高效液相色谱柱使用保养标准操作规程

1、1. 液相色谱柱的使川1.1使用前注意事项：色谱柱的贮存液若无特殊说明，均为有机溶剂，反相柱當用甲醇、乙腊或者 高比例的甲醇/乙腊-水溶液，正相柱常用脱水处理后的纯正己烷。使用前，一定要注意色谱柱的贮 存液与待分析样品的流动相z间焰否互溶。有些色谱柱，既可用于止相体系，也可用于反相体系， 如色谱柱中的贮存液为止相而使用条件为反相时，必须用异丙醇先置换掉色谱林内的贮存液，然后 再川于反相条件，否则将会明显减少色谱柱的使川寿命。在反相色谱中，如果流动相屮缓冲盐的浓 度较高，必须先川低浓度的卬醇/乙腊-水溶液冲洗20min,否则缓冲盐在高浓度的有机相中很容易 析出，从而使色谱柱堵塞，无法恢复。1.2

2、色谱柱使用方向，装色谱柱时应使流动相流路的方向与色谱柱标签上箭头所示方向一致。除另 有规定外，不宜反向使用，否则会导致色谱柱柱效明显降低，无法恢复。13流动相，流动相中所使用的各种有机溶剂应尽可能使用色谱纯，水最好为超纯水或重蒸水，如 果流动相含盐还应将配制好的流动相经0.45um或0.22u m的滤膜过滤。另外，装流动相的容器和 色谱系统的在线过滤器等装置应清洁，否则将影响色谱柱寿命。以硅胶为某质的各种键合相对酸和 碱都很敏感，一般ph使川范围为2. 57. 5,应参阅色谱柱使用说明书，配制好流动相后，必要时 测定ph值，防止ph过酸过碱，以免色谱柱填料不可逆性损坏。1.4流速，色谱柱在使用

3、的过程中，流速的变化，除特殊需要外，应循序渐进，缓慢变化。如c18 硅胶柱每5分钟的变化应不超过0. 2ml/min；凝胶柱每5分钟的变化应不超过0. 05ml/min, as11阴 离子交换柱每5分钟的变化应不超过0. 02ml/mino1.5样品，样品溶液应经0. 45 u m或0.22um的滤膜过滤，或用固定相萃取小柱（spe）对样品溶 液进行预处理；如样品成分复杂，部分组分有可能吸附在色谱柱上，最好使用前置保护柱。在用正 相色谱分析样品时，如无特殊要求，所有的溶剂和样品应严格脱水。1.6根据色谱条件规定，如果色谱柱达不到-定的实验参数，需及时更换。2. 色谱柱的保养2. 1反相色谱柱使

4、川后的保存，如使用缓冲液或含盐溶液作为流动相，每犬实验结束厉，应川10 倍柱体积（对150mm柱长,约15ml）的低浓度的甲醇/乙惰-水溶液（10%20%）冲洗,使色谱柱 内的盐完金溶解脱出，再用较高浓度的甲醇/乙腊-水（50%）冲洗，故后用高浓度的甲醇/乙膳-水 （80%100%）冲洗，使色谱柱中的強吸附物质冲洗出來。长期保存，可以贮存于甲醇或乙膳中。2.2凝胶柱用后的保存，如使用缓冲液或含盐溶液作为流动相，每次实验结朿后，应用至少24倍 柱体积的纯化水冲洗，可保存三天；如长期保存，再用至少24倍柱体积的0. 05%叠氮钠溶液冲洗 后，密封保存，下次使用时，应在平衡流动相z前，应用至少24倍

5、柱体积的纯化水冲洗，然后再 换成流动相，正常使川。2.3离子交换柱用后的保存，如as11阴离子交换柱，在实验结束后，可冇接保存于以0.04%磷酸 二氢钠溶液（用磷酸调节ph值至3.0）为流动性中，至少一个刀；长期保存，在实验结朿后，用水 冲洗色谱柱后，再贮存于含5%甲醇或含0.05%叠氮钠的水中，密封保存。3. h常使用色谱柱的使用与保养3. 1 c18柱是最为常川的色谱柱。根据色谱条件需要，配置流动相，过滤，按照正确的方向，将色谱 柱与高效液相色谱仪相连，开启流速一般为0.5ml/min,检杳色谱柱两端是否有漏液，以每5分钟 的变化应不超过0. 2ml/min的速度，将流速提高到规定值，一般

6、为1.0 ml/min，待平衡0.5lh 后，不迓样，预览一针，观察基线或设计的梯度是否正常，正常后，按实验要求进行实验，实验结 束后,先用低浓度的甲醇/乙月青-水溶液（10%20%）以0. 5ml/min的流速冲洗lh,再用较高浓度 的甲醇/乙膳-水（50%）冲洗冲洗0. 5h,最后用高浓度的甲醇/乙睛-水（80%100%）以1.0ml/min 的流速冲洗lh；以每5分钟的变化应不超过0.2ml/min的速度，将流速降到0. 5ml/min,关闭泵和 柱温箱，待柱温降低室温吋，将柱子卸下，密封保存。3. 2 tskgel g2000swxl凝胶柱主耍是用来检测低分子量肝素钙分子量和干扰素纯度

7、使用。根据色谱 条件需要，制备流动相和纯化水，过滤，按照正确的方向，将色谱柱与高效液相色谱仪相连，开启 流速-般为0. 2ml/min,检杏色谱柱两端是否有漏液，以每5分钟的变化应不超过0. 05ml/min的速 度,将流速提高到规定值,一般为0.51.0 ml/min, 一般先用纯化水以0.5 ml/min的流速冲洗 4h,将柱子中叠氮钠溶液置换t净。再换规定的流动相,按照上述步骤,提高流速,达到规定值后， 待平衡2h后，观察基线是否止常，止常后，按实验耍求进行实验。实验结束后，再纯化水，按照 上述步骤，提高流速，达到0.5 ml/min的流速冲洗4h,将柱子中流动相置换t净；再将纯化水换

8、成0.05%叠氮钠溶液，以0.5 ml/min的流速冲洗4h,将柱子中充满叠氮钠溶液，而后以每5分钟 的变化应不超过0.05n）l/min的速度，将流速降到0.加1/min,关闭泵和柱温箱，待柱温降低室温时， 将柱子卸下，密封保存。3.3as11阴离子交换柱是川来检测肝素钠中的有关物质使川。根据色谱条件掘要，制备流动相和纯 化水，过滤，按照正确的方向，将色谱柱与高效液相色谱仪相连，开启流速一-般为0.05ml/min,检 杳色谱柱两端是否有漏液，以每5分钟的变化应不超过0.02ml/niin的速度，将流速提高到规定值, 一般为0. 22m 1/min, 一般先用纯化水以0.22 ml/min的

9、流速冲洗4h,将柱子中叠氮钠溶液置换干 净。再换规定的流动相，按照上述步骤，提高流速，达到规定值后，待至少平衡4h后，不进样， 预览一针，观察基线或设计的梯度是否正常，正常后，按实验要求进行实验。实验结朿后，可直接 保存于以0.04%磷酸二氢钠溶液（用磷酸调节ph值至3.0）为流动性小，至少一个月；如需长期 保存,先用纯化水,按照上述步骤,提高流速,达到0. 22 ml/min的流速冲洗4h,将柱子中流动相 置换干净；再将纯化水换成0.05%叠氮钠溶液，以0.22 ml/min的流速冲洗4h,将柱子屮纯化水 置换干净，而后以每5分钟的变化应不超过0.02ml/min的速度，将流速降到0.05m

10、l/min,关闭泵 和柱温箱，待柱温降低室温时，将柱子卸卜s密封保存。3.4 superdex peptide凝胶柱主要是用來检测小牛血去蛋白提取物高分子量物质使用。根据色谱 条件需要，制备流动相和纯化水，过滤，按照正确的方向，将色谱柱与高效液相色谱仪相连，开启 流速-般为0. 2ml/min,检查色谱柱两端是否有漏液，以每5分钟的变化应不超过0. 05ml/min的速 度，将流速提高到规定值，一般为0.51.0 ml/min, 一般先用纯化水以0.5 ml/min的流速冲洗7 8h,将柱子中20%乙醇溶液置换干净。再换规定的流动相，按照上述步骤，提高流速，达到规定值 后，待平衡过夜后，观察基线是否止常，止常后，按实验要求进行实验。实验结束后，再用纯化水, 按照上述步骤