蛋白质分离纯化与质谱鉴定（ProteinIdentification）

1、蛋白质分离纯化与质谱鉴定(protein purification and identification )文章导读单一蛋白质样品的分离、纯化？单一蛋白质的质谱鉴定？蛋白质混合物质谱鉴定方法？对于单一蛋0的常用鉴定方法，大家背定立马想到免疫印迹法(western blot)。western blot是通过抗体和目标分子的特异性结合从而对r标蛋白进 行鉴定，但是这种方法是适用于对已知蛋白进行鉴定，并且必须借助抗体，所 以不适用于对未知或者没有相应抗体的蛋白进行分析。那么小伙伴们可能要问 了，如果自己要研宄的蛋白质是未知的或者目前没有可用抗体怎么办呢？在这 种情况下，就可以借助质谱鉴定技术来对蛋白

2、质进行鉴定了。在这期中小编就 给人家整理了蛋白质鉴定的相关知识，希望对于蛋白质鉴定一直有困惑的同学 能有帮助。一、单一蛋白质分离纯化提到单一蛋0样品，顾名思义在这类蛋0样品应该已经经过了一定的蛋0纯化 步骤，获得了相对单一的蛋白。通常通过细胞裂解或者体外合成的蛋白质都包 含其他的杂蛋白，因此需耍将目的蛋白与杂蛋白区分开，常用的蛋白分离纯化 方法便是电泳分离。一维电泳分离利用蛋白质大小不同的特性，能够很好的将 不同分子量的蛋白进行区分，另外，再次基础之上二维电泳能够进一步将不同 带点量的蛋白分子进行区分。1.维电泳0前普遍采用的一维电泳为垂直板聚乙烯酰胺凝胶电泳(sds-page胶)，其原 理是

3、不同浓度的乙烯酰胺在聚合后会产生具冇一定孔径大小的凝胶，接着在缓 冲液屮加入sds表面活性剂屮和蛋0质表面的电荷，当变性的蛋0质混合样品 通过凝胶空隙的时候，不同分子量大小的蛋白质在凝胶中迁移的速度不同因而 被分离开来。一维电泳能够分离对大多数蛋白和蛋白质复合物进行初步分离。图1.蛋白质一维电泳分离2.二维电泳二维电泳，也称为双向电泳，是在一维电泳的基础上加入了横向的等电聚焦分 离，而其纵向的分离与一维sds分离方法完全一样。二维电泳首先利用蛋白等 电点不同的特性，对蛋白进行初步分离，接着再根据蛋白质分子量不同，再进 一步对等电点相同或相近的蛋白质进行二维分离，进一步提升蛋a质分离效率。 二维

4、电泳的蛋白分辨率相比一维电泳已经大幅度提升，经过二维电泳分离后大 部分蛋白质都能够被分离为含有单一的蛋白质蛋白胶点。蛋白一维等电聚焦分离蛋白二搛电泳分«:多數懂白餃点为h雞一m蛋白廉i图2.蛋白质二维电泳分离二、单一蛋白质鉴定目前对纯度较高，或单一蛋白质的鉴定的方法有蛋白质指纹谱鉴定（pmf）和 ms/ms串联质谱鉴定法。这两种方法都是先将蛋白质酶切成多肱片段，再利用 质谱仪对肽段分析，达到对蛋白质鉴定的目的。而两种方法的不同之处就在于 pmf法只使用一级质谱对蛋白肽段进行检测，而ms/ms不仅经过一级质谱检测, 并且在此基础上选取特定肽段进行肽段破碎，对肽段的序列进行测定。因此 m

5、s/ms比pmf的鉴定准确度更高，与数据库比对的可靠性更高，但分析起来的 也更为复杂。1.蛋白质指纹谱鉴定（pmf）由于蛋白质序列的不同，因此不同的蛋白质在同一种消化酶的作用下酶切产生 的多肽片段大小质量是特异的。蛋白质指纹谱鉴定法正是利用了每种蛋白酶切 产生的太片段不同的特性，对纯化的蛋白质进行酶切处理，再对酶切产生的肽 片段的质量进行分析，即可获得蛋白质的肽质量谱图。再将肽谱图与数据库中 蛋白质理论肽谱图进行比对，进而可获知蛋白质的身份信息。2. ms/ms串联质谱法串联质谱(ms/ms)检测蛋白的原理是先使用一级质谱检测肽段的质量信息，再 选取峰值高的肽段进行破碎，分析获得二级质谱。用检

6、索软件选择相应的数据 库对质谱数据进行分析，同吋以打分的形式评判鉴定结果，当打分人于某个阈 值时，即判定质谱鉴定成功，反之则鉴定失败。三、蛋白混合物鉴定虽然目前有多种蛋白质分离纯化的方法，但在很多吋候分离效率不够高，导致 分离后的蛋白可能还是含有多个蛋白。另外，对于丰度较低的蛋白质可能在分 离过程中造成进一步损失而无法被鉴定到，因此需要直接对这一类蛋0质不经 过分离处理直接进行分析。目前适用于对混合蛋白进行分析的方法有lc-ms/ms 色谱质谱串联分析法。与pmf法和ms/ms法相比，lc-ms/ms在质谱分析前加了 液相色谱的分离，使得蛋白分析精度更高，对肽段序列测定几乎可以的达到 100%的准确度。因此，与单个蛋白质