性模板DNA经加 热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成

29、为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸DNA模板-引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。24、 PCR扩增产物理论

30、上的计算公式是什么？PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。25、 何为PCR的平台效应，产生的因素包括哪些？反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。大多数情况

31、下，平台期的到来是不可避免的。26、 PCR中引物设计应该遵循哪些基本原则？一 设计引物应遵循以下原则 1 、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 2 、引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 3 、引物碱基：G C含量以40-60%为宜，G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。上下游引物的GC含量不能相差太大。附加序列(RT site,&

32、#160;Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们. 引物对的Tm差异不超过5， 设计时温度和GC含量是个主要的参数，做复合扩增时更要设计成相近的温度，而且引物加个尾影响不大。但要切记BLAST，包括查阅文献的引物.如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5, 或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。 4 、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'

33、;端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 5 、引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 6 、引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物5端引入酶切

34、位点得黏性末端，随意加入3个保护性碱基，但是要注意不要形成引物二聚体，而且以A或G开头为好。 7 、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 8 、引物酶切：除非产物非常特异，直接酶切PCR产物效果有时不是很好，还有一般PCR体系里过量的dNTPs会影响酶切效果。酶切后，可以用标准得乙醇沉淀法沉淀酶切产物，获得高纯度得酶切产物，也即是你的黏性目断片断供后边得试

35、验。 27、 说出PCR产物与T载体连接的原理。TA克隆：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。TA克隆没有方向性。28、 Gateway方法进行DNA重组的原理。Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点

36、和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。29、从制备的总RNA中分离出mRNA的方法？原理是什么？大多数真核细胞mRNA的3端通常具有由20-30个腺苷酸组成的polyA尾巴，寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（OligoT）可以与之配对结合，这就是提取mRNA最基本的原理。具体到

37、实验手段上，现在磁珠法、纤维素柱层析法都有在用。磁珠法一般是用生物素标记OligoT，亲和素标记磁珠（生物素和亲和素间具有高度亲和力）。实验时生物素标记的OligoT与mRNA的polyA高效杂交形成复合体，此复合体又与标有亲和素的磁珠结合。用磁性分离架就可以将这堆复合物分离出来。最后用无RNase去离子水将mRNA从复合物中洗脱下来即可。寡聚dT纤维素柱层析法的大致流程：总RNA流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液中，带polyA尾的mRNA被特异地结合在柱上。降低盐浓度，mRNA被洗脱。一般过两次柱后，就可得到较高纯度的mRNA。2、 实验操作1、 用含Amp的平板筛选阳性转化子，为何会出

38、现卫星菌落。培养时间太长了。2、 乙醇沉淀DNA的基本原理。乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na之类的平衡离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。3、 沉淀核酸时，加入NaAc有何作用？NaAc有助于降低DNA溶解度。4、 溶菌酶的作用是什么？它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。5、 核酸分离时用到酚、氯仿、异戊醇各有何作用？抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酞与

39、氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约1015的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互

40、溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。 6、 如果酚被氧化后，对分离核酸会有何影响？7、 实验室提取质粒DNA通常会出现几种带型，说出他们电泳行为的差别。提完的质粒有三种形式存在：超螺旋闭合环质粒，开口的闭合坏质粒，线性质粒。三者迁移速率不一样，所以会出现三条带。根据你质粒提取的好坏，出现一到三条带都属于正常。你做个酶切检测，如果酶切充分，只有两条带，目的条带和载体的条带。不过一般情况都会有一条超螺旋质粒的条带亮度更高，浓度更大，可能与marker相比你的质粒会比理论的小一点，这也是很正常的。8、 核酸提取中，为何用75乙醇洗涤沉

41、淀？9、 说出可以沉淀DNA的试剂。10、 说出RNaseA、RNaseH用途。RNase H是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。RNase A是一种被详细研究和具有广泛应用的核酸内切酶。RNase A 对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。RNase A在C端和U端残基处专一地催化RNA的核糖部分3'-与5' -磷酸二酯键的裂开，形成具有 2',3'-环磷酸衍生物寡聚核苷酸。如 pG-pG-pC-pA-pG 被切割产生pG-pG-pCp 和 A

42、-pG。可以用来去除DNA制品中的污染RNA。 它们的合成目前资料还比较少。11、 碱烈解法提质粒时，使用的溶液，即含NaOH和SDS的溶液，有何作用？溶液 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去溶液 0.2M NaOH / 1% SDS破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。12、 碱烈解法提质粒时，使用的溶液，即含KAc的溶液，有何作用？溶液 3M 醋酸钾 / 2M 醋

43、酸这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀。13、 何为限制性内切酶的星活性，产生原因有哪些？所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。所以说Star活性与粘端变平端没关系。另外，Star活性除了与酶本身的性质有关外，与甘油浓度，pH

44、值及离子浓度有关。一旦出现底物DNA不好切断，需要增加酶量或延长反应时间时，如果使用的是易产生StaR活性的限制酶切，一般优先考虑增加酶量，而不是延长反应时间，换句话说，延长时间比增加酶量更易产生Star活性。另外，实际上几乎所有的限制性内切酶都可能产生Star活性。但目前Star活性对实际实验室操作过程中的影响并不太大，可以先不考虑。星活性是特异性的限制性内切酶介导的DNA裂解，可以从这些酶的最适显着不同的反应条件下发生的松弛或改动的。其结果通常是在非规范的识别位点裂解，或有时完全丧失的特异性。这可能会导致星活性的差异包括低离子强度，pH值高，和高（> 5%体积/体积）甘油的浓度。因为

45、商业的限制性内切酶在一个缓冲器中，通常提供含有大量的甘油（50%v / v是典型的），也就是说稀释的酶溶液不足可导致星活性;此问题最经常出现在双重或多重消化。14、 使用限制性内切酶做双酶切时，工作的缓冲液如何选择？15、 DNA电泳用的上样缓冲液含哪些基本成分，作用是什么？16、 通过电泳确定未知大小的DNA片段，原理是什么？借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离。17、 如果发现琼脂糖电泳时，较大的DNA片段，如3kb以上的，不能很好分离，应该如何调整胶的浓度，为什么？分子量越小，胶的浓度越高，分子生物学的实验手册上有大致的碱基数与胶浓度的对

46、应表，查一下就可以。另外，不同的目的也对胶的浓度有影响。同样的片段，分析用的胶和分离用的胶浓度有时候会不同，一般分离胶浓度会更高些。18、 感受态细胞的制备操作过程中，重点要注意什么？控制好菌株的活力1 细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5?菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；2 所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3 经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4 化合物及无机

47、离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；5 所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比。19、 琼脂糖凝胶电泳使用的缓冲液通常为TAE何TBE，二者有什么区别？TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲

48、液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。        TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。   

49、    20、 PCR反应中包含哪些基本成分？水（构建反应体系）引物（促使dNTP结合到模板链上从而扩增）模板Taq酶（DNA聚合酶，催化形成互补链）buffer（缓冲体系）dNTP（反应物）21、 PCR的结果中出现杂带，可能的原因有哪些？提高退火温度GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。*RNA降解。*PCR管或试剂污染。注意：杂带一般是因为没有优化PCR条件，可以加入阴性对照来确定。用RT阴性对照检测是否被基因组

50、DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。*在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。*由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。22、 PCR中的引物二聚体是如何形成的，电泳中处于何位置？23、 如何能保证所制备RNA的完整性和均一性？24、 RNA制备实验中使用的胍盐的用途是什么？25、 RNA制备实验中使用的Sarcosyl的用途是什么？异硫氰酸胍酚法提取RNA的原理如下：GIT与巯基乙醇共同作

51、用抑制RNase的活性；GIT与 十二烷基肌氨酸钠 （Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库，因此为大多数人采用。与氯化铯方法比较，虽然纯度稍差一些，小分子RNA，如tRNA、snRNA不易去除，但产量高完整性好，盐易去除。26、RNA提取实验中用于控制RNase的措施有哪些？27、RNA的制备可用于哪些后续实验？28、RNA提取实验中用到的DEPC水如何制备？29、RNA的制备实验中，为何有效控制RNase是实验的关键？结合RNa

52、se的特点进行说明。30、RNA的非变性胶和变性胶电泳有何区别？31、简述Northern杂交的基本过程。32、将RNA转移至膜上，常用什么方法，原理是什么？33、实验制备的总RNA经非变性的琼脂糖凝胶电泳后，有哪些特征条带？34、如何发现所提取的总RNA是否降解，RNA发生降解的原因有哪些？35、Northern杂交中，RNA经变性电泳后转移至膜上，为使RNA与膜结合牢固，常采取什么措施？总结：生化试剂的作用原理知道原理对实验出问题时分析很有益，所以列出来一起分享！1葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合Mg2、Ca2等金属离子，抑制脱氧

53、核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。2NaOHSDS液： NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH12或pH3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。 SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-

54、R-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。 3. 3molL NaAc（pH4.8）溶液： NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3molL NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚

55、合，后者是因为钠盐与SDS蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。 4为什么用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67左右。因而也可改用95乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95乙醇昂贵）。但是加95的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解

56、，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置1530分钟即可。 5在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.10.25mol/L？在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加

57、入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。6加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。 7为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定

58、性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。 8如何选择聚乙二醇（6000）的浓度来沉淀DNA？采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1左右，小分子所需PEG浓度高达20。本实验选择性沉淀4.3kb的pBR322质粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30 PEG，其最