(动物传染病学实验课件)4 猪瘟的临床诊断方法与技术（此实验未做）

1、( (动物传染病学实验课件动物传染病学实验课件)4 )4 猪瘟的猪瘟的临床诊断方法与技术（此实验未做）临床诊断方法与技术（此实验未做）一、猪瘟的诊断方法一、猪瘟的诊断方法p 流行病学调查。流行病学调查。p 临诊诊断临诊诊断。p 病理解剖学诊断。病理解剖学诊断。p 实验室诊断。实验室诊断。 病理组织学诊断病理组织学诊断 病原学诊断病原学诊断 血清学诊断血清学诊断1. 流行病学：流行病学：（1）病毒来源。）病毒来源。（2）传播方式。）传播方式。2. 临床症状：临床症状：（1）母猪：流产，产出弱仔、畸胎和死胎。）母猪：流产，产出弱仔、畸胎和死胎。（2）哺乳仔猪：神经震颤、运动障碍、抽搐等。）哺乳仔猪

2、：神经震颤、运动障碍、抽搐等。（3）保育猪及育肥猪：发烧，便秘腹泻交替出现，）保育猪及育肥猪：发烧，便秘腹泻交替出现，腹下、耳及四肢内侧等少毛部位出血，发绀。腹下、耳及四肢内侧等少毛部位出血，发绀。3. 病理解剖学诊断：病理解剖学诊断：（1）脾脏：边缘梗死。）脾脏：边缘梗死。（2）淋巴结：大理石样外观。淋巴结：大理石样外观。（3）肾脏：点状出血，）肾脏：点状出血，“麻雀卵样肾麻雀卵样肾”。（4）浆膜、黏膜、心肺、膀胱：出血。）浆膜、黏膜、心肺、膀胱：出血。（5）回肠末端、盲肠和结肠：钮扣状溃疡。）回肠末端、盲肠和结肠：钮扣状溃疡。4. 实验室诊断：实验室诊断： 病原学诊断方法病原学诊断方法（1

3、）荧光抗体检测方法。）荧光抗体检测方法。（2） RT-PCR。（3）荧光定量）荧光定量PCR。（4）兔体交互免疫试验。兔体交互免疫试验。 血清学诊断方法血清学诊断方法（1）ELISA：阻断阻断ELISA、双抗体夹心双抗体夹心ELISA。（2）间接血凝试验）间接血凝试验。（3）中和试验）中和试验。荧光抗体检测方法（荧光抗体检测方法（FA）1. 猪瘟参考实验室推荐方法。猪瘟参考实验室推荐方法。2. 采用冰冻切片或组织触片作免疫荧光试验。采用冰冻切片或组织触片作免疫荧光试验。3. 需在猪瘟弱毒疫苗免疫需在猪瘟弱毒疫苗免疫38天后采样，如为阳性天后采样，如为阳性才能判断为野毒感染。才能判断为野毒感染。

4、野毒与疫苗毒鉴别野毒与疫苗毒鉴别RT-PCR1. 样品采集：扁桃体、公猪精液、流产胎儿等。样品采集：扁桃体、公猪精液、流产胎儿等。2. 样品保存：样品保存：-20。3. 病毒总病毒总RNA的提取：病料组织研磨，反复冻融的提取：病料组织研磨，反复冻融3次，离心取上清，按试验盒说明书提取次，离心取上清，按试验盒说明书提取RNA，避免避免RNA酶的污染（酶的污染（DEPC，无无RNA酶产品）。酶产品）。4. RNA反转录成反转录成cDNA。5. cDNA的的PCR扩增。扩增。猪瘟病毒抗原检测猪瘟病毒抗原检测ELISA1. 用抗用抗E2糖蛋白单抗建立的双夹心糖蛋白单抗建立的双夹心ELISA。2. 检测

5、样品：检测样品：（1）组织样品：扁桃体、脾脏和肠系膜淋巴结。）组织样品：扁桃体、脾脏和肠系膜淋巴结。（2）白细胞：抗凝血（肝素或）白细胞：抗凝血（肝素或EDTA）分离。分离。3. 按试验盒说明书做按试验盒说明书做ELISA。猪瘟抗体阻断猪瘟抗体阻断ELISA1. 酶标板系用经过免疫亲和技术纯化的重组酶标板系用经过免疫亲和技术纯化的重组E2糖糖蛋白包被。蛋白包被。2. 先加入待检血清，再加入辣根过氧化物酶结合先加入待检血清，再加入辣根过氧化物酶结合的抗的抗E2糖蛋白单抗及底物显色。糖蛋白单抗及底物显色。3. 颜色的颜色的OD值和血清样品中抗值和血清样品中抗E2糖蛋白特异抗体糖蛋白特异抗体的量呈负

6、相关。的量呈负相关。兔体交互免疫试验兔体交互免疫试验1. 试验原理：试验原理：强毒不引起家兔体温反应，但强毒不引起家兔体温反应，但能使其产生免疫力，而兔化弱毒能使家兔产能使其产生免疫力，而兔化弱毒能使家兔产生定型热反应，但对已产生免疫力的家兔则生定型热反应，但对已产生免疫力的家兔则不产生体温反应。不产生体温反应。2. 试验方法：试验方法：2.1 将病猪的病料用抗菌素处理后，接种家兔将病猪的病料用抗菌素处理后，接种家兔并每并每6小时测温一次，连续测小时测温一次，连续测3天，同时设注天，同时设注射生理盐水的对照兔。射生理盐水的对照兔。2.2 7天后对所有家兔静脉注射天后对所有家兔静脉注射HC兔化弱

7、毒，兔化弱毒，同样每同样每6小时测温一次，连续测温小时测温一次，连续测温3天。天。2.3 如试验对照免发生定型热反应，说明试验如试验对照免发生定型热反应，说明试验成立，可以分析判定结果。成立，可以分析判定结果。兔体交互免疫试验兔体交互免疫试验注射病料后注射病料后发热反应发热反应注射弱毒疫苗后注射弱毒疫苗后发热反应发热反应结果判定结果判定无无无无猪瘟强毒猪瘟强毒有有无无有有无无弱毒弱毒有有其它致热源其它致热源兔体交互免疫试验结果判定兔体交互免疫试验结果判定二、猪瘟的免疫预防（推荐）二、猪瘟的免疫预防（推荐）1. 种猪：种猪：（1）种公猪：春秋）种公猪：春秋2次。次。（2）种母猪：春秋）种母猪：春

8、秋2次；或每年次；或每年3次；或产前次；或产前2530天免疫；或产后天免疫；或产后2530天免疫天免疫。2. 后备种猪：后备种猪： 选留后，选留后，8月龄配种前加强免疫月龄配种前加强免疫1次。次。3. 仔猪：仔猪：（1）2060程序：程序：20日龄一免，日龄一免，60日龄二免。日龄二免。（2）070程序：乳前免疫，程序：乳前免疫，70日龄二免。日龄二免。（3）03570程序：乳前免疫，程序：乳前免疫，35日龄二免，日龄二免，70日龄三免。日龄三免。4. 发病猪场的免疫：发病猪场的免疫：（1）紧急接种。）紧急接种。（2）乳前免疫（超前免疫、零时免疫）。）乳前免疫（超前免疫、零时免疫）。三、猪瘟的

9、净化三、猪瘟的净化p三个阶段：三个阶段：（1）猪瘟带毒调查阶段。）猪瘟带毒调查阶段。（2）猪瘟稳定控制阶段）猪瘟稳定控制阶段。（3）猪瘟全群净化阶段）猪瘟全群净化阶段。（一）猪瘟带毒调查阶段（一）猪瘟带毒调查阶段1. 根据病猪临床症状和病理变化，初步评估猪群根据病猪临床症状和病理变化，初步评估猪群野毒带毒状况。野毒带毒状况。2. 根据猪群根据猪群10%抽检的猪瘟抗体监测结果，了解抽检的猪瘟抗体监测结果，了解抗体合格率，抗体整齐度、离散度情况。抗体合格率，抗体整齐度、离散度情况。3. 抗体合格率低于抗体合格率低于90%，则进行全群检测，对抗，则进行全群检测，对抗体不合格的猪只，补免猪瘟疫苗体不合

10、格的猪只，补免猪瘟疫苗6周后，第二次周后，第二次检测，抗体不合格的直接进行淘汰处理。检测，抗体不合格的直接进行淘汰处理。（二）猪瘟稳定控制阶段（二）猪瘟稳定控制阶段1. 母猪群抗体合格率在母猪群抗体合格率在90%以上。以上。2. 后备猪入群前进行猪瘟抗体的检测，不合格者后备猪入群前进行猪瘟抗体的检测，不合格者补免一次，不合格不得留种。补免一次，不合格不得留种。3. 种猪群（母猪）种猪群（母猪）10%的比例进行扁桃体采样，的比例进行扁桃体采样，种公猪全群采样，分析猪瘟病毒带毒情况，野种公猪全群采样，分析猪瘟病毒带毒情况，野毒感染猪直接淘汰。毒感染猪直接淘汰。 （三）猪瘟全群净化阶段（三）猪瘟全群

11、净化阶段1. 对实施净化的种猪群逐头采取扁桃体，进行猪对实施净化的种猪群逐头采取扁桃体，进行猪瘟检测，淘汰野毒感染猪。瘟检测，淘汰野毒感染猪。 2. 后备种猪采取扁桃体样本，进行逐头检测，阴后备种猪采取扁桃体样本，进行逐头检测，阴性者方能留作种用。性者方能留作种用。3. 初步净化初步净化1年后，在育肥猪群中设立不免疫的育年后，在育肥猪群中设立不免疫的育肥哨兵猪。肥哨兵猪。 猪瘟的间接血凝试验猪瘟的间接血凝试验一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理三、主要器材三、主要器材四、方法和步骤四、方法和步骤五、结果判定与分析五、结果判定与分析六、思考题六、思考题一、实验目的一、实验目的1. 掌

12、握猪瘟病毒间接血凝试验的原理、操作方掌握猪瘟病毒间接血凝试验的原理、操作方法和结果判定方法。法和结果判定方法。2. 了解猪瘟的常用诊断方法和技术。了解猪瘟的常用诊断方法和技术。二、实验原理二、实验原理 1. 将可溶性抗原（猪瘟病毒）吸附于与免疫将可溶性抗原（猪瘟病毒）吸附于与免疫无关的红细胞表面，制成诊断试剂。无关的红细胞表面，制成诊断试剂。 2. 致敏的红细胞与相应抗体相遇时，就会发致敏的红细胞与相应抗体相遇时，就会发生特异性结合，经过一定时间的相互作用就生特异性结合，经过一定时间的相互作用就会出现肉眼可见的红细胞凝集现象。会出现肉眼可见的红细胞凝集现象。间接血凝试验原理示意图间接血凝试验原

13、理示意图抗原致敏的方法抗原致敏的方法1. 致敏：致敏：将抗原（或抗体）结合或吸附于红将抗原（或抗体）结合或吸附于红细胞表面。细胞表面。2. 方法：方法： 2.1 制备红细胞悬液：健康公绵羊血。制备红细胞悬液：健康公绵羊血。 2.2 红细胞醛化：戊二醛。红细胞醛化：戊二醛。 2.3 鞣酸化：鞣酸（单宁酸）。鞣酸化：鞣酸（单宁酸）。 2.4 致敏。致敏。三、主要器材三、主要器材1. 血凝板（血凝板（2人人/块）块）2. 猪瘟病毒阳性血清猪瘟病毒阳性血清3. 猪瘟病毒阴性血清猪瘟病毒阴性血清4. 被检血清被检血清5. 醛化红细胞悬液醛化红细胞悬液6. 稀释液稀释液7. 移液器移液器8. 枪头枪头四、

14、间接血凝试验操作方法四、间接血凝试验操作方法孔号孔号12389101112稀释倍数稀释倍数248256512阳性阳性对照对照阴性阴性对照对照红细胞红细胞对照对照稀释液稀释液5050505050弃弃5050血清血清50505050505050红细胞红细胞5050505050505050结果结果 五、结果判定标准五、结果判定标准1. ：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即即100%凝集。凝集。2. ：红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整：红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整齐而稍向孔底集中，即齐而稍向孔底集中，即75%凝集。凝集。3. ：红细胞形成一个环状，四周有小凝集：红细胞形成一个环状，四周有小凝集块，即块，即50%凝集。凝集。4. ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即滑，四周稍有凝集块，即25%凝集。凝集。5. ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集。齐，即无凝集。不同程度凝集强度示意图