研究生实验课件2011年12月15日修改

1、植物总蛋白提取及检测方法实验一 植物蛋白提取三氯醋酸-丙酮沉淀法 取1-2克材料于液氮充分研磨，加入10mL预冷的含10%三氯乙酸（TCA）、0.07%-巯基乙醇（可用DTT代替）的丙酮，充分混合后-20下冰浴过夜，然后离心（4，40000×g，1h），弃上清。在沉淀中加入10mL预冷的含0.07%DTT的丙酮，充分混合，-20下放置1h，离心（4，40000×g，1h），重复该步骤2-3遍。沉淀冷冻干燥蛋白然后分装放入-80备用。取取纯化后的晶体蛋白4.0mg，加入400µl裂解液（1mg蛋白：100µl裂解液）振荡器上振荡溶解，然后13200rpm离

2、心15min除杂质，取上清分装，每管70µl，-80保存。按20L/mg的比例加入蛋白裂解液（9mol/L尿素，4%CHAPS，1%IPG缓冲液，1%DTT，35 mmol/ L Tris），30水浴1 h，并不时振荡，12 000×g 下离心10min。上清液中加入4倍体积的预冷丙酮，于- 20下放置至少2 h，4 000 ×g 下离心10min，沉淀用水化缓冲液（8 mol/L尿素，2% CHAPS，20mmol/ L DTT，0. 5%IPG缓冲液）溶解，重复该步骤1 2 遍。样品溶液存于-75 下或直接用于电泳。用Bradford法在波长595nm定量蛋白

3、。试剂：1、提取液：含10%TCA和0.07%-巯基乙醇的丙酮。2、裂解液：2.7g尿素0.2g CHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），IPGbuffer100µl（35mmol/L tris100µl）使用前再加入1M的DTT 65µl/ml（约50mg，现用现加）。3、液氮。实验二 紫外吸收法检测提取蛋白的浓度一 实验目的 通过蛋白提取方法熟悉掌握使用酶标仪、紫外可见分光光度计分析检测（或扫描）提取蛋白的浓度二 实验原理由于蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有紫外吸收的性质，其最大吸收峰在280nm波长处。在此波长时，

4、蛋白质溶液的吸光度（A280）与其含量成正比关系，可用作定量测定。由于核酸在280nm波长也有光吸收，对蛋白的测定有干扰，但核酸的最大吸收峰在260nm处。可同时测定280nm和260nm波长的光吸收，通过经验公式计算可消除其对蛋白质测定的影响。酶标仪其核心是一个比色计或分光光度计，一般要求测试液的最终体积在250µl以下。其基本工作原理与结构和紫外可见分光光度计几乎完全相同。酶标仪是以微孔板为比色容器的比色计，入射光通过板孔底部进入比色液体，利用板的移动更换比色对象。紫外可见分光光度计测定样品容量大。三 实验方法、步骤取1mg BSA用1ml超纯水溶解，测定BSA标准曲线及样品蛋白

5、含量。取 7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0µl，5µl，10µl，15µl，20µl 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 µl的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的纯水（总体积为100µl），然后，各管中分别加入5ml的Bradford液，摇匀，置室温5min后测定吸光值，在595nm下按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品 OD值。以标准蛋白浓度为x轴，OD值为y轴作标准曲线。1234567BSA蛋白质标准溶液（µl）0510152022H20（µl）1009590

6、85809898蛋白质浓度（mg/ml）00.050.10.150.2A595OD值实验三 提取蛋白的脱盐纯化处理一 实验目的了解蛋白质纯化的方法，熟悉掌握蛋白脱盐处理的纯化方法二 实验原理分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分离、细分离三步。（一）前处理分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。为此，动物材料应先提出结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免手单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用电动捣碎

7、机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。组织和细胞破碎后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等，则可利用差速离心的方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。

8、（二）粗分级分离当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般用分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。有些蛋白提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。（三）细分级分离样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。

9、结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的，但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白，因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。（四）蛋白质分离纯化的方法1 根据分子大小不同的纯化方法（1）透析和超过滤（2）密度梯度离心（3）凝胶过滤2 利用溶解度差别的纯化方法（1）、等电点沉淀和pH控制（2）蛋白质的盐析和盐溶（3）有机溶剂分级分离法（4）温度对蛋白质浓度的影响3 根据电荷不同的纯化方法（1）电泳（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳（

10、3）毛细管电泳（4）等电聚焦（5）层析聚焦（6）离子交换层析4 利用选择性吸附的纯化方法（1）羟磷石灰层析（2）疏水作用层析5 利用配体的特异生物学亲和力的纯化方法亲和层析（affinity chromatography）a.凝集素亲和层析b.免疫亲和层析c.金属螯合层析d.染料配体层析e.共价层析三 实验步骤（具体操作结合仪器讲）AKATA 制备型液相色谱蛋白分析仪纯化蛋白步骤首先将提取蛋白溶液抽滤，超声波（主要是去除溶液中的气泡）；检查AKATA纯化系统 Ph探头，接Ph计，接脱盐柱（也可系统平衡后接，看说明书柱子流速、柱压）开机（仪器自检），点开Unicorn ，选 default，ok

11、；clear all （即出现流程图界面）；首先将20%乙醇换为超纯水（缓冲液）；Mannul，点任意选项，出现操作对话框，平衡系统；Pump-flow=1.0，execute，（注意：必须先设定流速，使其形成通路；即有流速时再作其他操作）。此时观察柱压，柱压切记0.3Mpa；如果柱压高，则要更长时间洗。柱压基本稳定时，洗泵：pump-pumpwashpurifier-A1 ONB1 ON execute；这项仪器自动完成；完成后自动恢复为上一步的状态；此时还应该注意柱压。注意中间有多次平衡状态出现：一种状态进入另一种状态时，一般要平稳3个柱体积；此时可以洗上样环；待平衡时换液：pause，A

12、1-A液B1-B液，continue，然后达到平衡态；洗泵：pump-pumpwashpurifier-A1 ON B1 ON execute；此时A泵走A液，B泵走B液 此时可以安装脱盐柱；待稳定下来准备上样：将流速降下来，flow=0.5 ，先是load（默认）状态下，将蛋白溶液用注射器打入上样环（上样环是1ml的，所以一般最多上样1 ml，否则浪费）；然后为inject状态，execute，待走出2.5 柱体积时重新改为load状态，平衡几个柱体积；如果中间需上样多次，load，execute；pause；加样后，continue；Inject，execute；同样图上显示2 ml 时改

13、状态为load；此时出现蛋白峰，在峰上时接收；平衡后，洗脱。准备接收纯化出的蛋白，流速flow=1.0，gradient；100%B8 min；execucte;待B%20% 时，设定 pump-outletvalve-feed，executefrac峰收集，0.5 ml，execute；首先出现的是杂蛋白的峰，也可以接收。一般第二个峰是目的蛋白。不再接收时，Frac=0，execute；pump-outletvalve-wasteF1曲线直到平行，然后再走几个柱体积；B液已达100%，停止走B液：gradient=0 （即0%B）；time=0 min ;这时走A液，冲洗整个体系；之后，pa

14、use，将A，B液换为20%乙醇continue，洗系统；洗泵，步骤同上；洗feed 系统；之后feed 改为 wasteF1；取下脱盐柱；洗上样环；此时也会有柱压过高的问题，可能是20%乙醇内有气泡造成的。洗好后，end关闭所有窗口，关机。实验结束后，必须将系统清洗后，才能关机。四 试剂 1 20%酒精 2 样品：离心过滤，10000×g以上，15min3 PBS缓冲液实验四 双向电泳分离植物提取蛋白一 实验目的掌握双向电泳分离蛋白技术，熟悉仪器的操作使用二 实验原理双向电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE），第一向电泳等电聚焦是基于等电点

15、不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。双向电泳后，进行凝胶染色，扫描图像，利用ImageMaster 2D Platinum 6.0软件对2-DE图谱分析、比较。三 实验步骤（一）样品制备1 提取蛋白的溶解取纯化后的晶体蛋白4.0mg，加入400µl裂解液（1mg蛋白：100µl裂解液）振荡器上振荡溶解，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70µl，-80保存。2 Bradford法标准蛋白浓度建立测蛋白含量（见前）（二） 双向电泳第一向-

16、IEF（双向电泳中一律使用超纯水）1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700µl水化液储液溶解后，加入8µl 0.05 的溴酚兰，3.5µl（0.5v/v）IPG buffer（pH 3-10）振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。在含300µg 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340µl，振荡器上振荡混合，13200rpm离心15min除杂质，取上清。 IPG胶条所需水化液体积胶条长度（cm）每条需水化体积（µl）7125112001325018350244502 点样，上胶 分两次吸取

17、样品，每次100µl，（11cm胶条，样品制备液60µl，水化液140µl）按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels（11cm，pH 3-10）胶条，从正极到负极将胶条压入槽中，胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加覆盖油108ml，两个上样槽必须与底线齐平。3 IPGphor聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20） 方式一： S1（30v，12hr，360vhs，step） 50v

18、，5h，250vh S2（500v，1hr，500vhs，step） 100v，5h，500vh S3（1000v，1hr，1000vhs，step） 2000v，0.5h，1000vh S4（8000v，0.5hr， 2250vhs，Grad） 8000v，0.5h，4000vh S5（8000v，5hr，40000vhs，step） 8000v，5h，40000vh共计44110vhs， 19.5小时，其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦。方式二：温度20°C最大电流0.05 mA per IPG strip样品体积350 l （180 mm 长

19、IPG strip）电压 时间30 V10-12 hours（水化）200 V1 hour500 V1 hour500 -> 8000 V30 min8000 V3 hours（IPG 4-7）；2 hours （IPG 4-9， 3-10L， 3-10NL）共计20000vh，19h左右方式三：4 平衡使用前每10ml平衡缓冲液中加入100mg DTT （相当于平衡缓冲液I），根据下表加入适量平衡缓冲液I和溴酚蓝溶液。取出IPG胶条分别放入玻璃管中（支持膜贴着管壁，每个玻璃管中放入一条IPG胶条），用Parafilm封口，在振荡仪上振荡15分钟，倒掉平衡缓冲液 I。 每10ml平衡缓冲

20、液加入400mg碘乙酰胺 （相当于平衡缓冲液II）。根据下表加入适量平衡缓冲液II和溴酚蓝溶液。用Parafilm封口，在振荡仪上振荡15分钟，倒掉平衡缓冲液 II。IPG胶条平衡液用量胶条长度（cm）建议平衡液体积（ml）/条溴酚蓝溶液（l）7 2.5-512.5-25 115-1025-50 13 5-1025-5018 105024 1570用镊子夹出胶条，超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡的试

21、管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚蓝作为标记），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。注：平衡时要注意保持胶面始终向上，不能接触平衡管壁。（三）双向电泳第二向-SDS-PAGE 1 配胶根据第一向IEF电泳时IPG胶条的大小选择第二向合适的垂直电泳槽。Ettan DALT II 为大规模、高通量、高重复性双向电泳第二向SDS-PAGE专门设计的垂直电泳槽。 同时进行12块26 x 20cm板胶电泳，适于长至24cm IPG胶条。其灌胶模具每次最多可灌制14块胶。通常不需要浓缩胶。12.5%Gel，40ml丙烯酰胺16.7ml1.5M Tris-Cl pH8.810ml10%SDS（十二

22、烷基磺酸钠）400lAPS220lTEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）11l加水至40ml凝胶浓度与其对应的分离范围胶浓度分离范围（KD）5% 36-2007.5%24-20010% 14-20012.5% 14-10015% 14-60灌制垂直SDS胶的配方10%T，2.6%C12.5%T，2.6%C15%T，2.6%C丙烯酰胺单体贮存液 33.3ml 41.7ml50ml4×分离胶缓冲液25ml25ml25ml10%SDS1ml1ml1ml去离子水40.2ml31.8ml23.5mlTEMED*33l33 l33 l过硫酸铵*（10%）500 l500

23、l500 l最终体积100ml 100ml100ml*TEMED和过硫酸铵在灌胶前再加 2 灌胶将玻璃板洗净后，室温晾干，然后，将电泳槽平衡好，玻璃板夹好，再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶，倒入饱和的正丁醇（或乙醇）压胶，凝胶后（这时会出现三条线），用注射器吸去正丁醇，超纯水洗两次，再用滤纸除水。 3 转移用去离子水润洗IPG胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。将IPG胶条放在位于玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持膜贴着其中的一块玻璃板，用一薄尺将IPG胶条轻轻地向下推，使整个IPG胶条下部边缘与SDS板胶的上表面充分结合。确保在IPG胶条与板胶之间以及玻璃板与塑料

24、支持膜间无气泡产生，上面覆盖预热的0.5%琼脂糖溶液2ml，使琼脂糖在5分钟内凝固封胶。可选操作：加入分子量标准蛋白。平衡第二次时，在沸水中煮Marker（与等体积的1%琼脂糖溶液混合），剪两个同样大小的滤纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的Marker，转入SDS-PAGE胶面上，保持紧密贴合。4 跑胶电泳槽中装满电泳缓冲液，并打开温控系统，调节温度为15。 设定恒定电压或电流，Phase1：1W，1h、Phase2：10W，5h，跑电泳，共计6h。当溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳。跑好的胶转移到染色盒里固定，准备染色。SE600系统电泳参数，Constant curre

25、nt，15PhaseCurrentDuration110mA per gel15 min220mA per gelApproximately 5 hEttan Dalt II系统电泳参数，Constant power，20Phase CurrentDuration15w per gel45 min220w per gelApproximately 6 h共5-6个小时5 银染（两根胶条所用剂量）（银染特别注意用超纯水）（1） 固定30min 无水乙醇200ml乙酸50ml，用超纯水定容至500ml。（2） 敏化30min 无水乙醇 150ml Na2S2O35H2O 1.5688g （无水：1

26、g） 无水乙酸钠 34g （3H2O：56.4g） 戊二醛 0.65ml （现用现加） 先用水溶解Na2S2O35H2O和乙酸钠，再加乙醇，最后定容至500ml。（3） 洗涤 5min × 3次。（4） 银染 20min AgNO3 1.25g 用超纯水定容至500ml。（5） 洗涤 1min × 2次（6） 显影 无水Na2CO3 12.5g 用超纯水定容至500ml 37甲醛 0.2ml，现用现加。（7） 终止 10min EDTA-Na22H2O 7.3g 用超纯水定容至500ml。（8） 洗涤 5min × 3次。注：整个双向电泳实验中全部使用超纯水，尽量

27、减少离子的影响。（四）扫描电泳图谱，用ImageMaster 2D Platinum 6.0软件分析提取蛋白点结合仪器讲解（五）实验相关试剂配制1 Bradford 工作液考马斯亮蓝G-250 10mg，溶于95%的乙醇5ml，加85%的磷酸10ml，蒸馏水加至20ml，过滤后置4保存，可用6个月。临用前，用纯水作10倍稀释。2 裂解液（见前）3.水化液储液（不含有IPG buffer，DTT，2.5ml）Final concentration AmountUrea（FW 60.06）8M1.2gCHAPS 2%（w/v）0.05g Bromophenol blue 0.002%（w/v）5l

28、Double distilled H2O To 2.5ml分装贮存于-20。DTT和IPG buffer在用之前加入：每2.5ml 水化液加7mg DTT。如果胶内上样，则样品液在用之前加入到2.5ml的水化液中。如果需要，尿素的浓度可以调高到9或者9.8M。4 溴酚蓝储液Final concentrationAmountBromophenol blue 1%100mgTris-base 50mM60mgDouble distilled H2O To 10ml5 平衡缓冲液（SDS equlibration buffer）（50mM Tris-cl pH8.8，6M Urea，30% glyc

29、erol，2% SDS，bromophenol blue，20ml）Final concentrationAmount1.5M Tris-cl，pH8.8（see solution F）50mM1mlUrea（Fw 60.06）6M7.21gGlycerol（87% v/v）30%（v/v）6.9ml（6.1ml，（99%）SDS（Fw 288.38）2%（w/v）0.4gBromophenol blue0.002%（w/v）4l 1% solutionDouble distilled H2OTo 20ml贮存于-20，这是一个贮存液，用之前在加DTT或者碘乙酰胺6 丙烯酰胺单体贮存液（30%

30、，Monomer stock solution，100ml）Final concentrationAmountAcrylamide（Fw 71.08）30%30.0gBis-acrylamide（N,N'-methylenebisacrylamide）（Fw 154.17）0.8%0.8gDouble distilled H2OTo 100ml0.45µm的滤纸过滤后储存于4避光保存备用。7 4×分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl， pH8.8，100ml）Final concentrationAmountTris-base（Fw 121.1）1.5M18.2

31、Double distilled H2O80mlHCl（Fw 36.46）Adjust to pH8.8Double distilled H2OTo 100ml用0.45微米的滤纸过滤，4可保存两周。 8 10% SDS溶液（10ml）Final concentrationAmountSDS（Fw 288.38）10%（v/v）1.0gDouble distilled H2OTo 10 ml用0.45微米的滤纸过滤，室温保存9 10%（w/v）过硫酸铵溶液（1ml）0.1g过硫酸铵溶于1ml去离子水中。此溶液需使用前新鲜配制。新鲜的过硫酸铵会发出“咔嚓”声音。如果没有声音，则需要换新的药品。1

32、0 电溶缓冲液（SDS electophoresis buffer，25mM Tris，192 mM glycine，0.1%SDS，5 liters) Final concentrationAmountTris base（Fw 121.1）25 mM15.1gGlycine （Fw 75.07）192mM72.1gSDS（Fw 288.38）0.1%（w/v）5.0gDouble distilled H2OTo 5000ml超纯水定容5000ml，室温保存。11 0.5琼脂糖封胶液（Agrose sealing solution，10ml）Final concentrationAmountS

33、DS electophoresis buffer10mlAgrose （NA or M）0.5%50mgBromophenol blue0.002%（w/v）20l加热溶解，不要超过60。附：双向电泳简易实验步骤：（一）第一向等电聚焦1. 从冰箱中取-20冷冻保存的水化上样缓冲液（不含DTT、IPG buffer）一小管（1ml/管），置室温溶解。2. 在小管中加入0.01g DTT、 IPG buffer，各2.5ml，充分混匀。3. 从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。4. 从冰箱中取-20冷冻保存的IPG预制胶条（11cm pH 3-10），室温中放置10

34、分钟。5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。7. 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。8. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。10.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20冰箱保存。（二）第二向SDS-PAGE电泳1.配制10%的丙烯酰胺