柴胡茎叶总黄酮正交提取工艺的研究

1、柴胡茎叶总黄酮正交提取工艺的研究北柴胡（bupleurum chine ns edc.）为伞形科柴胡属植物，收载于中国药典，为药用柴胡的 主要种源。柴胡具有驱散退热、舒肝生阳之功效，主治感冒发热、寒热往来、疟疾、胸肋胀 痛、月经不调及子宫脱垂等症。现代药理研究证明柴胡具有解热、镇痛、镇静、抗炎、免疫 增强、保肝利胆、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等作用，具有极高的药用研究价值，黄酮类化合物在 自然界分布广泛,具有抗氧化、抑菌消炎和抗衰老等功效。柴胡总黄酮具有较強的抗流感病 毒作用，而且具有较好的抗炎、降温效果，对多种细胞有较强的抑制或杀灭作用。本文利用不 同浓度的乙醇提取，通过正交试验确定北柴胡茎中总黄

2、酮的最佳提取工艺条件，为更有效的 开发和利用柴胡资源提供理论参考和实验指导。1材料与仪器1. 1材料本品为伞形科植物柴胡（bupleurum chinense dc.）或狭叶柴胡（bupleurum scorzoner-i folium wil id.）的干燥根。按性状不同，分别习称“北柴胡”及“南柴胡”。 1. 2试剂芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）；无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠和硝酸铝均为 分析纯。1. 3仪器电热恒温水浴锅（h -h -s21-6c,上海医疗器械五厂）；电子分析天平（fc204,上海精科 实业有限公司）；uv-762紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；旋转蒸发

3、器（上海 亚蓉生化仪器厂）；snz-d（in）循环水式真空泵，索式提取器，电热鼓风干燥箱；植物粉碎机 （fz102,天津市泰斯特仪器有限公司）2方法2. 1柴胡茎叶总黄酮的薄层检测硅胶薄板制作称取4g硅胶g置于研钵中，加入0.5%的竣甲基纤维素钠溶液12ml,研磨 15min后铺于20x 10cm的干净玻璃平板上，要求平整无气泡，然后晾干即可。 展开剂配制取展开剂氯仿:甲醇：水=7: 2. 5: 0.5的比例配制100ml （ 70: 25: 5 ）,取下层液作为展开剂。薄板活化：将制好的硅胶薄板在105°c下活化30mino点样：点样点距板子底端1. 5cm左右，所有点样点位于同一

4、直线上，尽可能向中 间靠拢，每个点样点点样约20m u点样点尽可能小。饱和：将板子不没入层析缸内的展层剂中，在展层剂的蒸气中饱和约0.5h。层析：将板子下端插入展层剂中进行展开，当展层剂前沿距板子上端约l5cm 时取出板子，自然晾干。观察：紫外灯(365nm)下观察，rf:,层析图谱如下。展开取出晾干后在紫外灯(365nm)下观察，可见荧光、黄绿色荧光等4 6个斑点，主要 为柴胡茎叶总黄酮各种戒及戒元，各斑点rf在05以上分布。2.2紫外分光光度法测定柴胡茎叶总黄酮的含量2. 2. 1标准液的配制：精密称取120°c干燥恒重的芦丁标准品10 mg,置50 ml容量 瓶中，用60%乙醇

5、溶解并定容得到浓度为0.2 nig/ml的芦丁标准溶液。2.2.2标准曲线的绘制:精密量取标准溶液各0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5. 0 ml置于25 ml容量瓶中，分别加60%乙醇溶液至10 ml,再依次加入ln)l 5%亚硝酸 钠溶液，摇匀，放置6min后加入1 ml 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6 min后加入4% 氢氧化钠溶液1 ml,再加60%乙醇定容，摇匀，放置15min后在510 nm处测定吸光 度值。以吸光度值为纵坐标，芦丁浓度(mg/nil)为横坐标，制作标准曲线。得到回 归方程 y=16 4125x-0 0105, r2=0 - 9998。2.2. 3样品溶

6、液的制备和黄酮含量的测定：准确称取阴干粉碎的北柴胡茎叶20 g, 按单因素实验和正交试验中不同的提取条件利用索氏提取器回流提取。提取液减 压浓缩成膏状，用50 ml温水充分溶解置于250ml分液漏斗，用等体积石油瞇萃取 3次以除去色素和部分脂溶性成分。水相合并后减压浓缩成膏状于60°c真空干燥 箱中干燥至恒重，准确称取干燥粉末20 mg用60%乙醇溶解并定容于10 ml容量 瓶中。依照“2.2.2”项下方法测定吸光度，代入回归方程中计算总黄酮的含量, 并计算总黄酮的得率；总黄酮的得率( )=(提取液中总黄酮浓度x提取液体积)/对应的原料重量x 100%。在此过程中分别考察不同乙醇浓度

7、、不同料液比、不同提取时间和温度对总 黄酮提取的影响。然后结合正交试验确定最佳提取工艺。3柴胡茎叶总黄酮提取工艺确定3.1柴胡茎叶提取工艺效果的因素实验3. 1. 1提取溶剂浓度及提取方法的选择提取溶剂的选择主要是根据溶剂的极性及其共存杂质的极性大小来判断。天 然有机化合物在溶剂的溶解应遵循“相似相溶”规律，极性化合物倾向于溶于极 性溶剂，非极性化合物倾向于溶于非极性溶剂。从北柴胡分离得8个黄酮类化合物：柴胡色原酮酸，芦丁，榊皮素，异鼠李素，异鼠李素3-0-葡萄糖戒,葛根素,7,4，二務基异黄酮7-0- p -d-葡萄糖式，色氨 酸。本实验用不同浓度乙醇或甲醇进行热回流、超声提取平行对比实验。

8、分别称取5. 00g柴胡茎叶粉末4份，分别浸于65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、 95%乙醇（料液比为1 ： 15） 4种不同浓度的乙醇溶剂中。85°c热回流提取1次， 2. 0 h,过滤，滤液用水定容至100ml,用紫外分光光度计法测定溶液中柴胡茎叶 总黄酮浓度，计算含量，所得结果见表 。表热回流法不同溶剂浓度对柴胡茎叶总黄酮提取含量的结果比较（n= 3）提取溶剂水55%乙醇75%乙醇95%乙醇柴胡茎叶总黄酮含量（）rsd （%）由表 可以看出，对柴胡茎叶总黄酮提取能力为 >> ，而且醇不会对环境产生影响，经济，来源方便，所以本实验选用作为提取溶剂。另称取5. 00g

9、柴胡茎叶粉末4份，分别浸于55%乙醇、65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇（料液比为1 : 15 ）4种不同浓度的乙醇溶剂中0. 5h,然后超声（20khz） 提取1次，0. 5 h,过滤，滤液分别用各自溶剂定容至100ml,用紫外分光光度 计法测定溶液中柴胡茎叶总黄酮浓度，计算含量，所得结果见表 。表超声法不同溶剂浓度对柴胡茎叶总黄酮提取含量的结果比较（n=3）提取溶剂水 5 5%乙醇7 5%乙醇9 5%乙醇柴胡茎叶总黄酮含量（）rsd (%)由表 可以看出，对柴胡茎叶总黄酮提取能力为 >>，而且醇不会对环境产生影响，经济，来源方便，所以本实验选用作为提取溶剂。表 不同提取方法的比

10、较(n=3)提取溶剂水55%乙醇 75%乙醇 95%乙醇热回流法柴胡茎叶总黄酮含量( )超声法柴胡茎叶总黄酮含量()由表 可以看出，方法 的柴胡茎叶总黄酮含量较其它方式高，也就是用 提取的柴胡茎叶总黄酮含量高，所以本实验采用方式进行提取。3.1.2单因素实验准确称取5. 00 g柴胡茎叶粉末置于烧杯中，加入不同浓度的乙醇、不同的 料液比、不同的提取时间、不同的提取温度进行热回流或超声提取，过滤，滤液 定容至100ml,用紫外分光光度计法测定溶液中柴胡茎叶总黄酮浓度，计算含量。 即在不同条件下提取以确定提取因素变化范围以及各因素的较佳值。通过测定提 取液中柴胡茎叶总黄酮含量，计算总柴胡茎叶总黄酮

11、的提取率，以判断最佳条件。 乙醇浓度对总黄酮得率的影响分别准确称取5. 00 g柴胡茎叶粉末4份，置于烧杯中，用不同的乙醇浓度 80 ml,浸泡0. 5h后热回流提取1次，2. oh,过滤，滤液定容至100ml,用紫外 分光光度计法测定溶液中柴胡茎叶总黄酮浓度，计算含量。结果见表 。表8乙醇浓度对总黄酮得率的影响(n=3)水55%乙醇75%乙醇95%乙醇柴胡茎叶总黄酮含量(%)rsd (%)乙醇浓度对总黄酮得率的影响：如图1所示，结果表明随着乙醇浓度的增加黄酮 得率呈上升趋势。用55% -75%乙醇提取得率较高，75%的得率最高。当乙醇浓度 高于75%时，提取液颜色加深并且总黄酮得率开始下降。

12、这可能是由于提取溶液 极性减少使提取液中脂溶性物质增加，使总黄酮含量相对下降。同时用55%和95% 乙醇提取的总黄酮得率接近，因此75%乙醇提取效果最好。提取时间对总黄酮得率的影响分别准确称取5. 00 g柴胡茎叶粉末4份，置于烧杯中，加入 乙醇80 ml, 浸泡05h后用不同的热回流提取时间提取1次，过滤，滤液定容至100ml,用 紫外分光光度计法测定溶液中柴胡茎叶总黄酮浓度，计算含量。结果见表 。表8 提取时间对总黄酮得率的影响(n=3)1. 0 h1. 5 h2. 0 h2. 5 h柴胡茎叶总黄酮含量(%)rsd (%)提取时间对总黄酮得率的影响：如图2所示。结果表明随着提取时间的增加，

13、总黄 酮收率也随之增加。当提取时间达到2 h以后，总黄酮提取率随时间增加而有所 下降，且提取液颜色显著加深，可能是由于提取时间的增加使杂质溶出量也增加， 同时从总黄酮得率来看，提取时间为1-2 h范围内较为合适。提取温度对提取效果的影响分别准确称取5. 00 g柴胡茎叶粉末4份，置于烧杯中，加入 乙醇80ml 用不同的热回流提取温度提取1次，2. oh,过滤，滤液定容至100ml,用紫外分 光光度计法测定溶液中柴胡茎叶总黄酮浓度，计算含量。结果见表 。表8提取温度对总黄酮得率的影响(n=3)40°c55°c70°c85°c柴胡茎叶总黄酮含量(%)rsd

14、(%)提取温度对总黄酮得率的影响：如图3所示。结果表明提取温度未达到8(tc以前, 总黄酮得率随着温度的升高而增大，温度达到80°c后，总黄酮得率又开始略微下 降。这是因为随着温度升高，分子运动速度加快，渗透和扩散作用增强，使黄酮类 化合物更容易从细胞内向提取溶剂中转移。因此，总黄酮得率随提取温度的升高 而提高。但温度过高，一方面使其中的黄酮类化合物被破坏，杂质的溶出量增加,另一方面乙醇容易挥发，提取的总黄酮含量反而降低。可见，在温度为80°c左右 时，总黄酮提取效果最佳。故选择温度为80°c范围内较为合适。料液比对提取效果的影响分别准确称取5.00 g柴胡茎叶粉

15、末4份，置于烧杯中分别加入不同料液 比 乙醇浸泡0. 5h后热回流提取1次，2. oh,过滤，滤液定容至100ml,用紫 外分光光度计法测定溶液中柴胡茎叶总黄酮浓度，计算含量。结果见表。表11料液比对总黄酮得率的影响(n=3)料液比(m/v)1:61: 121: 181: 24柴胡茎叶总黄酮含量(%)rsd (%)料液比对总黄酮得率的影响：如图4所示。结果表明总黄酮得率随着料液比的增 大而提高，料液比1 : 18以后，得率变化不大，即料液比增加到定程度时，再增大 料液比，总黄酮得率趋于稳定，一定比例的溶剂已将总黄酮完全溶出。因为料液比 较低时，提取过程中溶剂内提取物含量过高，不利于未提取出的总

16、黄酮扩散。当料 液比增大到一定程度，总黄酮得率增力时刘曼，从经济角度考虑,溶剂用量不应太大, 故本实验选择料液比为不高于1 ： 18。由以上各组单因素实验结果，初步得到最佳提取工艺为：75%乙醇，温度80°c, 回流提取2 h,料液比1 : 18,总黄酮得率可达到341%。3. 2正交试验采用l9(34)正交表进行实验设计，结合单因素实验结果进一步考察乙醇浓 度、料液比、提取时间和提取温度对总黄酮含量的影响，以确定最佳工艺条件。热回流醇提正交试验因素表见表4-14。正交实验结果和极差分析见表2。表4-14热回流醇提正交试验因素表155%1. 51885275%2. 01270395%

17、2. 5655正交试验结果正交表l9 ( 34)及结果见表4-15,柴胡茎叶总黄酮得率直观分析结果见表 4-16,柴胡茎叶总黄酮方差分析结果见表4-17.从表4-16直观分析可知，极差最大的为c因素，其次分别为a因素，d因 素，b因素，说明对柴胡茎叶总黄酮得率影响最大的因素为 ，其次分别 为 ，。方差分析结果中：c因素有显著意义(fo. 05<f<f0. 01), a因素有较显著意义(f0. 1<f<fo. 05), b因素和d因素无显著性意义(f<f0. 1)。所以根据 各因素k的变化率得出a因素选水平2, b因素选水平2, c因素选水平2,由于d 在60 mi

18、n , 80 min和loomin无较大差别，参考单因素试验结杲，故选择80min (水平2 ),即 柴胡茎叶 的条件为a2b2c2d2o表4-15正交表l9 ( 34 )及结果序号a (溶剂:)b (时间:)c (料液比)d (温度)得率()111112122231333421235223162312731328321393321举例：实验1准确称取5. 00 g柴胡茎叶粉末，置于烧杯中加入55%乙醇90 ml ,85°c热回流提取1.5,过滤，滤液定容至100ml,用紫外分光光度计法测定溶液 中柴胡茎叶总黄酮浓度，计算含量。结果见表。实验4准确称取5. 00 g柴胡茎叶粉末，置于烧杯中加入75%乙醇60 ml , 55°c热回流提取1.5,过滤，滤液定容至100ml,用紫外分光光度计法测定溶